流感嗜血杆菌肺部感染病原诊断实验研究
作者：赖国祥 修清玉 方正 罗文侗
单位：修清玉(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)；方正(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)；罗文侗(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)；赖国祥(南京军区福州总医院呼吸内科，福州 350025)
关键词：嗜血菌；流感；肺炎
分类号分类号：R 378 文献标识码：B
文章编号：0258-879X(2000)02-0113-02▲
为提高流感嗜血杆菌(Hi)检出率，指导临床诊断和治疗，我们运用改良的哥伦比亚巧克力琼脂和血琼脂加金黄色葡萄球菌(金葡菌)划线两种培养基，对门、急诊诊断为社区获得性急性肺部感染患者的痰标本同时进行Hi及其他细菌的分离培养，Hi分离株作患者自身血清凝集试验，获得满意结果，报告如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 病例来源 根据症状、体征、胸部X线摄片、血白细胞计数及分类等检查，连续收集1995年8月～1997年7月我院门、急诊诊断为社区获得性急性肺部感染(包括慢性支气管炎急性发作)患者608例(就诊前使用过抗菌药物及干咳无痰者不包括其内)。年龄7～89岁，男410例，女198例。
1.2 方法
1.2.1 培养基 改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基[1]，以Columbia琼脂为基础，加2%胰蛋白胨，0.1%淀粉，1%酵母浸出膏，溶于1 000 ml蒸馏水中，调整pH值至7.4～7.6，高压灭菌20 min，冷却至85℃，加入5%脱纤维羊血制成平板。血琼脂及营养琼脂按常规方法制备。
1.2.2 细菌分离培养 指导患者漱口后留痰，镜检示多形核白细胞和鳞状上皮细胞之比>2.5∶1者为合格标本，生理盐水洗涤2遍，在1 h内，按操作常规挑取中心部分痰，分别划线接种于改良哥伦比亚巧克力琼脂和血琼脂两种培养基上。前者第二区以倒三角形贴布万古霉素(V 30 μg),杆菌肽(B 10 IU)及氯洁霉素(CM 2 μg) 3种药敏纸片，间距1.5～2.0 cm;后者作1→3区及2→4区的金葡菌交叉划线接种，置5% CO2，37℃温箱孵育24 h观察。
, 百拇医药
1.2.3 Hi的鉴定 (1)菌落呈无色透明或灰白色半透明、湿润、圆形隆起，且具有特殊反光现象，直径约0.3～0.7 mm。(2)显微镜下呈多形的革兰阴性球杆菌。(3)生长需Ⅹ因子和Ⅴ因子、卫星试验阳性。(4)在血琼脂平皿上不溶血。
1.2.4 血清凝集试验 按吴丽华等[2]方法将患者血清与自身Hi 分离株菌体抗原作试管法血清凝集试验，从痰培养Hi阳性的98例患者中，随机选择50例患者采集血清(其中18例在不同时间2次采集血清)作为试验组，同期采集50份健康献血者血清作为对照组。
1.3 统计学处理 采用χ2检验比较分析。
2 结 果
2.1 两种培养基上Hi检出情况 608份痰标本，在改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基上分离出98株Hi，阳性率为16.1%；其中51株Hi在血琼脂加金葡菌划线培养基上同时分离到，阳性率为8.4%。改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基上Hi未生长的痰标本在血琼脂加金葡菌划线培养基上亦阴性。经χ2检验，两种培养基的Hi阳性检出率差异有显著性意义(P<0.01)。
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2.2 社区获得性急性肺部感染患者痰中病原菌检出情况 608例患者痰标本中致病菌检出率为42.3%(257/608)，其中流感嗜血杆菌阳性率16.1%，占细菌性病原38.0%(98/257)，居首位。其次为肺炎链球菌10.0%(61/608)。大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，非A，B或D群肠球菌，硝酸盐阴性不动杆菌及其他细菌依此为3.3%，3.1%，2.5%，2.3%，1.7%，1.5%，1.8%。
2.3 血清凝集试验结果 以≥1∶128为阳性血清抗体效价界限[3]。实验组阳性39例，占78.0%，为发病后第11～45天采血；11例阴性者，9例采血日在发病后第13天内。18例双份血清抗体效价在肺部感染后第15～22天表现为≥1∶128阳性，抗体效价最高可≥1∶1 024，此后稳定于较高水平约2～3周，第35天左右部分血清抗体效价开始下降。对照组示正常人血清抗体效价均阴性，其中5例1∶64，6例1∶32，10例1∶4，29例为1∶4以下阴性，特异性100%。经χ2检验，实验组与对照组的血清抗体效价阳性率比较差异非常显著(P<0.01)。
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3 讨 论
国外调查表明[4]，****获得性肺炎细菌性病原中Hi仅次于肺炎链球菌，约15%左右。Hi引起的小儿肺炎则居首位，占23～45%[5]。国内未见报道，其主要原因是Hi生长要求高，需烟酰胺腺嘌呤核苷酸(β-NAD，Ⅴ因子)及血红蛋白或其衍生物(Ⅹ因子)，最适生长环境为5～10% CO2，温度37℃，pH 7.4～7.6。国内细菌检验室常规细菌培养缺乏这种条件，因此Hi检出率低，实际上低估了Hi在社区获得性肺部感染中的地位。我们根据国内外经验，研制了改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基，实验证明Hi在改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基上生长菌落大，生长指数高于其他培养基，Hi分离率高[1]。本组608例急性社区获得性肺部感染患者的痰标本经改良法细菌分离培养，结果表明，Hi在社区获得性肺部感染中占细菌性病原的38.0%，感染率为16.1%。50例随机选择的患者自身Hi分离株血清凝集试验敏感性78.0%,特异性100%，特别是18例双份血清抗体效价的升降改变，显示了肺部Hi感染后机体特异性免疫抗体的变化趋势，与国外研究报道一致[4]，证实了病原诊断的可靠性。提示Hi在我国社区获得性肺部感染患者中有较高的发病率[5]，应引起足够的重视。
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作者简介：赖国祥(1964～)，男(汉族)，硕士，主治医师
参考文献：
[1]修清玉，方 正，赖国祥，等. 改良流感嗜血杆菌培养基的实验研究与评价[J]. 中华医学检验杂志，1998，21(3)：16-19.
[2]吴丽华，周 弟，杨秀琴，等. 流感嗜血杆菌免疫血清的试制[J]. 中华流行病学杂志，1993，14(2)：110-113.
[3]贾万钧，李文简. 免疫血清学检验指导—— 抗原抗体反应定量表的应用[M]. 北京：化学工业出版社，1988. 110-114.
[4]Burman LA, Leinonen M,Trolfors B. Use of serology to diagnose pneumonia caused by nonen capsulated haemophilus influenzae and moraxella catarrholis[J]. J Infect Dis,1994,170(1): 220-225.
[5]赖国祥，叶礼燕，李玉德，等.儿童下呼吸道流感嗜血杆菌感染的临床调查[J]. 中华儿科杂志，1997，35(11)：590-593.
收稿日期：1999-08-07
修稿日期：1999-12-04, http://www.100md.com
单位：修清玉(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)；方正(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)；罗文侗(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)；赖国祥(南京军区福州总医院呼吸内科，福州 350025)
关键词：嗜血菌；流感；肺炎
分类号分类号：R 378 文献标识码：B
文章编号：0258-879X(2000)02-0113-02▲
为提高流感嗜血杆菌(Hi)检出率，指导临床诊断和治疗，我们运用改良的哥伦比亚巧克力琼脂和血琼脂加金黄色葡萄球菌(金葡菌)划线两种培养基，对门、急诊诊断为社区获得性急性肺部感染患者的痰标本同时进行Hi及其他细菌的分离培养，Hi分离株作患者自身血清凝集试验，获得满意结果，报告如下。
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1 材料和方法
1.1 病例来源 根据症状、体征、胸部X线摄片、血白细胞计数及分类等检查，连续收集1995年8月～1997年7月我院门、急诊诊断为社区获得性急性肺部感染(包括慢性支气管炎急性发作)患者608例(就诊前使用过抗菌药物及干咳无痰者不包括其内)。年龄7～89岁，男410例，女198例。
1.2 方法
1.2.1 培养基 改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基[1]，以Columbia琼脂为基础，加2%胰蛋白胨，0.1%淀粉，1%酵母浸出膏，溶于1 000 ml蒸馏水中，调整pH值至7.4～7.6，高压灭菌20 min，冷却至85℃，加入5%脱纤维羊血制成平板。血琼脂及营养琼脂按常规方法制备。
1.2.2 细菌分离培养 指导患者漱口后留痰，镜检示多形核白细胞和鳞状上皮细胞之比>2.5∶1者为合格标本，生理盐水洗涤2遍，在1 h内，按操作常规挑取中心部分痰，分别划线接种于改良哥伦比亚巧克力琼脂和血琼脂两种培养基上。前者第二区以倒三角形贴布万古霉素(V 30 μg),杆菌肽(B 10 IU)及氯洁霉素(CM 2 μg) 3种药敏纸片，间距1.5～2.0 cm;后者作1→3区及2→4区的金葡菌交叉划线接种，置5% CO2，37℃温箱孵育24 h观察。
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1.2.3 Hi的鉴定 (1)菌落呈无色透明或灰白色半透明、湿润、圆形隆起，且具有特殊反光现象，直径约0.3～0.7 mm。(2)显微镜下呈多形的革兰阴性球杆菌。(3)生长需Ⅹ因子和Ⅴ因子、卫星试验阳性。(4)在血琼脂平皿上不溶血。
1.2.4 血清凝集试验 按吴丽华等[2]方法将患者血清与自身Hi 分离株菌体抗原作试管法血清凝集试验，从痰培养Hi阳性的98例患者中，随机选择50例患者采集血清(其中18例在不同时间2次采集血清)作为试验组，同期采集50份健康献血者血清作为对照组。
1.3 统计学处理 采用χ2检验比较分析。
2 结 果
2.1 两种培养基上Hi检出情况 608份痰标本，在改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基上分离出98株Hi，阳性率为16.1%；其中51株Hi在血琼脂加金葡菌划线培养基上同时分离到，阳性率为8.4%。改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基上Hi未生长的痰标本在血琼脂加金葡菌划线培养基上亦阴性。经χ2检验，两种培养基的Hi阳性检出率差异有显著性意义(P<0.01)。
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2.2 社区获得性急性肺部感染患者痰中病原菌检出情况 608例患者痰标本中致病菌检出率为42.3%(257/608)，其中流感嗜血杆菌阳性率16.1%，占细菌性病原38.0%(98/257)，居首位。其次为肺炎链球菌10.0%(61/608)。大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，非A，B或D群肠球菌，硝酸盐阴性不动杆菌及其他细菌依此为3.3%，3.1%，2.5%，2.3%，1.7%，1.5%，1.8%。
2.3 血清凝集试验结果 以≥1∶128为阳性血清抗体效价界限[3]。实验组阳性39例，占78.0%，为发病后第11～45天采血；11例阴性者，9例采血日在发病后第13天内。18例双份血清抗体效价在肺部感染后第15～22天表现为≥1∶128阳性，抗体效价最高可≥1∶1 024，此后稳定于较高水平约2～3周，第35天左右部分血清抗体效价开始下降。对照组示正常人血清抗体效价均阴性，其中5例1∶64，6例1∶32，10例1∶4，29例为1∶4以下阴性，特异性100%。经χ2检验，实验组与对照组的血清抗体效价阳性率比较差异非常显著(P<0.01)。
, 百拇医药
3 讨 论
国外调查表明[4]，****获得性肺炎细菌性病原中Hi仅次于肺炎链球菌，约15%左右。Hi引起的小儿肺炎则居首位，占23～45%[5]。国内未见报道，其主要原因是Hi生长要求高，需烟酰胺腺嘌呤核苷酸(β-NAD，Ⅴ因子)及血红蛋白或其衍生物(Ⅹ因子)，最适生长环境为5～10% CO2，温度37℃，pH 7.4～7.6。国内细菌检验室常规细菌培养缺乏这种条件，因此Hi检出率低，实际上低估了Hi在社区获得性肺部感染中的地位。我们根据国内外经验，研制了改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基，实验证明Hi在改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基上生长菌落大，生长指数高于其他培养基，Hi分离率高[1]。本组608例急性社区获得性肺部感染患者的痰标本经改良法细菌分离培养，结果表明，Hi在社区获得性肺部感染中占细菌性病原的38.0%，感染率为16.1%。50例随机选择的患者自身Hi分离株血清凝集试验敏感性78.0%,特异性100%，特别是18例双份血清抗体效价的升降改变，显示了肺部Hi感染后机体特异性免疫抗体的变化趋势，与国外研究报道一致[4]，证实了病原诊断的可靠性。提示Hi在我国社区获得性肺部感染患者中有较高的发病率[5]，应引起足够的重视。
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作者简介：赖国祥(1964～)，男(汉族)，硕士，主治医师
参考文献：
[1]修清玉，方 正，赖国祥，等. 改良流感嗜血杆菌培养基的实验研究与评价[J]. 中华医学检验杂志，1998，21(3)：16-19.
[2]吴丽华，周 弟，杨秀琴，等. 流感嗜血杆菌免疫血清的试制[J]. 中华流行病学杂志，1993，14(2)：110-113.
[3]贾万钧，李文简. 免疫血清学检验指导—— 抗原抗体反应定量表的应用[M]. 北京：化学工业出版社，1988. 110-114.
[4]Burman LA, Leinonen M,Trolfors B. Use of serology to diagnose pneumonia caused by nonen capsulated haemophilus influenzae and moraxella catarrholis[J]. J Infect Dis,1994,170(1): 220-225.
[5]赖国祥，叶礼燕，李玉德，等.儿童下呼吸道流感嗜血杆菌感染的临床调查[J]. 中华儿科杂志，1997，35(11)：590-593.
收稿日期：1999-08-07
修稿日期：1999-12-04, http://www.100md.com