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编号:10283936
连接蛋白基因Cx26的一个可能的新启动区

     作者:彭白露 张洵 周鸣 曾朝阳 李桂源

    单位:彭白露(410078长沙,湖南医科大学肿瘤研究所);张洵(410078长沙,湖南医科大学肿瘤研究所);周鸣(410078长沙,湖南医科大学肿瘤研究所);曾朝阳(410078长沙,湖南医科大学肿瘤研究所);李桂源(410078长沙,湖南医科大学肿瘤研究所)

    关键词:Cx26基因启动区;序列测定;CAT报告基因分析

    中华医学遗传学杂志000208 【摘要】 目的 探讨人类连接蛋白基因26(connexin 26,Cx26)的调控机理。方法 对Cx26基因转译起始点上游的一个DNase-1超敏区片段1.6kb进行序列分析和CAT报告基因分析。结果 Cx26-1.6kb片段具有启动子功能。结论 Cx26-1.6kb中含有2个GT盒(分别位于-6158bp和-6213bp),1个TTAAAA盒位于-6237bp,这是在人类Cx26基因中新发现的第2个启动区。

    A new potential promoter region of the human connexin 26 gene*

    PENG Bailu ZHANG Xun ZHOU Ming ZENG Zhaoyang LI Guiyuan

    (Cancer Research Institute,Hunan Medical University, Changsha,Hunan, 410078 P.R. China. E-mail: Ligy@public.cs.hn.cn)

    【Abstract】 Objective To explain regulatory mechanism of the human connexin 26(Cx26) gene. Methods A DNase-1 hypersensitive 1.6kb fragment upstream of the 5′-terminus of the Cx26 gene was sequenced and assayed with CAT reporter system. Results The Cx26-1.6kb sequence serves as a powerful promoter.Conclusion The Cx26-1.6kb fragment contains two GT boxes (centering at -6158 and -6213 bp), and a TATA-less TTAAAA box (-6237/-6232 bp)which is another promoter region of the human Cx26.

    【Key words】 Cx26 gene promoter; sequencing; CAT reporter assay

    连接蛋白基因(connexin gene,Cx gene)是细胞间隙连接蛋白基因。Cx基因是一个多基因家庭,不同的连接蛋白由位于不同染色体上的Cx基因编码[1]。在乳腺内腔上皮细胞中,主要表达的Cx基因是Cx26[2]。用递减杂交技术发现Cx26只在正常乳腺上皮细胞系中表达[3],而在恶性细胞系中不表达,用原位杂交技术对人类乳腺组织进行研究也证实在癌细胞中Cx26的表达下降[4]。将Cx26基因转染到癌细胞中,则抑制其生长,并恢复其分化潜能[5]。所以,Cx26已被看作抑瘤基因的候选者。

    尽管Cx26基因在乳腺发育过程中可能起关键的生理和病理作用,但只有其编码区(外显子2)在小鼠、大鼠 和人类中得到深入研究[6],对人类乳腺癌中Cx26基因调控的研究由于缺乏其全长序列而受到制约,为此李桂源等[7]克隆了人类Cx26基因gDNA序列,并对ATG起始点上游-4800bp进行了序列测定和功能研究,绘制出了人类Cx26基因的图谱。

    我们利用在克隆的人类Cx26基因全长gDNA材料,对Cx26基因ATG起始点上游-4800bp之前的一个1.6kb的DNase-1超敏区片段进行研究,期望进一步阐明人类Cx26基因的调控机理。

    1 材料与方法

    1.1 材料 乳腺癌细胞株MDA-MB-134从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,Rockville,MD)获得。DNA限制性内切酶和修饰酶购自Promega公司,脂质体转染剂Lipofectamine为Gibco/BRL产品,乙酰-CoA购自Sigma公司,14C-氯霉素购自杜邦公司(Dupont,NEN,美国)。

    1.2 方法

    1.2.1 质粒DNA的纯化与序列测定 人类Cx26基因转译起始位点上游-6.4kb~-4.8kb的1.6kb序列已克隆在pGEM-4Z质粒载体中。质粒经扩增,用碱裂解法抽提DNA后经PEG8000纯化,溶于适量TE中。测定吸光度A260(旧称光密度OD)以确定其浓度,经琼脂糖凝胶电泳确定其纯度。样品在全自动测序仪(全自动荧光测序仪377型,美国PE公司)上测序。在联网Internet中运用Basic blast程序与目前所有已知的核苷酸序列进行同源匹配,以确定所测序列是否为新序列。

    1.2.2 pCAT vector-Cx26-1.6kb重组体的构建 将Cx26-1.6kb分别与pCAT enhancer vector和pCAT promoter vector重组,以分别观察其启动功能和增强功能。 采用平端连接,则可构建插入片段具有不同插入方向的重组体。用来自pGEM-4Z亚克隆的Cx26-1.6kb片段,分别平端连接、重组到pCAT enhancer vector和pCAT promoter vector的多克隆位点处的XbaⅠ位点中。转化后挑选单菌落扩增,用DNA限切酶鉴定阳性转化子及重组体类型。

    1.2.3 脂质体介导重组体DNA转染哺乳细胞 10 cm平皿中培养的MDA-MB-134乳腺癌细胞达80%汇合时用于脂质体介导的重组体DNA转染。在少量无血清培养基中混合重组体DNA和脂质体以形成DNA-脂质体复合物。细胞经洗涤后加入DNA-脂质体复合物。37℃培养数小时后,洗去DNA-脂质体复合物,换上新鲜完全培养基,继续培养至收获。

    1.2.4 CAT报告基因分析 经重组体DNA转染的MDA-MB-134乳腺癌细胞培养48 h后离心收获细胞,细胞悬浮在少量0.25mol/L Tris.Cl pH7.5中,经历3次冻融循环后,离心沉淀,取上清,获得细胞抽提物。细胞抽提物经65℃加热10 min以失活内源乙酰辅酶A。在反应管中加入14C-氯霉素,acetyl-CoA,转染细胞抽提物及缓冲溶液以建立CAT反应系统。37℃温育约2 h后,用乙酸乙酯抽提乙酰化氯霉素,真空抽干后溶于少量乙酸乙酯中,各样品点样在硅胶薄层层析板距底缘2 cm高处,晾干后在氯仿∶甲醇(95∶5)中层析约1 h。层析板晾干后放射自显影3 d。

    2 结果

    Cx26基因5′-端上游1.6kb克隆于pGEM-4Z EcoRⅠ/Pst Ⅰ位点上。质粒DNA经纯化后,经全自动荧光测序仪测定,其DNA核苷酸序列见图1。将图1中的Cx26-1.6kb序列在联网Internet中运用Basic blast程序与目前所有已知的核苷酸序列进行同源匹配,得到最大Score值为42,最小P(N)为0.26,按两序列间Score值>200,P(N)<0.05为有意义同源性比较,则Cx26-1.6 kb为一新序列,此序列在Genbank中的登录号为AF091526。

    载体pCAT promoter vector和pCAT enhancer vector用Xba Ⅰ线性化并进行去磷酸化反应,从亚克隆中酶切、电泳回收Cx26-1.6kb片段后,均用Klenow大片段补齐粘末端。Cx26-1.6kb分别与pCAT promoter vector和pCAT enhancer vector连接,经转化、筛选,获得按正方向插入的pCAT promoter-Cx1.6 kb重组体(PF),按反方向插入的pCAT promoter-Cx1.6 kb(PR),按正方向插入的pCAT enhancer-Cx1.6 kb重组体(EF),和按反方向插入的 pCAT enhancer -Cx1.6kb (ER)。这四种重组体的限切酶鉴定见图2。各重组体DNA经脂质体介导转染到MDA-MB-134乳腺癌细胞株中,经培养、收获细胞后,进行CAT反应。CAT反应产物通过薄层层板(图3)。如图3所示,ER转染抽提物具有强烈的CAT活性,说明Cx26-1.6 kb具有强烈的启动子功能。ER作为Cx26-1.6kb在pCAT enhancer vector中反向插入的重组体而表现出要求正向顺序才具有的启动功能,说明Cx26-1.6 kb原本是反向亚克隆在pGEM-4Z载体中的。而与此插入方向相反者EF的CAT活性小得多,此1.6kb片段也没有表现出增强子功能。据此,图1中的DNA序列即是按功能方向排列的。

    图1 人类Cx26基因ATG转译起始点远端上游1.6kb的DNA序列(A)和人类Cx26基因的结构简图(B) 有下划线部分为TATA-less TTAAAA box和GT boxes

    Fig 1 1.6 kb DNA sequence located 5′upstream of ATG translation start site of the human Cx26 gene(A) and map of the human Cx26 gene(B) The sequence of TATA-less TTAAAA box and GT boxes are underlined

    图2 pCAT vector-Cx1.6重组体的鉴定 1:PF/XbaⅠ+PstⅠ;2:PR/XbaⅠ+PstⅠ;3:EF/XbaⅠ+PstⅠ;4:ER/XbaⅠ+PstⅠ;5:λDNA/HindⅢ+pGEM 7Zf(+)/HaeⅢ markers

    Fig 2 Identification of pCAT vector-Cx1.6 recombinants 1:PF/XbaⅠ+PstⅠ;2:PR/XbaⅠ+PstⅠ;3:EF/XbaⅠ+PstⅠ;4:ER/XbaⅠ+PstⅠ;5:λDNA/HindⅢ+pGEM 7Zf(+)/HaeⅢ markers

    图3 Cx26-1.6kb的CAT报告基因分析

    1:pCAT enhancer vector;2:PF;3:PR;4:EF;5:ER;6:pCAT control vector

    Fig 3 CAT reporter assay of Cx26-1.6kb 1:pCAT enhancer vector;2:PF;3:PR;4:EF;5:ER;6:pCAT control vector

    3 讨论

    连接蛋白26(Cx26)是乳腺上皮细胞中主要的间隙连接蛋白,其编码基因已被看作一个肿瘤抑制基因。尽管乳腺癌细胞株中Cx26的表达是下调的[3,4],但泌乳期间其表达上调[2]。因此,Cx26基因可能在乳腺发育中起重要的病理生理作用。

    到目前为止,在对人类Cx26基因外显子2序列进行了描述的基础上[6],Kiang等[8]用cDNA克隆和引物延伸技术对Cx26上游的4.8kb片段进行了作图和测序。分析发现此片段含有启动子区、转译起始点、外显子1和内含子1。CAT报告基因分析结果表明,启动CAT活性的DNA序列在直接靠近转译起始点上游-120 bp范围内。此片段含有非TATA 的TTAAA盒(-24/-19 bp)、3个GC盒(位于-40 bp、-78 bp和-90 bp)、及2个GT盒(GGGGTG,位于-39 bp和-37 bp)。这些结构完全可以与小鼠Cx26基因的启动子区相类比。

    按本文CAT报告基因分析结果(图3),Cx26-1.6 kb片段具有启动子功能。对此1.6 kb片段的核苷酸序列进行分析,发现它含有2个GT盒(位于-6158 bp和-6213 bp),一个非TATA 的TTAAA盒(位于-6237/-6232 bp处)。GT盒是SP3潜在的结合位点,而TTAAAA盒是典型的真核启动子序列之一。这些分析结果支持了Cx26-1.6 kb具有启动子功能这一事实。与小鼠中的情形一样[6],人类Cx26基因的转录产物也有两种大小的mRNA分子,研究者们认为这不大可能由交替剪接造成,而是可能有另外的转录启始点[8]。我们的研究结果为此推测提供了良好的证据,并使我们更为完整地得到了Cx26基因的gDNA序列,更为全面地完整地把握了Cx26基因的顺式调控元件。

    基金项目:国家自然科学基金(39680031)

    参考文献

    [1]Haefliger JA,Bruzzone R,Jenkis NA,et al.Four novel members of the connexin family of gap junction protein.J Bio Chem,1992,267(3)∶2057-2064.

    [2]Pozzi A,Risek B,Kiang DT,et al.Analysis of multiple gap junction gene products in the rodent and human mammary gland.Exp Cell Res,1995,220(1)∶212-219.

    [3]Lee SW,Tomasetto C,Sager R.Positive selection of candidate tumor suppressor gene by substractive hybridization.Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88(7)∶2825-2829.

    [4]Kiang DT,Jin N,Lin HH.Gene expression of gap junction proteins in benign and malignant human breast tissues.Proc Am Assoc Cancer Res,1994,35∶276.

    [5]Hirschi KK,Xu C,Tsukamoto T,et al.Gap junction gene Cx26 and Cx43 individually suppress the cancer phenotype of human mammary carcinoma cells and restore differentiation potential.Cell Growth Diff,1996,7(7)∶861-870.

    [6]Lee SW,Tomasetto C,Paul D,et al.Transcriptional down regulation of gap-junction proteins blocks junctional communication in human mammary tumor cell lines.J Cell Biol,1992,118(5)∶1212-1221.

    [7]Li GY, Lin HH,Zheng JT,et al.Gap junction Cx26 gene modulation by phorbol esters in benign and malignant human mammary cells.Gene,1998,209(1-2)∶139-147.

    [8]Kiang DT,Ni J,Zheng JT,et al.Upstream genomic sequence of the human connexin 26 gene.Gene,1997,199(1-2)∶165-171.

    收稿日期:1999-04-13
    婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柟闂寸绾惧潡鏌熺€电ǹ孝缂佽翰鍊濋弻锕€螣娓氼垱锛嗗┑鐐叉▕娴滄繈宕戦幇鐗堝仯闁搞儺浜滈惃鐑樸亜閿旇骞栭柍瑙勫灴閹晝绱掑Ο濠氭暘婵犵數鍋涢惇浼村磹濠靛鈧礁顫濋懜鐢靛姸閻庡箍鍎卞Λ娑㈠储閸楃偐鏀介柣鎰綑閻忋儳鈧娲﹂崜鐔奉嚕閹间礁围闁糕剝鍔掔花濠氭⒑閸愬弶鎯堥柛鐕佸亰瀹曘垽骞橀鐣屽幐闁诲繒鍋涙晶浠嬪煡婢舵劖鐓冮柦妯侯樈濡偓閻庤娲╃换婵嬪箖濞嗗浚鍟呮い鏂剧矙閻涘酣姊婚崒娆戭槮闁圭⒈鍋婅棟妞ゆ劧绠戦悿鐐節婵犲倸鎮╂繛鎴欏灩缁€鍐┿亜閺冨洤顥嶉柟鑺ユ礀閳规垿鎮欓弶鎴犱桓闁艰¥鍊濋弻锛勨偓锝庝邯閸欏嫰鏌i幙鍐ㄤ喊鐎规洖鐖兼俊鎼佹晝閳ь剟鎯冮幋锔解拺缂佸顑欓崕鎰版煙濮濆苯鍚圭紒顔碱儔楠炴帡寮崫鍕闂佹寧绻傜花鑲╄姳娴犲鐓曢柡鍐╂尵閻h鲸銇勯鍕殻濠碘€崇埣瀹曞崬螖閳ь剙岣块幋锔解拺缂佸顑欓崕鎰版煙閻熺増鍠樼€殿喛顕ч埥澶愬閳ュ厖姹楅柣搴ゎ潐濞叉牕煤閵忋倕鐒垫い鎺嶇缁楁艾菐閸パ嶈含鐎规洩绲惧鍕節閸屻倖缍嬮梻鍌欑閻ゅ洭锝炴径鎰瀭闁割煈鍠氶弳锕傛煕椤愶絾绀€闁绘挻锕㈤弻锝夊箛闂堟稑顫繛瀛樼矋閻熲晛顫忛搹瑙勫珰闁哄被鍎洪埀顒侇殘缁辨帡鎮╅懠顑呪偓瑙勬礃濞茬喎鐣烽敓鐘冲€风€广儱妫涢埥澶愭煃閽樺妯€濠殿喒鍋撻梺缁橈耿濞佳勬叏閿旀垝绻嗛柣鎰典簻閳ь剚鐗滈弫顕€骞掑婵嗘喘椤㈡盯鎮欓弶鎴斿亾閸洘鐓ラ柡鍐ㄥ€婚幗鍌涚箾閸粎鐭欓柡宀嬬秮楠炲洭顢楁担鍙夌亞闂備胶枪鐎涒晛顫忚ぐ鎺嬧偓鍐Ψ閳哄倸鈧兘鏌涘▎蹇fЦ闁哄濮撮—鍐Χ閸愩劎浠惧┑鈽嗗亜閸燁偊鎮鹃悜钘壩╅柍鍝勶攻閺咃綁姊虹紒妯哄婵炰匠鍥х缂佸绨遍弨浠嬫煟濡櫣浠涢柡鍡忔櫊閺屾稓鈧綆鍓欓埢鍫燁殽閻愬瓨宕屾い銏℃瀹曞崬螖閸愵亞鎽岄梻鍌欐祰椤曟牠宕规總鍛婂€堕柟閭﹀劒濞差亶鏁傞柛鏇ㄥ弾閸氬懘姊绘担铏瑰笡闁挎岸鏌涘锝呬壕缂傚倷鐒﹂〃鍛此囬棃娑辨綎婵炲樊浜滅粻浼村箹鏉堝墽鎮奸柣锝囨暬濮婃椽鎮烽弶鎸幮╁銈嗗灥椤︻垶鎮鹃悜鑺ュ仺缂佸娼¢崬璺衡攽閻橆喖鐒哄ù婊勭箓铻為柛鎰靛枛閺嬩線鏌涚仦鍓х煂濡炶濞婇幃妤呮晲鎼存繄鐩庢繝纰樷偓鐐藉仮婵﹦绮幏鍛村川婵犲啫鏋戦梻浣呵归鍥磻閵堝宓侀柟鐗堟緲缁狀噣鏌﹀Ο渚Ъ闁硅姤娲熷娲传閸曨剙鍋嶉梺鎼炲妼缂嶅﹪鎮伴鈧慨鈧柕鍫濇閸樻悂姊洪幖鐐插姉闁哄懏绋戦悺顓炩攽閻樻鏆柍褜鍓濈亸娆撴儗濞嗘挻鐓涚€光偓鐎n剛袦婵犳鍠掗崑鎾绘⒑鐎圭姵銆冮柤瀹犲煐缁傛帡鍩¢崘顏嗭紳闂佺ǹ鏈銊ョ摥闂備焦瀵уú锔界椤忓牊鍋樻い鏃傛櫕缁♀偓闂佹悶鍎崝宥呪枍閵忋倖鈷戠紓浣广€掗崷顓濈剨婵炲棙鎸婚崑顏堟煃瑜滈崜姘┍婵犲洦鍊锋い蹇撳閸嬫捇寮介鐐殿唶婵°倧绲介崯顐ゅ婵犳碍鐓熼柡鍌涘閹插憡銇勯埡鍐ㄥ幋闁哄瞼鍠栭獮宥夘敊绾拌鲸姣夐梻浣瑰▕閺€閬嶅垂閸ф钃熸繛鎴欏灪閺呮粓鎮归崶銊ョ祷缂佹鐭傚娲嚒閵堝懏鐎鹃梺闈╃稻濞兼瑧鍙呭銈呯箰鐎氣偓鐟滄棃寮诲☉銏犖ㄦい鏃€鍎崇敮銉モ攽閻愯泛浜归柛鐘崇墪椤繐煤椤忓嫮顦ㄩ梺鍛婄懃椤︿即宕曢幘缁樷拺闁荤喐婢橀弳杈ㄦ叏濮楀牆顩柟骞垮灩椤繈鎳滅喊妯诲濠电偠鎻徊浠嬪箠濞嗘帇浜归柟鐑樺灥閻濇ê顪冮妶鍡楃瑨闁稿﹤顭烽幆灞解枎閹惧鍘甸梺缁樺灦閿曗晛鈻撻弴銏$厱濠电姴鍊绘禒娑㈡煏閸パ冾伃鐎殿噮鍓熷畷褰掝敊鐟欏嫬鐦辩紓鍌欒兌閸嬫捇宕曢幎钘壩ч柟闂寸閽冪喖鏌ㄩ悢鍝勑㈢紒鈧崘顔界厪濠电偛鐏濋崝妤呮煕鐎n偅灏电紒顔界懇楠炴劖鎯旈姀銏☆潠濠电姷鏁告慨鐑藉极閸涘﹥鍙忔い鎾卞灩缁狀垶鏌涢幇闈涙灈缂佲偓鐎n喗鐓曟い顓熷灥娴滅偤鏌℃径濠勭Ш闁哄矉绲鹃幆鏃堝閳轰焦娅涢梻浣告憸婵敻鎮ч悩璇茬畺闁靛鏅滈崑鍌炲箹鏉堝墽绋绘繛鍫熷劤閳规垿顢欐慨鎰捕闂佺ǹ顑嗛幐鎼佸煘閹达箑鐒洪柛鎰典簼閹叉瑥顪冮妶蹇涙濠电偛锕璇测槈閵忕姷顔掗梺鍝勵槹閸ㄨ绂掗崫銉х=濞达綀娅g敮娑氱磼鐎n偅宕岄柛鈹惧亾濡炪倖甯婇懗鍫曞煀閺囩偟鏆嗛柨婵嗘噺閸嬨儵鏌熼姘拱缂佺粯绻堝畷鎴︽嚍閵夛富妫冮梺璇″枓閺呯姴鐣烽敐鍡楃窞閻庯綆浜濋悗楣冩⒒閸屾瑦绁版俊妞煎妿濞嗐垽鏁撻悩鏌ユ7闂佹寧绻傞ˇ顓㈠焵椤戣法绐旂€殿喗鎸虫慨鈧柍鈺佸暞閻濇洟姊绘担钘壭撻柨姘亜閿旇法鐭欓柛鈹惧亾濡炪倖甯婇懗鍫曞煡婢舵劖鐓冮悷娆忓閻忔挳鏌℃担鍝バх€规洜鍠栭、鏇㈡晬閸曨剙绀嬪┑鐘垫暩婵參骞忛崘顔煎窛妞ゆ梻鏅ぐ褏绱撻崒娆戣窗闁哥姵顨婇幃鐑芥晜閻愵剙搴婂┑鐘绘涧椤戝懘鎮欐繝鍥ㄧ厪濠电倯鍐ㄦ殭缂佺姷澧楃换婵嬫偨闂堟刀鐐烘煕閵娧冨付闁崇粯鏌ㄩ埥澶愬閳╁啯鐝栭梻渚€娼ч悧鍡浰囬姣垦囧蓟閵夛妇鍘搁梺鎼炲劗閺呮盯寮搁幋锔界厱婵炲棗绻掔粻濠氭煛瀹€瀣М闁诡喓鍨介幃鈩冩償濠靛棙鐎冲┑鐘殿暯濡插懘宕归鍫濈;闁瑰墽绮埛鎺懨归敐鍫澬撻柕鍡楀暟缁辨帡鍩€椤掍焦濯撮柧蹇撴贡閻撳姊洪崷顓℃闁哥姵顨婂畷鎴﹀煛閸屾粎鐦堥梻鍌氱墛娓氭宕曡箛鏇犵<闁逞屽墴瀹曟﹢鍩炴径鍝ョ泿婵$偑鍊栭幐楣冨窗鎼淬劍鍊堕柨婵嗩槹閻撴瑩鎮楅悽鐧诲綊宕㈢€涙ɑ鍙忓┑鐘插鐢盯鏌熷畡鐗堝櫧缂侇喚鏁搁埀顒婄秵娴滄繈鎮炬导瀛樷拻濞达絽鎲¢幉绋库攽椤旂偓鏆鐐村灴瀹曟儼顦撮柡鍡檮缁绘繈妫冨☉鍐插闂佹眹鍊愰崑鎾寸節閻㈤潧浠﹂柛銊ュ悑閵囨棃骞栨担鍝ユ煣闂佹寧绻傚ú銊у娴犲鐓曢悘鐐插⒔閹冲懘鏌涢弬璺ㄐ㈤柣锝嗙箞閺佹劙宕ㄩ闂存樊闂備胶纭堕弬鍌炲垂閽樺鍤曟い鏇楀亾鐎规洖銈搁幃銏ゅ传閸曨偆顔戦梻鍌氬€烽懗鍫曞箠閹炬椿鏁嬫い鎾卞灩绾惧潡鏌熺€电ǹ浠ч柣鐔活潐缁绘盯骞嬪▎蹇曚痪闂佺粯鎸诲ú鐔煎蓟閿熺姴纾兼慨妯哄綁閾忓酣姊洪崫鍕紨缂傚秳绶氬濠氬灳瀹曞洦娈曢柣搴秵閸撴盯鎯侀崼銉﹀€甸悷娆忓缁€鍐偨椤栨稑娴柨婵堝仜閳规垹鈧絽鐏氶弲锝夋⒑缂佹﹫鑰挎繛浣冲洨宓侀柍褜鍓涚槐鎾诲磼濮橆兘鍋撻幖浣哥9闁绘垼濮ら崐鍧楁煥閺囩偛鈧爼鍩€椤掆偓閸熸潙鐣烽妸銉桨闁靛牆鎳忛崰姗€鏌$仦鑺ヮ棞妞ゆ挸銈稿畷銊╊敍濮橆儷鏇炩攽閿涘嫬浜奸柛濠冪墱閺侇噣骞掑Δ鈧粣妤佹叏濮楀棗鍘崇紓鍌涘哺閺岀喖鏌囬敃鈧弸銈囩棯閹冩倯闁靛洤瀚板顕€宕惰濮规绱撴担鍝勑㈡い顓犲厴瀵濡搁妷銏℃杸闂佸壊鍋呯换鈧俊鍙夊姍濮婄儤娼幍顕呮М闂佸摜鍠愬ḿ娆撴偩閻戣棄绠抽柟鎼幗閸嶇敻姊洪崨濠庢畼闁稿鍋ら獮澶愬閵堝棌鎷绘繛杈剧秬濡嫰宕ラ悷鎵虫斀闁绘劏鏅涙禍鍓х磽閸屾艾鈧悂宕愯ぐ鎺撳殞濡わ絽鍟悡婵堚偓骞垮劚椤︿即寮查弻銉︾厱闁靛鍨哄▍鍥煟閹炬剚鍎旀慨濠冩そ瀹曟粓鎳犻鈧敮銉╂⒑閸濄儱校闁圭懓娲畷娲焵椤掍降浜滈柟鍝勭Ф椤︼妇绱掑Δ浣哥瑲闁靛洤瀚伴、鏇㈡晲閸モ晝鏉芥俊鐐€戦崹娲晝閵忋倕绠栭柍鍝勬媼閺佸啴鏌ㄥ┑鍡楊劉缂傚秴鐭傚濠氬磼濮橆兘鍋撴搴㈩偨婵﹩鍏楃紓姘辨喐瀹ュ洤寮查梻渚€娼ч悧鍡涘箖閸啔娲敂閸曞簶鏅犻弻宥嗘姜閹峰苯鍘¢梺鍛婃缁犳垿鈥旈崘顔嘉ч柛鈩冾殘閻熴劑姊虹粙娆惧剰婵☆偅绻傞锝夊Ω閳哄倸浜遍梺鍓插亖閸ㄥ顢欓弴鐔虹瘈闁靛骏绲剧涵鐐亜閹存繃鎼愰悡銈夋倵閻㈢數銆婇柛瀣尵閹叉挳宕熼鍌︾喘闂備焦鎮堕崝蹇旀叏閵堝棛鈹嶅┑鐘叉搐闁卞洭鏌¢崶鈺佷户闁稿﹦鍋ゅ娲濞淬劌缍婂畷鏇㈡倻濡警鍤ら梺鍝勬储閸ㄦ椽鎮¢悢鍏肩厽闁哄倹瀵ч幉鎼佹煟椤撶偠瀚版い顓″劵椤﹁櫕銇勯妸銉уⅵ鐎殿噮鍋婇、娆撳床婢跺顥堢€规洦浜畷姗€顢旈崱蹇旓紙濠电姷鏁告慨浼村垂婵傜ǹ鏄ラ柡宥庡幖缁€澶愭煛瀹ュ骸骞栫痪鎯ь煼閺屻劌鈹戦崱鈺傂ч梺缁樻尰濞茬喖寮婚弴鐔风窞婵☆垵娅f禒鈺侇渻閵堝倹娅撻柛鎾寸懇閸┿儲寰勯幇顒傤啋闂佽崵鍠愭竟鍡椥掗姀銏㈢=濞达絼绮欓崫娲偨椤栨侗娈斿畝锝堝劵缁犳稑鈽夊Ο婧炬櫇閹叉瓕绠涘☉娆忎患婵犻潧鍊搁幉锟犲煕閹寸姵鍠愰柣妤€鐗嗘穱顖涗繆椤愶絽鐏ラ柍瑙勫灴閹瑩鍩℃担宄邦棜闂傚倸鍊峰ù鍥敋閺嶎厼绐楁俊銈呭暙閸ㄦ繈鏌熼幑鎰靛殭缂佺姵婢橀埞鎴︽偐閹绘帗娈紓浣稿閸嬫盯鈥︾捄銊﹀磯闁惧繐婀辨导鍥р攽椤旂》鍔熼柛瀣尵閹广垹鈹戠€n偄浠洪梻鍌氱墛缁嬫劗鍒掔捄渚富闁靛牆妫欐径鍕煕濡湱鐭欐鐐茬墦婵℃悂鏁傞崫鍕凹闂備礁鎲¢崝鎴﹀礉瀹ュ憘锝夘敆閸曨兘鎷洪梺鍛婄箓鐎氼噣鍩㈡径鎰厱婵☆垱浜介崑銏⑩偓瑙勬礀缂嶅﹤鐣烽幒妤佸€烽悗鐢登圭敮鎯р攽閻樺灚鏆╅柛瀣枛瀹曟垿骞橀弬銉︾€洪梺绯曞墲缁嬫帡鎮¢弴銏″€甸柨婵嗗暙婵$厧鈹戦垾鐐藉仮婵☆偂鐒﹀鍕箛椤撶姴寮虫繝鐢靛█濞佳兾涘▎鎾抽棷鐟滅増甯楅悡娑㈡煕閳╁啰鎳冮柡瀣灥鑿愰柛銉戝秷鍚銈冨灪缁嬫垿锝炲┑瀣闁绘劏鏅涘宥呪攽閻樻剚鍟忛柛鐘崇墵閺佸啴濡烽妷顔藉瘜婵炲濮撮鍐焵椤戣法绐旂€殿喗鎸虫慨鈧柍鈺佸暞閻濇娊姊绘担铏广€婇柛鎾寸箞閹兘鏁冮崒銈嗘櫍婵犵數濮电喊宥夊煕閹烘嚚褰掓晲閸噥浠╅柣銏╁灡閻╊垶寮婚悢鍝勬瀳闁告鍋樼花浠嬫⒑閻熸壆鐣柛銊ョ秺閸╃偤骞嬮悩顐壕闁挎繂楠告晶顔剧磼娓氬﹦鐣甸柡宀嬬稻閹棃顢涘⿰鍛咃綁姊洪崫銉バi柣妤佺矌閸掓帗绻濆顓熸珳闂佺硶鍓濋悷褔鎯侀崼鐔虹瘈闁汇垽娼у瓭闂佺ǹ锕ラ幃鍌炪€侀弮鍫晝闁挎梻鏅崢鐢告⒑閸濆嫷鍎涢柛瀣閹便劑宕掑☉娆忓伎婵犵數濮撮崯顖炲Φ濠靛浂娈介柣鎰綑婵牓鏌熼娑欘棃闁轰焦鍔欏畷鎺戔槈鏉堛劎绉鹃梻鍌氬€搁崐椋庣矆娓氣偓楠炴牠顢曢敂钘変罕濠电姴锕ら悧鍡欑矆閸儲鐓熼柡鍐ㄧ墱濡垿鏌¢崱顓犵暤闁哄矉缍侀幃銏㈢矙濞嗙偓顥撻梻浣稿閸嬫帗绂嶉鍫濊摕婵炴垯鍨归崡鎶芥煏婵炲灝鍔氶悗娑崇到閳规垿鎮欑€涙ḿ绋囬柣搴㈠嚬閸撶喖鍨鹃弮鍫濈妞ゆ柨妲堣閺屾盯鍩勯崘鐐暭闂佽崵鍠愰崝娆忣潖閾忓湱纾兼俊顖涙そ閸ゅ绱撴担鍝勑i柟鍛婃倐椤㈡岸鏁愭径濠勵唴缂備焦绋戦鍡涘疾濠婂牊鈷戦柛鎾村絻娴滅偤鏌涢悩铏磳鐎规洏鍨介弻鍡楊吋閸″繑瀚奸梻浣藉吹閸犳挻鏅跺Δ鍛畾闁割偁鍨荤壕鐓庮熆鐠轰警鍎愮紓宥嗗灴閺岋綁鏁愰崶銊︽瘓閻庤娲栧畷顒勫煡婢跺ň鏋庨柟瀛樼箓缁楁岸姊洪懡銈呮瀾缂侇喖绉堕崚鎺楀箻瀹曞洦娈惧┑鐘诧工閸犳艾岣块埡鍌樹簻闁圭儤鍩堝Σ褰掓煕瀹ュ洦鏆慨濠冩そ濡啫霉閵夈儳澧︾€殿喗褰冮オ浼村醇濠靛牞绱遍梻浣呵归惉濂稿磻閻愮儤鍋傞柕澶嗘櫆閻撶喖鏌¢崒娑橆嚋闁诡垰鐗忛埀顒佺⊕缁诲牓寮婚敐澶嬪亜闁告縿鍎查崵鍌滅磽娴e搫校闁圭懓娲幃浼搭敋閳ь剙顕f禒瀣垫晣闁绘劖顔栭崯鍥ㄤ繆閻愵亜鈧牠骞愭ィ鍐ㄧ;闁绘柨鎽滈々閿嬨亜閺嶃劎鐭岀痪鎹愭闇夐柨婵嗘缁茶霉濠婂懎浜剧紒缁樼箞婵偓闁挎繂妫涢妴鎰版⒑閹颁礁鐏℃繛鍙夌箞婵$敻骞囬弶璺唺闂佺懓顕刊顓炍i鐐粹拻濞达絽鎳欓崷顓熷床婵°倕鎳庣壕濠氭煙闁箑鍘撮柡瀣閺屾洟宕煎┑鎰ч梺鎶芥敱閸ㄥ湱妲愰幘瀛樺閻犳劦鍨崇槐鎵磽娴e搫校闁绘濞€瀵鏁愭径濠勫幐婵犵數濮撮崐缁樼閳哄懏鈷戝ù鍏肩懅閹ジ鏌涜箛鏃撹€跨€殿噮鍋婇獮妯肩磼濡桨姹楅梻浣藉亹閳峰牓宕滈敃鈧嵄濞寸厧鐡ㄩ埛鎺懨归敐鍫燁棄濞存粌缍婇弻宥呯暋閹殿喖鈪甸悗瑙勬礃缁矂锝炲┑鍥风矗婵犻潧娲﹀▍鎾绘⒒娴d警鏀伴柟娲讳邯濮婁粙宕熼姘卞幈闂佺鎻梽鍕磻閿濆鐓曢柕澶樺灣瀹€娑㈡煕鐎n偅宕岄柟鐓庣秺椤㈡洟濡堕崟顓熷瘻闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓楠炲鏁撻悩鑼舵憰闂侀潧饪电€靛苯鈻撴禒瀣厵闂傚倸顕ˇ锕傛煟閹惧绠為柡宀€鍠栭獮鎴﹀箛闂堟稒顔勭紓鍌欒兌婵绱炴笟鈧濠氭晲婢跺﹦鐤€濡炪倖鎸鹃崰鎾剁矙閸パ屾富闁靛牆鎳庨銏ゆ煙閸涘﹥鍊愰柛鈺冨仱楠炲鏁傞挊澶夋睏闂佽崵濮村▔褔宕樿閻姊婚崒娆戭槮闁硅姤绮撳畷鎶藉Ψ閳轰礁鐎梺鍓插亝濞叉粌鐣垫笟鈧弻娑㈠焺閸愵亖妲堢紒鐐劤閸氬骞堥妸鈺傛櫜閹肩补鈧磭顔愮紓鍌氬€哥粔鎾晝椤忓牏宓侀柛鎰靛枛閻撴盯鏌涘☉鍗炲箻妞ゆ柨鐭傚娲捶椤撶偛濡虹紓浣筋嚙閸婅绌辨繝鍥ㄧ叆閻庯綆鍓涢惁鍫ユ⒑濮瑰洤鐏叉繛浣冲棌鍙撮梻鍌欒兌鏋い鎴濇楠炴垿宕堕鈧拑鐔兼煟閺傝法娈遍柡瀣閺屾盯鈥﹂幋婵囩亶闂佽绻戦幐鍓ф閹烘挶鍋呴柛鎰典簽閺嗩偆绱撴担鍝勑i柣妤冨Т椤曪絾绻濆顓炰簻闁荤偞绋堥埀顒€鍘栨竟鏇㈡⒑濮瑰洤鐏繛鍛劦閹兘鎮ч崼鐔烘闂傚倷娴囧畷鐢稿窗閹邦喖鍨濋幖娣灪濞呯姵淇婇妶鍛櫤闁稿鍊块弻銊╂偄閸濆嫅銏ゆ煢閸愵亜鏋戠紒缁樼洴楠炲鈻庤箛鏇氭偅缂傚倷鑳舵慨鍨箾婵犲洤钃熼柨鐔哄Т绾惧吋鎱ㄥΟ鍧楀摵闁汇劍鍨垮娲传閸曢潧鍓伴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