电针刺激大鼠“肾俞”穴对下丘脑室旁核功能状态的影响
作者:陈泽斌,韩永明,熊迎春,吴昌清,袁尚荣
单位:湖北中医学院解剖教研室,湖北武汉 430061
关键词:肾俞穴;下丘脑室旁核;c-fos
中国中医基础医学杂志991220 摘 要:目的:为探讨PVN与“肾俞”穴针刺效应的关系提供形态学证据。方法:以大鼠为对象,采用免疫细胞化学ABC法,探讨电针刺激大鼠右“肾俞”穴诱导的c-fos在PVN中的表达。结果:PVN中FLN密度值组间、组内差异显著(P<0.01),电针组>对照组>空白组;电针组同侧>对侧。结论:电针刺激右“肾俞”穴,对PVN神经元具有激活作用;PVN神经元对同一方法刺激单侧“肾俞”穴的这种反应上的同、对侧差异,可能是导致“肾俞”穴针刺效应两侧差异的重要环节之一。
中图分类号:R245.9+7 文献标识码:B
, http://www.100md.com
文章编号:1006-3250(1999)12-0064-03
临床和实验研究显示,针刺“肾俞”穴具有影响机体下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴功能,影响肾的泌尿功能等多方面的效应,提示神经体液因素在这一效应中的重要作用[1~3],而作为神经—内分泌系统关键中枢核团之一的下丘脑室旁核(HypothalanicParaventricular nucleus,PVN,下同),对针刺“肾俞”穴反应如何却末见报道。为此,本文采用免疫细胞化学技术,着重观察了电针刺激大鼠右“肾俞”穴诱导的c-fos在PVN中的表达,并对PVN及其各部c-fos阳性神经元(Foslikeimmunoreactive neuron,FLN,下同)密度进行了比较,拟探讨电针大鼠“肾俞”穴对PVN功能状态的影响,并为进一步探讨PVN与“肾俞”穴针刺效应的关系提供形态学依据。
材料与方法
1 材料
, 百拇医药
Wistar大鼠15只,重量220g~250g,雌雄不限。随机分成三组:电针组、对照组;空白组。每组5只。
2 方法
2.1 动物准备
于实验前两周一次性购进,置于避强光、安静和温暖的环境中饲养,室温为18℃~25℃。于实验前4d对准备实验动物集中喂养,并作适用性训练,训练过程中严禁粗暴和惊扰。
2.2 取穴、麻醉和穴位刺激
参照华兴邦的大鼠穴位图谱[4],于第二腰椎棘突下右侧旁开7mm取右“肾俞”穴,直刺8mm。采用甲氧氟烷吸入加1%戊巴以妥钠腹腔注射的复合麻醉方式。电针组:麻醉+电针;对照组:只麻醉,不刺激;空白组:不麻醉,不刺激。电针采用上海产G6805针灸治疗仪,取疏密波,14HZ,强度以局部轻微抖动为度,正极置于穴位外侧5mm,通电10min,留针20min。每次实验各组均取1只同时进行。
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2.3 材料制备
从刺激开始计2h,各动物在戊巴比妥钠深麻下,开胸做经左心窒4℃4%多聚甲醛(PB配制,PH7.4)灌注固定,灌毕即取脑,4℃后固定过夜,入含30%蔗糖的PB内4℃沉底,用恒冷箱冰冻切片机(美国A0产)做连续冠状切片,片厚40um,切片隔一留一分二套,收集于0.01mol/L磷酸缓冲液内(PBS,PH7.4,下同)。
2.4 免疫组织化学反应
取切片一套,进行抗FOS免疫细胞化学ABC法反应。切片依次入下列步骤:0.3%H2O2甲醇溶液室温30min,含0.1%TritonX-100的正常羊血清(1∶50)30min,入兔抗c-fos(SantaCruz,Inc.1:1000)4℃,48h、生物素化羊抗兔IgG(Sigma,1:500)室温3h\,ABC液(Sigma,1:500)室温3h、葡萄糖氧化酶—DAB—硫酸镍胺法呈色。以上各步后均用PBS液充分漂洗3×10min。常规贴片、干燥、透明、封片。
, 百拇医药
2.5 观察、记数和数据处理
记数方法:参照Paxinos(1986)鼠脑定位图谱,以Bregma-1.80mm平面为基准,取该平面片及其前、后邻近片各1张,共3张进行计数。在400倍镜下,采用上海第三光学仪器厂C5型0.5网形目镜尺(实际划刻面积为5×5mm2,400倍镜下划刻面积为156.25um2)进行,记数与任一测点外上角和测线(横线)上缘交叉的FLN(核着色均匀、深染、边界清晰)。每片于PVN各部相应处取二视野,分别计数,取均值即为该片该部的FLN密度值。将三片的相应值累加取均值,依此即得该鼠一侧PVN各部、一侧PVN和双侧PVN的FLN密度值。终值单位为:个/156.25um2。照像时取同一批次的切片进行。
2.6 对照实验
用正常山羊血清(1:50)替代一抗,余同前,以检测上述免疫细胞化学染色的特异性,结果均为阴性。
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实验结果
1 镜下观察
Fos阳性细胞表达呈现在细胞核上,呈深蓝色,胞浆未着色,核为圆形或卵圆形,背景基本无色。
2 FLN在PVN及其各部(双侧)的表达密度及其组间两两比较(见表1)
由表中可以看出,FLN在各组PVN及其各部双侧(指两侧合并的平均密度)的密度存在差异。在F检验(P<0.01)基础上进行的Q检验,显示各组彼此间差异显著(P<0.01)。说明麻醉刺激对PVN神经元具有影响;电针组刺激对PVN神经元的激活作用是在麻醉刺激基础上的进一步加强,且对PVN各部分神经元均具有激活作用。
3 FLN在PVN及其各部(单侧)的分布密度及组内同、对侧比较(见表2)
表1 FLN在PVN及其各部(双侧)的表达密度及组间两两比较单位:个/156.25um2 组 别
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n
PaV
PaMP
PaLM
PaDC
PVN
电针组
5
17.74±1.40
20.84±0.52
13.22±0.36
13.04±0.37
16.21±0.29
, 百拇医药
对照组
5
8.55±0.16
14.13±1.13
6.51±0.30
5.54±0.21
8.71±0.19
空白组
5
2.42±0.84
4.05±0.25
1.59±0.22
, http://www.100md.com
1.88±0.29
2.43±0.30
*
*
*
*
*
注:F检验P<0.01,*组间比较:P<0.01。PaV:室旁核腹侧部,PaMP:室旁核内侧小细胞部,PaLM:室旁核外侧大细胞部,PaDC:室旁核背侧小帽。表2 FLN在PVN及其各部(单侧)的表达密度及组内同、对侧比较
单位:个/156.25um2 组 别
例数
, 百拇医药
侧别
PaV
PaMP
PaLM
PaDC
PVN
电针组
5
同侧
18.39±1.83
21.9 ±0.53*
16.50±0.43*
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13.75±0.50*
17.65±0.31*
对侧
17.08±1.45
19.75±0.57
9.92±0.32
12.33±0.27
14.77±0.29
对照组
5
同侧
8.73±0.54
, 百拇医药
14.25±0.88
6.59±0.42
5.58±0.57
8.79±0.10
对侧
8.58±0.57
14.00±1.47
6.42±0.57
5.50±0.43
8.63±0.41
空白对
5
, 百拇医药
同侧
2.45±0.83
4.25±0.32
1.50±0.43
2.00±0.27
2.50±0.24
对侧
2.59±0.92
3.83±0.43
1.67±0.27
2.00±0.27
2.44±0.37
, 百拇医药
注:*与对侧比较:P<0.01。
由表中可以看出,FLN在各组PVN及其各部的密度值是不一致的。电针组同侧(针刺侧)显著高于对侧(P<0.01),主要表现在同侧PaMP、PaLM和PaDC三部分;对照组和空白组同、对侧各部无差异(P>0.05)。以上说明,电针组刺激激活了PVN双侧各部神经元,但以同侧更为明显,重点表现在同侧PaMP、PaLM和PaDC三部分;麻醉刺激不导致两侧差异。
4 以上各组FLN照片(见附图片1~6)
讨论
1 c-fos癌基因的诱导和显示是一种反映神经通路的新方法,是神经元被激活的标志[5],国内少数学者将这一方法用于针刺研究[6]。本研究在实施过程中,采取多项措施以防止非特异性应急反应的发生,并设立实验对照组和空白对照组,使得能从实验结果中有效分离出非特异性刺激所致的应激反应。结果显示,电针刺激右“肾俞”穴所至PVN中FLN密度值的组间差异,组内同、对侧差异十分显著,甚至在同一侧PVN的不同部分差异也非常明显,因此提示:(1)电针刺激右“肾俞”穴对PVN神经元具有激活作用,PVN参与了“肾俞”穴的针刺效应过程;(2)PVN神经元对同一方法刺激单侧“肾俞”穴的这种反应上的同、对侧差异,可能是导致“肾俞”穴针刺效应两侧差异的重要环节之一。
, 百拇医药
2 关于“肾俞”穴针刺效应机理,国内外已有一些研究报道,虽各自的研究方法和着重点不同,但结果基本一致,即神经—内分泌系统在针刺效应中具有及其重要的作用[1~3]。神经生物研究揭示,PVN是神经体液调节的关键部位之一,它既具有神经内分泌的功能,又参与植物神经的控制,在实现交感—肾上腺髓质和下丘脑—垂体—肾上腺皮质两大系统的整合中起着重要作用。神经电生理学研究显示,电刺激PVN可引起ACTH的分泌,PVN参与调节肾交感神经节前神经元的传出活动[7],参与肾神经传入所引起的升血ACTH效应等[8]。
鉴于本实验研究的结果证明,PVN参与了“肾俞”穴的针刺效应,因而可以设想:“肾俞”穴的针刺信息,在触发以背根节和交感神经节为中心的中枢外反射通路和脊髓低级中枢反射通路的同时,可经背根节和脊髓的两次整合,上行(直接或间接)入PVN,并使其神经元激活,被激活的PVN神经元一方面由其投射到正中隆起的纤维分泌CRF和AVP,引起垂体前叶ACTH和β—EP的分泌,进而影响下丘脑—垂体—肾上腺皮质系统,调节机体内分泌水平;经其室旁核—脊髓路径,通过释放CRF和AVP,影响交感—肾上腺髓质系统,调节机体内脏运动的交感传出;另一方面其大神经分泌细胞分泌的VP,经垂体束到达垂体后叶释放入血,调节机体的水液代谢等。这一设想与现有的关于“肾俞”穴针刺效应的结论基本相符。其具体细节有待进一步研究、证实。
, 百拇医药
3 针灸医学十分注重临证时选穴方法,如《灵枢缪刺》和《灵枢官针》都提到缪刺和巨刺,均有“右取左,左取右”。《素问.阴阳大论》也说“故善用针者……以右治左,以左治右。”本研究以电针刺激右“肾俞”穴,导致了下丘脑室旁核功能状态的同、对侧差异,亦即给予“肾俞”穴的同一刺激对室旁核的影响“左、右”不同。因为双侧下丘脑室旁核不同的兴奋程度,势必会导致其对机体器官功能“左,右”影响的差异。所以,本研究结果,实际上为巨刺、缪刺“右取左,左取右,以左治右,以右治左”的刺穴方法和针刺效应的表达提供了直接的神经形态学证据。
1,2 空白组 100X;3,4 对照组 100X;5,6 电针组 100X
作者简介:陈泽斌(1964—),男,湖北中医学院解剖学教研室讲师,硕士。主要从事背俞穴针刺效应的中枢神经机制的研究,近期的研究重点是“肾俞”穴针刺效应与下丘脑室旁核的关系。
, http://www.100md.com
参考文献
[1] 中村克彦.针治疗の肾生理学的作用への影响.医学のゐヰり,昭和59年,128(1):27-28.
[2] 赵相杰,等.针刺对注入地塞米松的大鼠之中枢5-HT和肾上腺皮质系统的影响.中国针灸,1982,(5):28-30.
[3] 蔡乃真,等.针刺家兔“肾俞”穴利尿利钠作用的研究.上海针灸杂志,1993,12(4):169-171.
[4] 华兴帮.大白鼠穴位图谱的研究.实验动物与动物实验,1991,(1):1-3.
[5] 孙遐,等.c-fos癌基因的诱导和显示.生理科学进展,1991,22(4):299-303.
[6] 周敬修,等.颧FDA3穴针刺和尾部痛刺激后c-fos蛋白在5-HT神经元中的表达.上海医科大学学报,1993,20(1):66-68.
[7] 秦素丽,等.兔室旁核-脊髓经路对血量扩张引起肾交感神经活动抑制的作用.生理学报,1994,46(3):217-225.
[8] 詹昌德,等.室旁核在刺激肾神经传入纤维对血浆皮质醇浓度影响中的作用.生理学报,1993,45(3):305-309.
(收稿日期 1999—05—01 修回日期 1999—08—13), 百拇医药
单位:湖北中医学院解剖教研室,湖北武汉 430061
关键词:肾俞穴;下丘脑室旁核;c-fos
中国中医基础医学杂志991220 摘 要:目的:为探讨PVN与“肾俞”穴针刺效应的关系提供形态学证据。方法:以大鼠为对象,采用免疫细胞化学ABC法,探讨电针刺激大鼠右“肾俞”穴诱导的c-fos在PVN中的表达。结果:PVN中FLN密度值组间、组内差异显著(P<0.01),电针组>对照组>空白组;电针组同侧>对侧。结论:电针刺激右“肾俞”穴,对PVN神经元具有激活作用;PVN神经元对同一方法刺激单侧“肾俞”穴的这种反应上的同、对侧差异,可能是导致“肾俞”穴针刺效应两侧差异的重要环节之一。
中图分类号:R245.9+7 文献标识码:B
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文章编号:1006-3250(1999)12-0064-03
临床和实验研究显示,针刺“肾俞”穴具有影响机体下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴功能,影响肾的泌尿功能等多方面的效应,提示神经体液因素在这一效应中的重要作用[1~3],而作为神经—内分泌系统关键中枢核团之一的下丘脑室旁核(HypothalanicParaventricular nucleus,PVN,下同),对针刺“肾俞”穴反应如何却末见报道。为此,本文采用免疫细胞化学技术,着重观察了电针刺激大鼠右“肾俞”穴诱导的c-fos在PVN中的表达,并对PVN及其各部c-fos阳性神经元(Foslikeimmunoreactive neuron,FLN,下同)密度进行了比较,拟探讨电针大鼠“肾俞”穴对PVN功能状态的影响,并为进一步探讨PVN与“肾俞”穴针刺效应的关系提供形态学依据。
材料与方法
1 材料
, 百拇医药
Wistar大鼠15只,重量220g~250g,雌雄不限。随机分成三组:电针组、对照组;空白组。每组5只。
2 方法
2.1 动物准备
于实验前两周一次性购进,置于避强光、安静和温暖的环境中饲养,室温为18℃~25℃。于实验前4d对准备实验动物集中喂养,并作适用性训练,训练过程中严禁粗暴和惊扰。
2.2 取穴、麻醉和穴位刺激
参照华兴邦的大鼠穴位图谱[4],于第二腰椎棘突下右侧旁开7mm取右“肾俞”穴,直刺8mm。采用甲氧氟烷吸入加1%戊巴以妥钠腹腔注射的复合麻醉方式。电针组:麻醉+电针;对照组:只麻醉,不刺激;空白组:不麻醉,不刺激。电针采用上海产G6805针灸治疗仪,取疏密波,14HZ,强度以局部轻微抖动为度,正极置于穴位外侧5mm,通电10min,留针20min。每次实验各组均取1只同时进行。
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2.3 材料制备
从刺激开始计2h,各动物在戊巴比妥钠深麻下,开胸做经左心窒4℃4%多聚甲醛(PB配制,PH7.4)灌注固定,灌毕即取脑,4℃后固定过夜,入含30%蔗糖的PB内4℃沉底,用恒冷箱冰冻切片机(美国A0产)做连续冠状切片,片厚40um,切片隔一留一分二套,收集于0.01mol/L磷酸缓冲液内(PBS,PH7.4,下同)。
2.4 免疫组织化学反应
取切片一套,进行抗FOS免疫细胞化学ABC法反应。切片依次入下列步骤:0.3%H2O2甲醇溶液室温30min,含0.1%TritonX-100的正常羊血清(1∶50)30min,入兔抗c-fos(SantaCruz,Inc.1:1000)4℃,48h、生物素化羊抗兔IgG(Sigma,1:500)室温3h\,ABC液(Sigma,1:500)室温3h、葡萄糖氧化酶—DAB—硫酸镍胺法呈色。以上各步后均用PBS液充分漂洗3×10min。常规贴片、干燥、透明、封片。
, 百拇医药
2.5 观察、记数和数据处理
记数方法:参照Paxinos(1986)鼠脑定位图谱,以Bregma-1.80mm平面为基准,取该平面片及其前、后邻近片各1张,共3张进行计数。在400倍镜下,采用上海第三光学仪器厂C5型0.5网形目镜尺(实际划刻面积为5×5mm2,400倍镜下划刻面积为156.25um2)进行,记数与任一测点外上角和测线(横线)上缘交叉的FLN(核着色均匀、深染、边界清晰)。每片于PVN各部相应处取二视野,分别计数,取均值即为该片该部的FLN密度值。将三片的相应值累加取均值,依此即得该鼠一侧PVN各部、一侧PVN和双侧PVN的FLN密度值。终值单位为:个/156.25um2。照像时取同一批次的切片进行。
2.6 对照实验
用正常山羊血清(1:50)替代一抗,余同前,以检测上述免疫细胞化学染色的特异性,结果均为阴性。
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实验结果
1 镜下观察
Fos阳性细胞表达呈现在细胞核上,呈深蓝色,胞浆未着色,核为圆形或卵圆形,背景基本无色。
2 FLN在PVN及其各部(双侧)的表达密度及其组间两两比较(见表1)
由表中可以看出,FLN在各组PVN及其各部双侧(指两侧合并的平均密度)的密度存在差异。在F检验(P<0.01)基础上进行的Q检验,显示各组彼此间差异显著(P<0.01)。说明麻醉刺激对PVN神经元具有影响;电针组刺激对PVN神经元的激活作用是在麻醉刺激基础上的进一步加强,且对PVN各部分神经元均具有激活作用。
3 FLN在PVN及其各部(单侧)的分布密度及组内同、对侧比较(见表2)
表1 FLN在PVN及其各部(双侧)的表达密度及组间两两比较单位:个/156.25um2 组 别
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n
PaV
PaMP
PaLM
PaDC
PVN
电针组
5
17.74±1.40
20.84±0.52
13.22±0.36
13.04±0.37
16.21±0.29
, 百拇医药
对照组
5
8.55±0.16
14.13±1.13
6.51±0.30
5.54±0.21
8.71±0.19
空白组
5
2.42±0.84
4.05±0.25
1.59±0.22
, http://www.100md.com
1.88±0.29
2.43±0.30
*
*
*
*
*
注:F检验P<0.01,*组间比较:P<0.01。PaV:室旁核腹侧部,PaMP:室旁核内侧小细胞部,PaLM:室旁核外侧大细胞部,PaDC:室旁核背侧小帽。表2 FLN在PVN及其各部(单侧)的表达密度及组内同、对侧比较
单位:个/156.25um2 组 别
例数
, 百拇医药
侧别
PaV
PaMP
PaLM
PaDC
PVN
电针组
5
同侧
18.39±1.83
21.9 ±0.53*
16.50±0.43*
, http://www.100md.com
13.75±0.50*
17.65±0.31*
对侧
17.08±1.45
19.75±0.57
9.92±0.32
12.33±0.27
14.77±0.29
对照组
5
同侧
8.73±0.54
, 百拇医药
14.25±0.88
6.59±0.42
5.58±0.57
8.79±0.10
对侧
8.58±0.57
14.00±1.47
6.42±0.57
5.50±0.43
8.63±0.41
空白对
5
, 百拇医药
同侧
2.45±0.83
4.25±0.32
1.50±0.43
2.00±0.27
2.50±0.24
对侧
2.59±0.92
3.83±0.43
1.67±0.27
2.00±0.27
2.44±0.37
, 百拇医药
注:*与对侧比较:P<0.01。
由表中可以看出,FLN在各组PVN及其各部的密度值是不一致的。电针组同侧(针刺侧)显著高于对侧(P<0.01),主要表现在同侧PaMP、PaLM和PaDC三部分;对照组和空白组同、对侧各部无差异(P>0.05)。以上说明,电针组刺激激活了PVN双侧各部神经元,但以同侧更为明显,重点表现在同侧PaMP、PaLM和PaDC三部分;麻醉刺激不导致两侧差异。
4 以上各组FLN照片(见附图片1~6)
讨论
1 c-fos癌基因的诱导和显示是一种反映神经通路的新方法,是神经元被激活的标志[5],国内少数学者将这一方法用于针刺研究[6]。本研究在实施过程中,采取多项措施以防止非特异性应急反应的发生,并设立实验对照组和空白对照组,使得能从实验结果中有效分离出非特异性刺激所致的应激反应。结果显示,电针刺激右“肾俞”穴所至PVN中FLN密度值的组间差异,组内同、对侧差异十分显著,甚至在同一侧PVN的不同部分差异也非常明显,因此提示:(1)电针刺激右“肾俞”穴对PVN神经元具有激活作用,PVN参与了“肾俞”穴的针刺效应过程;(2)PVN神经元对同一方法刺激单侧“肾俞”穴的这种反应上的同、对侧差异,可能是导致“肾俞”穴针刺效应两侧差异的重要环节之一。
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2 关于“肾俞”穴针刺效应机理,国内外已有一些研究报道,虽各自的研究方法和着重点不同,但结果基本一致,即神经—内分泌系统在针刺效应中具有及其重要的作用[1~3]。神经生物研究揭示,PVN是神经体液调节的关键部位之一,它既具有神经内分泌的功能,又参与植物神经的控制,在实现交感—肾上腺髓质和下丘脑—垂体—肾上腺皮质两大系统的整合中起着重要作用。神经电生理学研究显示,电刺激PVN可引起ACTH的分泌,PVN参与调节肾交感神经节前神经元的传出活动[7],参与肾神经传入所引起的升血ACTH效应等[8]。
鉴于本实验研究的结果证明,PVN参与了“肾俞”穴的针刺效应,因而可以设想:“肾俞”穴的针刺信息,在触发以背根节和交感神经节为中心的中枢外反射通路和脊髓低级中枢反射通路的同时,可经背根节和脊髓的两次整合,上行(直接或间接)入PVN,并使其神经元激活,被激活的PVN神经元一方面由其投射到正中隆起的纤维分泌CRF和AVP,引起垂体前叶ACTH和β—EP的分泌,进而影响下丘脑—垂体—肾上腺皮质系统,调节机体内分泌水平;经其室旁核—脊髓路径,通过释放CRF和AVP,影响交感—肾上腺髓质系统,调节机体内脏运动的交感传出;另一方面其大神经分泌细胞分泌的VP,经垂体束到达垂体后叶释放入血,调节机体的水液代谢等。这一设想与现有的关于“肾俞”穴针刺效应的结论基本相符。其具体细节有待进一步研究、证实。
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3 针灸医学十分注重临证时选穴方法,如《灵枢缪刺》和《灵枢官针》都提到缪刺和巨刺,均有“右取左,左取右”。《素问.阴阳大论》也说“故善用针者……以右治左,以左治右。”本研究以电针刺激右“肾俞”穴,导致了下丘脑室旁核功能状态的同、对侧差异,亦即给予“肾俞”穴的同一刺激对室旁核的影响“左、右”不同。因为双侧下丘脑室旁核不同的兴奋程度,势必会导致其对机体器官功能“左,右”影响的差异。所以,本研究结果,实际上为巨刺、缪刺“右取左,左取右,以左治右,以右治左”的刺穴方法和针刺效应的表达提供了直接的神经形态学证据。
1,2 空白组 100X;3,4 对照组 100X;5,6 电针组 100X
作者简介:陈泽斌(1964—),男,湖北中医学院解剖学教研室讲师,硕士。主要从事背俞穴针刺效应的中枢神经机制的研究,近期的研究重点是“肾俞”穴针刺效应与下丘脑室旁核的关系。
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参考文献
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(收稿日期 1999—05—01 修回日期 1999—08—13), 百拇医药