连接蛋白基因Cx26的一个可能的新启动区
作者:彭白露 张洵 周鸣 曾朝阳 李桂源
单位:彭白露(410078长沙,湖南医科大学肿瘤研究所);张洵(410078长沙,湖南医科大学肿瘤研究所);周鸣(410078长沙,湖南医科大学肿瘤研究所);曾朝阳(410078长沙,湖南医科大学肿瘤研究所);李桂源(410078长沙,湖南医科大学肿瘤研究所)
关键词:Cx26基因启动区;序列测定;CAT报告基因分析
中华医学遗传学杂志000208 【摘要】 目的 探讨人类连接蛋白基因26(connexin 26,Cx26)的调控机理。方法 对Cx26基因转译起始点上游的一个DNase-1超敏区片段1.6kb进行序列分析和CAT报告基因分析。结果 Cx26-1.6kb片段具有启动子功能。结论 Cx26-1.6kb中含有2个GT盒(分别位于-6158bp和-6213bp),1个TTAAAA盒位于-6237bp,这是在人类Cx26基因中新发现的第2个启动区。
A new potential promoter region of the human connexin 26 gene*
PENG Bailu ZHANG Xun ZHOU Ming ZENG Zhaoyang LI Guiyuan
(Cancer Research Institute,Hunan Medical University, Changsha,Hunan, 410078 P.R. China. E-mail: Ligy@public.cs.hn.cn)
【Abstract】 Objective To explain regulatory mechanism of the human connexin 26(Cx26) gene. Methods A DNase-1 hypersensitive 1.6kb fragment upstream of the 5′-terminus of the Cx26 gene was sequenced and assayed with CAT reporter system. Results The Cx26-1.6kb sequence serves as a powerful promoter.Conclusion The Cx26-1.6kb fragment contains two GT boxes (centering at -6158 and -6213 bp), and a TATA-less TTAAAA box (-6237/-6232 bp)which is another promoter region of the human Cx26.
【Key words】 Cx26 gene promoter; sequencing; CAT reporter assay
连接蛋白基因(connexin gene,Cx gene)是细胞间隙连接蛋白基因。Cx基因是一个多基因家庭,不同的连接蛋白由位于不同染色体上的Cx基因编码[1]。在乳腺内腔上皮细胞中,主要表达的Cx基因是Cx26[2]。用递减杂交技术发现Cx26只在正常乳腺上皮细胞系中表达[3],而在恶性细胞系中不表达,用原位杂交技术对人类乳腺组织进行研究也证实在癌细胞中Cx26的表达下降[4]。将Cx26基因转染到癌细胞中,则抑制其生长,并恢复其分化潜能[5]。所以,Cx26已被看作抑瘤基因的候选者。
尽管Cx26基因在乳腺发育过程中可能起关键的生理和病理作用,但只有其编码区(外显子2)在小鼠、大鼠 和人类中得到深入研究[6],对人类乳腺癌中Cx26基因调控的研究由于缺乏其全长序列而受到制约,为此李桂源等[7]克隆了人类Cx26基因gDNA序列,并对ATG起始点上游-4800bp进行了序列测定和功能研究,绘制出了人类Cx26基因的图谱。
我们利用在克隆的人类Cx26基因全长gDNA材料,对Cx26基因ATG起始点上游-4800bp之前的一个1.6kb的DNase-1超敏区片段进行研究,期望进一步阐明人类Cx26基因的调控机理。
1 材料与方法
1.1 材料 乳腺癌细胞株MDA-MB-134从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,Rockville,MD)获得。DNA限制性内切酶和修饰酶购自Promega公司,脂质体转染剂Lipofectamine为Gibco/BRL产品,乙酰-CoA购自Sigma公司,14C-氯霉素购自杜邦公司(Dupont,NEN,美国)。
1.2 方法
1.2.1 质粒DNA的纯化与序列测定 人类Cx26基因转译起始位点上游-6.4kb~-4.8kb的1.6kb序列已克隆在pGEM-4Z质粒载体中。质粒经扩增,用碱裂解法抽提DNA后经PEG8000纯化,溶于适量TE中。测定吸光度A260(旧称光密度OD)以确定其浓度,经琼脂糖凝胶电泳确定其纯度。样品在全自动测序仪(全自动荧光测序仪377型,美国PE公司)上测序。在联网Internet中运用Basic blast程序与目前所有已知的核苷酸序列进行同源匹配,以确定所测序列是否为新序列。
1.2.2 pCAT vector-Cx26-1.6kb重组体的构建 将Cx26-1.6kb分别与pCAT enhancer vector和pCAT promoter vector重组,以分别观察其启动功能和增强功能。 采用平端连接,则可构建插入片段具有不同插入方向的重组体。用来自pGEM-4Z亚克隆的Cx26-1.6kb片段,分别平端连接、重组到pCAT enhancer vector和pCAT promoter vector的多克隆位点处的XbaⅠ位点中。转化后挑选单菌落扩增,用DNA限切酶鉴定阳性转化子及重组体类型。
1.2.3 脂质体介导重组体DNA转染哺乳细胞 10 cm平皿中培养的MDA-MB-134乳腺癌细胞达80%汇合时用于脂质体介导的重组体DNA转染。在少量无血清培养基中混合重组体DNA和脂质体以形成DNA-脂质体复合物。细胞经洗涤后加入DNA-脂质体复合物。37℃培养数小时后,洗去DNA-脂质体复合物,换上新鲜完全培养基,继续培养至收获。
1.2.4 CAT报告基因分析 经重组体DNA转染的MDA-MB-134乳腺癌细胞培养48 h后离心收获细胞,细胞悬浮在少量0.25mol/L Tris.Cl pH7.5中,经历3次冻融循环后,离心沉淀,取上清,获得细胞抽提物。细胞抽提物经65℃加热10 min以失活内源乙酰辅酶A。在反应管中加入14C-氯霉素,acetyl-CoA,转染细胞抽提物及缓冲溶液以建立CAT反应系统。37℃温育约2 h后,用乙酸乙酯抽提乙酰化氯霉素,真空抽干后溶于少量乙酸乙酯中,各样品点样在硅胶薄层层析板距底缘2 cm高处,晾干后在氯仿∶甲醇(95∶5)中层析约1 h。层析板晾干后放射自显影3 d。
2 结果
Cx26基因5′-端上游1.6kb克隆于pGEM-4Z EcoRⅠ/Pst Ⅰ位点上。质粒DNA经纯化后,经全自动荧光测序仪测定,其DNA核苷酸序列见图1。将图1中的Cx26-1.6kb序列在联网Internet中运用Basic blast程序与目前所有已知的核苷酸序列进行同源匹配,得到最大Score值为42,最小P(N)为0.26,按两序列间Score值>200,P(N)<0.05为有意义同源性比较,则Cx26-1.6 kb为一新序列,此序列在Genbank中的登录号为AF091526。
载体pCAT promoter vector和pCAT enhancer vector用Xba Ⅰ线性化并进行去磷酸化反应,从亚克隆中酶切、电泳回收Cx26-1.6kb片段后,均用Klenow大片段补齐粘末端。Cx26-1.6kb分别与pCAT promoter vector和pCAT enhancer vector连接,经转化、筛选,获得按正方向插入的pCAT promoter-Cx1.6 kb重组体(PF),按反方向插入的pCAT promoter-Cx1.6 kb(PR),按正方向插入的pCAT enhancer-Cx1.6 kb重组体(EF),和按反方向插入的 pCAT enhancer -Cx1.6kb (ER)。这四种重组体的限切酶鉴定见图2。各重组体DNA经脂质体介导转染到MDA-MB-134乳腺癌细胞株中,经培养、收获细胞后,进行CAT反应。CAT反应产物通过薄层层板(图3)。如图3所示,ER转染抽提物具有强烈的CAT活性,说明Cx26-1.6 kb具有强烈的启动子功能。ER作为Cx26-1.6kb在pCAT enhancer vector中反向插入的重组体而表现出要求正向顺序才具有的启动功能,说明Cx26-1.6 kb原本是反向亚克隆在pGEM-4Z载体中的。而与此插入方向相反者EF的CAT活性小得多,此1.6kb片段也没有表现出增强子功能。据此,图1中的DNA序列即是按功能方向排列的。
图1 人类Cx26基因ATG转译起始点远端上游1.6kb的DNA序列(A)和人类Cx26基因的结构简图(B) 有下划线部分为TATA-less TTAAAA box和GT boxes
Fig 1 1.6 kb DNA sequence located 5′upstream of ATG translation start site of the human Cx26 gene(A) and map of the human Cx26 gene(B) The sequence of TATA-less TTAAAA box and GT boxes are underlined
图2 pCAT vector-Cx1.6重组体的鉴定 1:PF/XbaⅠ+PstⅠ;2:PR/XbaⅠ+PstⅠ;3:EF/XbaⅠ+PstⅠ;4:ER/XbaⅠ+PstⅠ;5:λDNA/HindⅢ+pGEM 7Zf(+)/HaeⅢ markers
Fig 2 Identification of pCAT vector-Cx1.6 recombinants 1:PF/XbaⅠ+PstⅠ;2:PR/XbaⅠ+PstⅠ;3:EF/XbaⅠ+PstⅠ;4:ER/XbaⅠ+PstⅠ;5:λDNA/HindⅢ+pGEM 7Zf(+)/HaeⅢ markers
图3 Cx26-1.6kb的CAT报告基因分析
1:pCAT enhancer vector;2:PF;3:PR;4:EF;5:ER;6:pCAT control vector
Fig 3 CAT reporter assay of Cx26-1.6kb 1:pCAT enhancer vector;2:PF;3:PR;4:EF;5:ER;6:pCAT control vector
3 讨论
连接蛋白26(Cx26)是乳腺上皮细胞中主要的间隙连接蛋白,其编码基因已被看作一个肿瘤抑制基因。尽管乳腺癌细胞株中Cx26的表达是下调的[3,4],但泌乳期间其表达上调[2]。因此,Cx26基因可能在乳腺发育中起重要的病理生理作用。
到目前为止,在对人类Cx26基因外显子2序列进行了描述的基础上[6],Kiang等[8]用cDNA克隆和引物延伸技术对Cx26上游的4.8kb片段进行了作图和测序。分析发现此片段含有启动子区、转译起始点、外显子1和内含子1。CAT报告基因分析结果表明,启动CAT活性的DNA序列在直接靠近转译起始点上游-120 bp范围内。此片段含有非TATA 的TTAAA盒(-24/-19 bp)、3个GC盒(位于-40 bp、-78 bp和-90 bp)、及2个GT盒(GGGGTG,位于-39 bp和-37 bp)。这些结构完全可以与小鼠Cx26基因的启动子区相类比。
按本文CAT报告基因分析结果(图3),Cx26-1.6 kb片段具有启动子功能。对此1.6 kb片段的核苷酸序列进行分析,发现它含有2个GT盒(位于-6158 bp和-6213 bp),一个非TATA 的TTAAA盒(位于-6237/-6232 bp处)。GT盒是SP3潜在的结合位点,而TTAAAA盒是典型的真核启动子序列之一。这些分析结果支持了Cx26-1.6 kb具有启动子功能这一事实。与小鼠中的情形一样[6],人类Cx26基因的转录产物也有两种大小的mRNA分子,研究者们认为这不大可能由交替剪接造成,而是可能有另外的转录启始点[8]。我们的研究结果为此推测提供了良好的证据,并使我们更为完整地得到了Cx26基因的gDNA序列,更为全面地完整地把握了Cx26基因的顺式调控元件。
基金项目:国家自然科学基金(39680031)
参考文献
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[8]Kiang DT,Ni J,Zheng JT,et al.Upstream genomic sequence of the human connexin 26 gene.Gene,1997,199(1-2)∶165-171.
收稿日期:1999-04-13