细胞连接蛋白基因在胃癌中的表达研究
作者：刘洋 沈守荣* 张熙纯 邹益友 彭重恩
单位：湖南医科大学湘雅医院消化内科(长沙，410008) *通讯作者
关键词：胃肿瘤；细胞连接蛋白基因；基因表达
癌症990518
【摘 要】 目的：为了系统研究人胃癌基因组中Cx基因的表达状况。方法：本文采用Northern印迹杂交和RT-PCR方法，对15例人胃癌组织、配对癌旁组织、正常组织及人胃腺癌MGC-803细胞株的Cx26、Cx31.1、Cx32、Cx33、Cx37、Cx40、Cx43、Cx46八种Cx基因表达进行了一系列检测。结果：发现在人正常胃粘膜上皮中高水平表达而在胃癌中表达极其微弱或根本无表达的细胞连接蛋白基因的表达规律，首次明确了Cx基因在人胃癌基因组中的表达谱。其中人正常胃粘膜上皮细胞中Cx32、Cx37、Cx43在mRNA水平上有高水平表达；与正常相反，人胃癌细胞除Cx43在mRNA水平上有低水平表达外，其他连接蛋白基因均无转录活性；而人胃腺癌MGC-803细胞株中，Cx37、Cx46在mRNA水平上有一定程度的表达。结论：本研究表明Cx32可能是人胃上皮细胞基因组中维持细胞间隙连接通讯功能的特异表达的Cx基因，Cx46可能是胃癌Cx基因表达的一种变异。Cx37、Cx43不是人胃上皮细胞的特异表达基因。本研究证实了Cx基因在肿瘤细胞中表达下调，Cx基因具有潜在的抑瘤基因的生物学活性。
, 百拇医药
中图分类号：R735.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0550-04
Expression of the connexin genes in human stomach carcinoma
LIU Yang, SHEN Shou-rong, ZHANG Xi-chun, et al.
Department of Gastroenterology,Xiangya Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410008,P.R. China
【Abstract】 Objective：To study systematically the expression of Cx26,Cx31.1, Cx32,Cx33,Cx37,Cx40,Cx43,Cx46 in human stomach carcinoma Methods：Northern hybridization analysis and RT-PCR methods were used. Biopsies from 15 stomach carcinoma patients matched with corressponding paracancerous tissues,normal tissues and human stomach carcinoma MGC-803 cell line were analysed. Results：The results showed high level expression of Cx32,Cx37 and Cx43 mRNA in normal human stomach epithelial cells,the human stomach carcinoma cells,however, expressed neither Cx32 mRNA nor Cx37 mRNA except low level of Cx43 mRNA expression; but human stomach carcinoma MGC-803 cell line expressed Cx37 and Cx46 mRNA. Conclusions： Cx32 probably is the specific-expression gene which mantains gap junctional intercellular communication (GJIC) in human stomach epithelial cells,Expression of Cx46 is various in human stomach carcinoma cells,Cx37 and Cx43 are not the specific-expression genes in human stomach epithelial cells.Cx gene expression is down-regulated in carcinoma cells, Cx gene is a kind of potential tumor suppressor gene.
, 百拇医药
Key words：Stomach carcinoma;Connexin gene;Gene expression
间隙连接(gap junction)是细胞膜上的连接通道结构，它介导的细胞间隙连接通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)在细胞增殖和分化调控中起着重要的作用〔1〕。间隙连接由膜上的连接子(connexon)结构单位构成，其蛋白成分称连接蛋白(connexin,Cx)〔2〕。间隙连接的异常是肿瘤的一个重要特征，肿瘤和转化细胞普遍存在GJIC的缺陷，GJIC的恢复与肿瘤的生长控制和转化表型的抑制相关〔3〕。对人胃癌GJIC在Cx基因转录水平上的研究很少，特别是系统研究Cx基因表达目前尚未见文献报道。本研究采用Northern杂交、RT-PCR两种方法系统检测了Cx基因在人胃癌、胃正常上皮细胞及人胃癌细胞株中mRNA表达情况，以探讨胃癌的发病机理。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织标本：15例未经过放疗或化疗确诊为胃癌的手术标本及配对癌旁组织、正常组织，立即冻存于液氮中。其中12例为低分化腺癌，2例印戒细胞癌，1例高分化腺癌。
1.1.2 材料：人胃腺癌MGC803细胞株由湖南医科大学肿瘤研究所提供；质粒pCx26、pCx31.1、pCx32、pCx33、pCx37、pCx40、pCx43、pCx46及内对照pGAPDH由湖南医科大学肿瘤所李桂源教授提供；Cx32基因PCR引物及内对照GAPDH引物由中科院上海细胞生物学研究所合成。Cx26、Cx40、Cx43基因PCR引物由湖南医科大学肿瘤所李桂源教授提供。引物序列详见表1。
表1 引物序列表 名 称
扩增片段
, 百拇医药
序 列
扩增片段大小(bP)
Cx26-1
Exon2
CGCTCTCCCAACTCGCAGCCAGTC
186
Cx26-2
GCTGGGCGGCGGGAAGCGGCGAGG
Cx32-1
Exon2
AACTGGACAGGTCTATACAC
, 百拇医药
699
Cx32-2
TTGCGGGAGGGCGGATTGGA
Cx40-1
Exon2
GTCTAGATGGGTGACTGGAGCTTCCTG
1077
Cx40-2
GGAATTCACACTGACAGGTCATCTGA
Cx43-1
Exon2
, 百拇医药
GCGTGAGGAAAGTACCAAACA
141
Cx43-2
TCTTTTGCTTAAAAGTAGTGA
1.2 方法
1.2.1 质粒的抽提及酶切：分别将携带9种质粒的细菌小量复苏后，再大量扩增，采用碱变性法抽提，再用相应的内切酶消化，然后在1%琼脂糖凝胶上电泳分离，切下目的片段，用GlassMAX试剂盒回收DNA片段，4℃贮存备用。
1.2.2 总RNA抽提：按照Promega公司提供的TRIzol试剂盒介绍的方法抽提癌、癌旁组织、正常组织及胃癌细胞株总RNA。
1.2.3 Northern杂交筛选Cx基因的表达：30μgtota1 RNA，在1%琼脂糖甲醛变性胶上电泳。纸巾法转至尼龙膜上后交联。以a-32P-dCTP为标记物，用随机引物标记盒标记探针，同一张膜先后与目的探针和GAPDH探针杂交。洗膜，-70℃曝光，放射自显影。
, 百拇医药
1.2.4 RT-PCR检测Cx基因的表达：先用无RNase的DNaseⅠ处理所提取的RNA样品，以去除其中痕量DNA，然后根据Promega公司RT试剂盒说明，先将mRNA反转录成cDNA，再取cDNA进行PCR反应。循环参数如下：94℃，50sec;56℃，50sec；72℃，1min;35个循环周期。阳性对照用GAPDH引物取代Cx基因引物。进一步将RT-PCR产物电泳分离，然后变性、中和、转膜、紫外交联，再进行Southern杂交分析。
2 结果
2.1 人胃癌细胞株中Cx基因的表达
人胃癌细胞株总RNA分别与Cx26cDNA(0.68kb)、Cx31.1cDNA(0.85kb)、Cx32cDNA(1.5kb)、Cx33cDNA(0.76kb)、Cx37cDNA(1.25kb)、Cx40cDNA(1.3kb)、Cx43cDNA(1.7kb)及Cx46cDNA(1.6kb)片段Northern杂交，结果显示1.7kbCx37mRNA、3.0kbCx46mRN杂交信号(图1)，表明Cx37和Cx46在人胃癌细胞株中有表达。将人胃癌细胞株mRNA逆转录成cDNA后，分别用Cx26、Cx32、Cx40和Cx43基因PCR引物进行PCR扩增，结果显示人胃癌细胞株均未扩增出特异性片段。
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图1 Northem杂交检测Cx37(左)、Cx46(中)及Cx32(右)mRNA的表达
A：癌旁组织；N：正常人胃粘膜组织
M：人胃癌细胞株；C：人胃癌组织
2.2 人胃癌细胞中Cx基因的表达
15例人胃癌细胞总RNA分别与上述八种Cx探针Northern杂交，结果均未见杂交信号。将15例人胃癌细胞mRNA逆转录成cDNA后，分别用Cx26、Cx32、Cx40、Cx43基因PCR引物进行PCR扩增，结果5例低分化腺癌、1例印戒细胞癌、1例高分化腺癌扩增出了一条141bp的弱带(图2)，表明Cx43在人胃癌细胞中表达水平低。
2.3 人正常胃粘膜上皮细胞和癌旁上皮细胞中Cx基因的表达
, 百拇医药
15例人正常胃粘膜上皮细胞总RNA分别与8种Cx探针Northern杂交，结果9例显示1.6kbCx32mRNA强杂交信号，6例无Cx32mRNA杂交信号；7例显示1.7kgCx37mRNA强杂交信号，8例无Cx37mRNA杂交信号；同时配对的15例癌旁上皮细胞总RNA亦分别与八种Cx探针Northern杂交，结果8例也显示1.6kbCx32mRNA弱杂交信号，7例无Cx32mRNA杂交信号，5例显示1.7kbCx37mRNA弱杂交信号，10例无Cx37mRNA杂交信号(图1)，表明Cx32和Cx37在人胃正常上皮细胞中高水平表达，Cx32在癌旁上皮细胞中表达水平降低。将15例人胃正常上皮细胞和癌旁上皮细胞mRNA逆转录成cDNA后，分别用Cx26、Cx32、Cx40和Cx43基因PCR引物进行PCR扩增，结果显示9例正常胃粘膜上皮细胞扩增出了一条699bp的强带，其余6例未见扩增带；8例癌旁上皮细胞扩增出了一条699bp的弱带，其余7例未见扩增带(图2)，Southern杂交进一步证实了RT-PCR的结果(图3)。此外11例正常上皮细胞和10例癌旁上皮细胞均扩出一条141bp的扩增带，前者亮度明显高于后者，而后者亮度又高于癌细胞(图2)，表明Cx43在人胃正常上皮细胞中高水平表达，在癌旁上皮细胞中表达水平下降。
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图2 RT-PCR检测Cx32(左)和Cx43(右)mRNA的表达
M1：pBR322DNA/Msp1；M2：pBR322DNA/BstN1；
N：正常人胃粘膜组织；M：人胃癌细胞株；
A：癌旁组织；C：人胃癌组织
2.4 Cx基因表达情况(详见表2)
表2 胃癌、正常、癌旁上皮细胞及MGC-803细胞的Cx基因表达 基因
表达水平
胃癌
正常
, 百拇医药
癌旁
MGC-803
Cx26
-
-
-
-
Cx31.1
-
-
-
-
Cx32
-
, 百拇医药
+++
+
-
Cx33
-
-
-
-
Cx37
-
+++
+
++
Cx40
, 百拇医药
-
-
-
-
Cx43
+
+++
++
-
Cx46
-
-
-
++
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注：+++为高水平表达，++为中等水平表达，+为低水平表达，-为不表达
图3 Southern杂交检测Cx32RT-PCR产物
N：正常人胃粘膜组织；A：癌旁组织
3 讨论
Cx成员在结构上表现明显的种、系间保守性，其表达分布有一定的专一性。据文献报道，哺乳动物胃正常上皮细胞表达Cx26、Cx32、Cx37、Cx43〔4〕，OhkusaT等〔5〕应用抗Cx32单克隆抗体及免疫荧光技术观察到人正常胃上皮细胞高水平表达而胃癌细胞不表达Cx32。UchidaY等〔6〕亦有类似报道。本研究首次对连接蛋白基因在mRNA水平进行了系统的表达谱研究，发现人胃正常上皮细胞有Cx32、Cx37、Cx43mRNA的高表达；人胃癌细胞除Cx43在mRNA水平上有低水平表达外，其余的连接蛋白基因均无转录活性；Cx37、Cx46在人胃腺癌MGC803细胞株中有一定水平的表达。从人胃正常上皮细胞、癌旁上皮细胞与胃癌细胞及胃腺癌细胞株的配对比较结果，表明Cx32可能是正常人胃上皮细胞间隙连接通道的主要成分，是人胃上皮细胞的特异性表达的Cx基因，其表达对人胃正常上皮细胞的通道功能具有重要作用，它的表达缺失是致胃癌GJIC障碍的主要原因。Cx37、Cx43在正常、癌细胞株或癌组织中均有表达，说明这两种基因不是人胃上皮细胞的特异表达基因，并非人胃正常上皮细胞GJIC的主要成份。Cx46在癌细胞株中有表达而在人胃正常上皮细胞表达缺失的结果，则可解释为在癌变的环境中癌细胞基因组为了突破GJIC的障碍，试图重建细胞间隙连接的一种表达变异。Wilgenbus等〔7〕也曾发现Cx43在正常肝细胞中表达缺失，却在人肝细胞癌中有高水平表达；在成人皮肤组织中不含Cx26，却存在于基底细胞癌组织标本中。这些结果与本研究的结论相似。
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Cx基因是一类新近发现的与细胞增殖、分化和发育密切相关的基因〔7〕。胃癌是发病率极高的一种肿瘤，有极其明显的不同分化阶段，研究Cx基因在胃粘膜上皮不同分化窗口的表达规律，这对于阐明Cx基因对细胞分化与增殖的作用、了解Cx基因表达与细胞分化的关系是一个极好的研究模型。这种研究模型在国内外的同类研究中未见报道，是一个值得研究的领域。本研究表明，Cx32和Cx43在人正常胃粘膜上皮细胞中高水平表达，在癌旁细胞中表达水平下降，Cx32在癌细胞及癌细胞株均不表达，Cx43在癌细胞中有低水平表达，在癌细胞株中无表达。这表明Cx32和Cx43的表达与胃粘膜上皮细胞分化程度相关。人胃癌细胞株表达Cx37与Cx46，而人胃癌细胞不表达Cx37、Cx46，这说明体内、体外细胞生存的环境差异亦可能影响Cx基因的表达水平。本研究未发现Cx基因表达与胃癌的病理分型的相关性，这可能与每一类型的样本数少有关。此外，本研究还存在RTPCR有特异片段而Northern杂交无信号的情况，这可能与RTPCR较Northern杂交技术的灵敏度高有关。
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胃癌细胞中相对特异的Cx基因为什么产生表达缺失和下调，其分子生物学基础是什么?它们的表达受什么机制调控，有哪些因素影响?对这些问题的了解将有助于阐明细胞连接蛋白基因在细胞癌变过程中的作用。目前，我们对此正在进行深入的研究。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39670344)
〔参考文献〕
〔1〕 Naus CC,Zhu D,Todd SD,et al. Characteristics of C6 gliomacells overexpression a gap junction protein〔J〕. Cell Mol Neurobiol,1992,12：163～175.
〔2〕 Paul DL. New functions for gap junctions〔J〕. Curr Opin Cell Biol,1995,7：665～672.
, 百拇医药
〔3〕 Mehta PP,Hotz-Wagenblatt A,Rose B,et al. Incorporation of the gene for a cell-cell channel protein into transformed cells leads to normalization of growth〔J〕. J Membr Biol,1991,124：207～225.
〔4〕 Willecke K,Hennemann H,Dahl E,et al.The diversity of connexin genes encoding gap junctional proteins〔J〕. EurJ Cell Biol,1991,56：1～7.
〔5〕 Ohkusa T,Fujiki K,Tamura Y,et al. Freeze-fracture and immunohistochemical studies of gap junctions in human gastric mucosa with special reference to their relationship to gastric ulcer and gastric carcinoma〔J〕. Microsc Res Tech,1995,31：226～233.
, http://www.100md.com
〔6〕 Uchida Y,Matsuda K,Sasahara K,et al. Immunohistochemistry of gap junctions in normal and diseased gastric mucosa ofhumans〔J〕. Gastroenterology,1995,109：1492～1496.
〔7〕 Wilgenbus KK,Kirkpatrick CJ,Knnechel LR,et al.Expression of Cx26,Cx32,Cx43 gap junction proteins in normal and neoplastic human tissues〔J〕. Int J Cancer,1992，51：522～529.
收稿日期：1998-11-02；修回日期：1999-03-24, 百拇医药
单位：湖南医科大学湘雅医院消化内科(长沙，410008) *通讯作者
关键词：胃肿瘤；细胞连接蛋白基因；基因表达
癌症990518
【摘 要】 目的：为了系统研究人胃癌基因组中Cx基因的表达状况。方法：本文采用Northern印迹杂交和RT-PCR方法，对15例人胃癌组织、配对癌旁组织、正常组织及人胃腺癌MGC-803细胞株的Cx26、Cx31.1、Cx32、Cx33、Cx37、Cx40、Cx43、Cx46八种Cx基因表达进行了一系列检测。结果：发现在人正常胃粘膜上皮中高水平表达而在胃癌中表达极其微弱或根本无表达的细胞连接蛋白基因的表达规律，首次明确了Cx基因在人胃癌基因组中的表达谱。其中人正常胃粘膜上皮细胞中Cx32、Cx37、Cx43在mRNA水平上有高水平表达；与正常相反，人胃癌细胞除Cx43在mRNA水平上有低水平表达外，其他连接蛋白基因均无转录活性；而人胃腺癌MGC-803细胞株中，Cx37、Cx46在mRNA水平上有一定程度的表达。结论：本研究表明Cx32可能是人胃上皮细胞基因组中维持细胞间隙连接通讯功能的特异表达的Cx基因，Cx46可能是胃癌Cx基因表达的一种变异。Cx37、Cx43不是人胃上皮细胞的特异表达基因。本研究证实了Cx基因在肿瘤细胞中表达下调，Cx基因具有潜在的抑瘤基因的生物学活性。
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中图分类号：R735.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0550-04
Expression of the connexin genes in human stomach carcinoma
LIU Yang, SHEN Shou-rong, ZHANG Xi-chun, et al.
Department of Gastroenterology,Xiangya Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410008,P.R. China
【Abstract】 Objective：To study systematically the expression of Cx26,Cx31.1, Cx32,Cx33,Cx37,Cx40,Cx43,Cx46 in human stomach carcinoma Methods：Northern hybridization analysis and RT-PCR methods were used. Biopsies from 15 stomach carcinoma patients matched with corressponding paracancerous tissues,normal tissues and human stomach carcinoma MGC-803 cell line were analysed. Results：The results showed high level expression of Cx32,Cx37 and Cx43 mRNA in normal human stomach epithelial cells,the human stomach carcinoma cells,however, expressed neither Cx32 mRNA nor Cx37 mRNA except low level of Cx43 mRNA expression; but human stomach carcinoma MGC-803 cell line expressed Cx37 and Cx46 mRNA. Conclusions： Cx32 probably is the specific-expression gene which mantains gap junctional intercellular communication (GJIC) in human stomach epithelial cells,Expression of Cx46 is various in human stomach carcinoma cells,Cx37 and Cx43 are not the specific-expression genes in human stomach epithelial cells.Cx gene expression is down-regulated in carcinoma cells, Cx gene is a kind of potential tumor suppressor gene.
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Key words：Stomach carcinoma;Connexin gene;Gene expression
间隙连接(gap junction)是细胞膜上的连接通道结构，它介导的细胞间隙连接通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)在细胞增殖和分化调控中起着重要的作用〔1〕。间隙连接由膜上的连接子(connexon)结构单位构成，其蛋白成分称连接蛋白(connexin,Cx)〔2〕。间隙连接的异常是肿瘤的一个重要特征，肿瘤和转化细胞普遍存在GJIC的缺陷，GJIC的恢复与肿瘤的生长控制和转化表型的抑制相关〔3〕。对人胃癌GJIC在Cx基因转录水平上的研究很少，特别是系统研究Cx基因表达目前尚未见文献报道。本研究采用Northern杂交、RT-PCR两种方法系统检测了Cx基因在人胃癌、胃正常上皮细胞及人胃癌细胞株中mRNA表达情况，以探讨胃癌的发病机理。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织标本：15例未经过放疗或化疗确诊为胃癌的手术标本及配对癌旁组织、正常组织，立即冻存于液氮中。其中12例为低分化腺癌，2例印戒细胞癌，1例高分化腺癌。
1.1.2 材料：人胃腺癌MGC803细胞株由湖南医科大学肿瘤研究所提供；质粒pCx26、pCx31.1、pCx32、pCx33、pCx37、pCx40、pCx43、pCx46及内对照pGAPDH由湖南医科大学肿瘤所李桂源教授提供；Cx32基因PCR引物及内对照GAPDH引物由中科院上海细胞生物学研究所合成。Cx26、Cx40、Cx43基因PCR引物由湖南医科大学肿瘤所李桂源教授提供。引物序列详见表1。
表1 引物序列表 名 称
扩增片段
, 百拇医药
序 列
扩增片段大小(bP)
Cx26-1
Exon2
CGCTCTCCCAACTCGCAGCCAGTC
186
Cx26-2
GCTGGGCGGCGGGAAGCGGCGAGG
Cx32-1
Exon2
AACTGGACAGGTCTATACAC
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699
Cx32-2
TTGCGGGAGGGCGGATTGGA
Cx40-1
Exon2
GTCTAGATGGGTGACTGGAGCTTCCTG
1077
Cx40-2
GGAATTCACACTGACAGGTCATCTGA
Cx43-1
Exon2
, 百拇医药
GCGTGAGGAAAGTACCAAACA
141
Cx43-2
TCTTTTGCTTAAAAGTAGTGA
1.2 方法
1.2.1 质粒的抽提及酶切：分别将携带9种质粒的细菌小量复苏后，再大量扩增，采用碱变性法抽提，再用相应的内切酶消化，然后在1%琼脂糖凝胶上电泳分离，切下目的片段，用GlassMAX试剂盒回收DNA片段，4℃贮存备用。
1.2.2 总RNA抽提：按照Promega公司提供的TRIzol试剂盒介绍的方法抽提癌、癌旁组织、正常组织及胃癌细胞株总RNA。
1.2.3 Northern杂交筛选Cx基因的表达：30μgtota1 RNA，在1%琼脂糖甲醛变性胶上电泳。纸巾法转至尼龙膜上后交联。以a-32P-dCTP为标记物，用随机引物标记盒标记探针，同一张膜先后与目的探针和GAPDH探针杂交。洗膜，-70℃曝光，放射自显影。
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1.2.4 RT-PCR检测Cx基因的表达：先用无RNase的DNaseⅠ处理所提取的RNA样品，以去除其中痕量DNA，然后根据Promega公司RT试剂盒说明，先将mRNA反转录成cDNA，再取cDNA进行PCR反应。循环参数如下：94℃，50sec;56℃，50sec；72℃，1min;35个循环周期。阳性对照用GAPDH引物取代Cx基因引物。进一步将RT-PCR产物电泳分离，然后变性、中和、转膜、紫外交联，再进行Southern杂交分析。
2 结果
2.1 人胃癌细胞株中Cx基因的表达
人胃癌细胞株总RNA分别与Cx26cDNA(0.68kb)、Cx31.1cDNA(0.85kb)、Cx32cDNA(1.5kb)、Cx33cDNA(0.76kb)、Cx37cDNA(1.25kb)、Cx40cDNA(1.3kb)、Cx43cDNA(1.7kb)及Cx46cDNA(1.6kb)片段Northern杂交，结果显示1.7kbCx37mRNA、3.0kbCx46mRN杂交信号(图1)，表明Cx37和Cx46在人胃癌细胞株中有表达。将人胃癌细胞株mRNA逆转录成cDNA后，分别用Cx26、Cx32、Cx40和Cx43基因PCR引物进行PCR扩增，结果显示人胃癌细胞株均未扩增出特异性片段。
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图1 Northem杂交检测Cx37(左)、Cx46(中)及Cx32(右)mRNA的表达
A：癌旁组织；N：正常人胃粘膜组织
M：人胃癌细胞株；C：人胃癌组织
2.2 人胃癌细胞中Cx基因的表达
15例人胃癌细胞总RNA分别与上述八种Cx探针Northern杂交，结果均未见杂交信号。将15例人胃癌细胞mRNA逆转录成cDNA后，分别用Cx26、Cx32、Cx40、Cx43基因PCR引物进行PCR扩增，结果5例低分化腺癌、1例印戒细胞癌、1例高分化腺癌扩增出了一条141bp的弱带(图2)，表明Cx43在人胃癌细胞中表达水平低。
2.3 人正常胃粘膜上皮细胞和癌旁上皮细胞中Cx基因的表达
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15例人正常胃粘膜上皮细胞总RNA分别与8种Cx探针Northern杂交，结果9例显示1.6kbCx32mRNA强杂交信号，6例无Cx32mRNA杂交信号；7例显示1.7kgCx37mRNA强杂交信号，8例无Cx37mRNA杂交信号；同时配对的15例癌旁上皮细胞总RNA亦分别与八种Cx探针Northern杂交，结果8例也显示1.6kbCx32mRNA弱杂交信号，7例无Cx32mRNA杂交信号，5例显示1.7kbCx37mRNA弱杂交信号，10例无Cx37mRNA杂交信号(图1)，表明Cx32和Cx37在人胃正常上皮细胞中高水平表达，Cx32在癌旁上皮细胞中表达水平降低。将15例人胃正常上皮细胞和癌旁上皮细胞mRNA逆转录成cDNA后，分别用Cx26、Cx32、Cx40和Cx43基因PCR引物进行PCR扩增，结果显示9例正常胃粘膜上皮细胞扩增出了一条699bp的强带，其余6例未见扩增带；8例癌旁上皮细胞扩增出了一条699bp的弱带，其余7例未见扩增带(图2)，Southern杂交进一步证实了RT-PCR的结果(图3)。此外11例正常上皮细胞和10例癌旁上皮细胞均扩出一条141bp的扩增带，前者亮度明显高于后者，而后者亮度又高于癌细胞(图2)，表明Cx43在人胃正常上皮细胞中高水平表达，在癌旁上皮细胞中表达水平下降。
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图2 RT-PCR检测Cx32(左)和Cx43(右)mRNA的表达
M1：pBR322DNA/Msp1；M2：pBR322DNA/BstN1；
N：正常人胃粘膜组织；M：人胃癌细胞株；
A：癌旁组织；C：人胃癌组织
2.4 Cx基因表达情况(详见表2)
表2 胃癌、正常、癌旁上皮细胞及MGC-803细胞的Cx基因表达 基因
表达水平
胃癌
正常
, 百拇医药
癌旁
MGC-803
Cx26
-
-
-
-
Cx31.1
-
-
-
-
Cx32
-
, 百拇医药
+++
+
-
Cx33
-
-
-
-
Cx37
-
+++
+
++
Cx40
, 百拇医药
-
-
-
-
Cx43
+
+++
++
-
Cx46
-
-
-
++
, http://www.100md.com
注：+++为高水平表达，++为中等水平表达，+为低水平表达，-为不表达
图3 Southern杂交检测Cx32RT-PCR产物
N：正常人胃粘膜组织；A：癌旁组织
3 讨论
Cx成员在结构上表现明显的种、系间保守性，其表达分布有一定的专一性。据文献报道，哺乳动物胃正常上皮细胞表达Cx26、Cx32、Cx37、Cx43〔4〕，OhkusaT等〔5〕应用抗Cx32单克隆抗体及免疫荧光技术观察到人正常胃上皮细胞高水平表达而胃癌细胞不表达Cx32。UchidaY等〔6〕亦有类似报道。本研究首次对连接蛋白基因在mRNA水平进行了系统的表达谱研究，发现人胃正常上皮细胞有Cx32、Cx37、Cx43mRNA的高表达；人胃癌细胞除Cx43在mRNA水平上有低水平表达外，其余的连接蛋白基因均无转录活性；Cx37、Cx46在人胃腺癌MGC803细胞株中有一定水平的表达。从人胃正常上皮细胞、癌旁上皮细胞与胃癌细胞及胃腺癌细胞株的配对比较结果，表明Cx32可能是正常人胃上皮细胞间隙连接通道的主要成分，是人胃上皮细胞的特异性表达的Cx基因，其表达对人胃正常上皮细胞的通道功能具有重要作用，它的表达缺失是致胃癌GJIC障碍的主要原因。Cx37、Cx43在正常、癌细胞株或癌组织中均有表达，说明这两种基因不是人胃上皮细胞的特异表达基因，并非人胃正常上皮细胞GJIC的主要成份。Cx46在癌细胞株中有表达而在人胃正常上皮细胞表达缺失的结果，则可解释为在癌变的环境中癌细胞基因组为了突破GJIC的障碍，试图重建细胞间隙连接的一种表达变异。Wilgenbus等〔7〕也曾发现Cx43在正常肝细胞中表达缺失，却在人肝细胞癌中有高水平表达；在成人皮肤组织中不含Cx26，却存在于基底细胞癌组织标本中。这些结果与本研究的结论相似。
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Cx基因是一类新近发现的与细胞增殖、分化和发育密切相关的基因〔7〕。胃癌是发病率极高的一种肿瘤，有极其明显的不同分化阶段，研究Cx基因在胃粘膜上皮不同分化窗口的表达规律，这对于阐明Cx基因对细胞分化与增殖的作用、了解Cx基因表达与细胞分化的关系是一个极好的研究模型。这种研究模型在国内外的同类研究中未见报道，是一个值得研究的领域。本研究表明，Cx32和Cx43在人正常胃粘膜上皮细胞中高水平表达，在癌旁细胞中表达水平下降，Cx32在癌细胞及癌细胞株均不表达，Cx43在癌细胞中有低水平表达，在癌细胞株中无表达。这表明Cx32和Cx43的表达与胃粘膜上皮细胞分化程度相关。人胃癌细胞株表达Cx37与Cx46，而人胃癌细胞不表达Cx37、Cx46，这说明体内、体外细胞生存的环境差异亦可能影响Cx基因的表达水平。本研究未发现Cx基因表达与胃癌的病理分型的相关性，这可能与每一类型的样本数少有关。此外，本研究还存在RTPCR有特异片段而Northern杂交无信号的情况，这可能与RTPCR较Northern杂交技术的灵敏度高有关。
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胃癌细胞中相对特异的Cx基因为什么产生表达缺失和下调，其分子生物学基础是什么?它们的表达受什么机制调控，有哪些因素影响?对这些问题的了解将有助于阐明细胞连接蛋白基因在细胞癌变过程中的作用。目前，我们对此正在进行深入的研究。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39670344)
〔参考文献〕
〔1〕 Naus CC,Zhu D,Todd SD,et al. Characteristics of C6 gliomacells overexpression a gap junction protein〔J〕. Cell Mol Neurobiol,1992,12：163～175.
〔2〕 Paul DL. New functions for gap junctions〔J〕. Curr Opin Cell Biol,1995,7：665～672.
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〔3〕 Mehta PP,Hotz-Wagenblatt A,Rose B,et al. Incorporation of the gene for a cell-cell channel protein into transformed cells leads to normalization of growth〔J〕. J Membr Biol,1991,124：207～225.
〔4〕 Willecke K,Hennemann H,Dahl E,et al.The diversity of connexin genes encoding gap junctional proteins〔J〕. EurJ Cell Biol,1991,56：1～7.
〔5〕 Ohkusa T,Fujiki K,Tamura Y,et al. Freeze-fracture and immunohistochemical studies of gap junctions in human gastric mucosa with special reference to their relationship to gastric ulcer and gastric carcinoma〔J〕. Microsc Res Tech,1995,31：226～233.
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〔6〕 Uchida Y,Matsuda K,Sasahara K,et al. Immunohistochemistry of gap junctions in normal and diseased gastric mucosa ofhumans〔J〕. Gastroenterology,1995,109：1492～1496.
〔7〕 Wilgenbus KK,Kirkpatrick CJ,Knnechel LR,et al.Expression of Cx26,Cx32,Cx43 gap junction proteins in normal and neoplastic human tissues〔J〕. Int J Cancer,1992，51：522～529.
收稿日期：1998-11-02；修回日期：1999-03-24, 百拇医药