胸腺生发中心及Bcl-2表达与获得性自身免疫性重症肌无力的关系
作者：岳岚 柴 沈钢 宋作珪
单位：310009 杭州，浙江医科大学附属第二医院
关键词：
中华医学杂志990316 通过对患者及正常胸腺标本生发中心和凋亡相关基因Bcl-2 蛋白表达水平的检测，探讨与获得性自身免疫性重症肌无力的关系。
一、对象与方法
1.对象：获得性自身免疫性重症肌无力胸腺组织取自确诊为重症肌无力而行胸腺切除及前纵隔扩大清扫术的患者，病理证实为胸腺增生。共31例，男12例，女19例；平均年龄(23±10)岁，<20岁17例，>20岁14例；Osserman分型：Ⅰ型17例，Ⅱa型5例，Ⅱb型9例，无Ⅲ型者。
正常对照组的胸腺组织取自左向右分流型先天性心脏病行矫治术时因暴露视野需要而切除的部分胸腺，共25例。平均年龄(24±14岁，8～50岁)；术前检查无重症肌无力及其他自身免疫性疾病，术后病理检查胸腺无明显异常病变。两组间年龄及性别，经t检验和χ2检验，P>0.05。
, 百拇医药
2.方法：以上海基因公司提供的试剂盒及鼠抗人Bcl-2单抗(DAKO，124)对石蜡切片进行免疫组织化学染色(SP法)以及苏木素复染和HE染色。光学显微镜下观测以胞浆及胞膜被染成棕黄色者为Bcl-2阳性细胞，表达水平按染色切片上阳性细胞所占的比例分为五级：(10%为O级；10%～25%为Ⅰ级；25%～50%为Ⅱ级；50%～75%为Ⅲ级；75%以上为Ⅳ级)。低倍镜视野下对HE染色的切片计数生发中心个数。
3.统计分析：计数资料以t检验和χ2检验，分级资料以Ridit分析法进行统计分析，所采用的检验水准为α=0.05。
二、结果
1.HE染色切片的观测：胸腺增生组织中皮质区域扩大，髓质区域变小或消失，可见散布滤泡生发中心，位于髓皮质交界处，由暗区和亮区构成，即使是大体形态呈萎缩的胸腺组织其镜下仍可见生发中心(图1)。生发中心的数量平均为每低倍镜视野1.1±0.7个，以生发中心的数量来评估胸腺增生活性[1]，表现为胸腺活性Ⅰ度者有17例，Ⅱ度者10例，Ⅲ度者4例。而正常组织中未见生发中心的形成。即使是低龄正常胸腺，大体上呈增生状，占据前纵隔的比例较大，但镜下结构与高龄正常者比较，只是胸腺组织与脂肪组织等替代组织的比例不同而已。
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图1 胸腺增生组织中可见散布的滤泡生发中心 HE×100
图2 胸腺增生组织中Bcl-2阳性细胞表达，可见细胞膜及胞浆被染成棕黄或棕褐色 SP×400
2.Bcl-2染色切片观测：正常胸腺中阳性细胞分布于髓质和皮质，其中以皮质为多；在胸腺增生组织中阳性细胞的分布与正常胸腺组织中相似(图2)，但髓、皮质的分布大致相当；胸腺增生组表达水平从0～Ⅳ级依次占本组的0%、3.2%、6.5%、67.7%、22.6%，而对照组则为32.0%、20.0%、36.0%、12.0%、0%；经Ridit统计分析，发现与对照组相比获得性自身免疫性重症肌无力组胸腺增生组织中Bcl-2的表达水平明显上升，差异有显著性意义(R=0.6881，R=0.2668，u=5.4292，P<0.001)。
三、讨论
通过HE染色计数所得的胸腺组织中生发中心的数目，正常对照组中生发中心几乎为零，而胸腺增生组中生发中心的数目明显增加。生发中心的出现和数目增多往往被认为是确认胸腺增生的一个重要特征。目前认为形成生发中心的B淋巴细胞必定在滤泡外受到激活[2]，而B淋巴细胞致敏的场所是T淋巴细胞富集的区域，并伴有树突状细胞与抑制性T淋巴细胞，在胸腺增生的组织中就存在着B淋巴细胞致敏所需的基本环境[3]及自身抗原蛋白[4]即肌样细胞表面的乙酰胆碱受体(nAchR)。因而完全可能触发免疫反应。
, 百拇医药
Bcl-2最初是从人的滤泡性B淋巴细胞淋巴瘤中分离出来的[5]，定位于人第18号染色体，通过抵抗多种形式的细胞死亡而延长细胞寿命，使细胞数目累积增多，在免疫细胞成熟过程中亦起着重要的调节作用，其表达呈现阶段性变化[5-7]，在胸腺T细胞发育过程中进行阳性选择时，Bcl-2表达下降，调节CD4+CD8+双阳性细胞进入细胞凋亡，而CD4+或CD8+单阳性T淋巴细胞的Bcl-2表达则上调使之进一步发育成熟，由此建立正常的免疫系统。在本实验中，胸腺增生组织中Bcl-2的表达普遍上调，明显高于正常胸腺组织(P<0.001)，同Shiono[8]及Onodera[9]发现Bcl-2的高表达，使自反应性B和T淋巴细胞的清除受到抑制而使自身免疫出现异常的结果相符，提示由于Bcl-2表达升高，抑制了正常的免疫细胞的凋亡，使自反应性B淋巴细胞的克隆清除受到抑制，持续的分泌抗nAchR抗体。
, 百拇医药
值得注意的是，既然Bcl-2不正常的高表达能使生发中心的自反应性B淋巴细胞逃脱细胞凋亡，那么这种逃脱的细胞就可能不仅仅是nAchR特异性的，亦可能具有其他的抗原特异性，这也许可以解释为何有的重症肌无力患者伴有甲状腺机能亢进、系统性红斑狼疮等其他自身免疫性疾病。至于nAchR特异性自反应B淋巴细胞的发育成熟，可能与胸腺组织中的树突状细胞的抗原递呈作用有密切的关系。
本实验发现的增生胸腺Bcl-2的高表达，实际上反映了免疫细胞的凋亡受到抑制，这很可能是获得性自身免疫性重症肌无力发生的重要机制之一，但其确切发病机制尚有待于进一步的深入研究。
参考文献
1 许贤豪.神经免疫学.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1992,113-150.
2 MacLennam ICM. Germinal centers. Ann Rev Immunol,1994,12:117-139.
, http://www.100md.com
3 Sommer N, Willcox N, Harcort GL, et al. Myasthenic thymus and thymomas are selectively enriched in acetylcholine receptor-reactive T cell. Ann Neurol, 1990,28:312-319.
4 Kirchner T, Hoppe F, Schalke B, et al. Microenvironment of thymic myoid cells in myasthenia gravis. Virchows Archiv B, 1988,54:295-302.
5 Gratiet-Deans J, Ding LY, Turka LA,et al. Bcl-2 proto-oncogene expression during human T cell development: evidence for biphasic regulation. J Immunol, 1993,151:83-91.
, 百拇医药
6 Veis DJ, Sentman CL,Bach EA,et al. Expression of the Bcl-2 protein in murine and human thymocytes and in peripheral T lymphocyte. J Immunol, 1993,151:2546-2554.
7 Haury M, Freitas A, Hermitte V, et al. The physiology of Bcl-2 expression in murine B lymphocytes. Oncogene, 1993,8:1257-1262.
8 Shiono H, Fujii Y, Okumura M, et al. Failure to down-regulate Bcl-2 protein in thymic germinal center B cells in myasthenia gravis. Eur J Immunol, 1997,27:805-809.
9 Onodera J, Nakamura S, Nagano I,et al. Upregulation of Bcl-2 protein in the myasthenic thymus. Ann Neurol, 1996,39:521-528.
(收稿：1998-06-29 修回：1998-12-08), 百拇医药
单位：310009 杭州，浙江医科大学附属第二医院
关键词：
中华医学杂志990316 通过对患者及正常胸腺标本生发中心和凋亡相关基因Bcl-2 蛋白表达水平的检测，探讨与获得性自身免疫性重症肌无力的关系。
一、对象与方法
1.对象：获得性自身免疫性重症肌无力胸腺组织取自确诊为重症肌无力而行胸腺切除及前纵隔扩大清扫术的患者，病理证实为胸腺增生。共31例，男12例，女19例；平均年龄(23±10)岁，<20岁17例，>20岁14例；Osserman分型：Ⅰ型17例，Ⅱa型5例，Ⅱb型9例，无Ⅲ型者。
正常对照组的胸腺组织取自左向右分流型先天性心脏病行矫治术时因暴露视野需要而切除的部分胸腺，共25例。平均年龄(24±14岁，8～50岁)；术前检查无重症肌无力及其他自身免疫性疾病，术后病理检查胸腺无明显异常病变。两组间年龄及性别，经t检验和χ2检验，P>0.05。
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2.方法：以上海基因公司提供的试剂盒及鼠抗人Bcl-2单抗(DAKO，124)对石蜡切片进行免疫组织化学染色(SP法)以及苏木素复染和HE染色。光学显微镜下观测以胞浆及胞膜被染成棕黄色者为Bcl-2阳性细胞，表达水平按染色切片上阳性细胞所占的比例分为五级：(10%为O级；10%～25%为Ⅰ级；25%～50%为Ⅱ级；50%～75%为Ⅲ级；75%以上为Ⅳ级)。低倍镜视野下对HE染色的切片计数生发中心个数。
3.统计分析：计数资料以t检验和χ2检验，分级资料以Ridit分析法进行统计分析，所采用的检验水准为α=0.05。
二、结果
1.HE染色切片的观测：胸腺增生组织中皮质区域扩大，髓质区域变小或消失，可见散布滤泡生发中心，位于髓皮质交界处，由暗区和亮区构成，即使是大体形态呈萎缩的胸腺组织其镜下仍可见生发中心(图1)。生发中心的数量平均为每低倍镜视野1.1±0.7个，以生发中心的数量来评估胸腺增生活性[1]，表现为胸腺活性Ⅰ度者有17例，Ⅱ度者10例，Ⅲ度者4例。而正常组织中未见生发中心的形成。即使是低龄正常胸腺，大体上呈增生状，占据前纵隔的比例较大，但镜下结构与高龄正常者比较，只是胸腺组织与脂肪组织等替代组织的比例不同而已。
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图1 胸腺增生组织中可见散布的滤泡生发中心 HE×100
图2 胸腺增生组织中Bcl-2阳性细胞表达，可见细胞膜及胞浆被染成棕黄或棕褐色 SP×400
2.Bcl-2染色切片观测：正常胸腺中阳性细胞分布于髓质和皮质，其中以皮质为多；在胸腺增生组织中阳性细胞的分布与正常胸腺组织中相似(图2)，但髓、皮质的分布大致相当；胸腺增生组表达水平从0～Ⅳ级依次占本组的0%、3.2%、6.5%、67.7%、22.6%，而对照组则为32.0%、20.0%、36.0%、12.0%、0%；经Ridit统计分析，发现与对照组相比获得性自身免疫性重症肌无力组胸腺增生组织中Bcl-2的表达水平明显上升，差异有显著性意义(R=0.6881，R=0.2668，u=5.4292，P<0.001)。
三、讨论
通过HE染色计数所得的胸腺组织中生发中心的数目，正常对照组中生发中心几乎为零，而胸腺增生组中生发中心的数目明显增加。生发中心的出现和数目增多往往被认为是确认胸腺增生的一个重要特征。目前认为形成生发中心的B淋巴细胞必定在滤泡外受到激活[2]，而B淋巴细胞致敏的场所是T淋巴细胞富集的区域，并伴有树突状细胞与抑制性T淋巴细胞，在胸腺增生的组织中就存在着B淋巴细胞致敏所需的基本环境[3]及自身抗原蛋白[4]即肌样细胞表面的乙酰胆碱受体(nAchR)。因而完全可能触发免疫反应。
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Bcl-2最初是从人的滤泡性B淋巴细胞淋巴瘤中分离出来的[5]，定位于人第18号染色体，通过抵抗多种形式的细胞死亡而延长细胞寿命，使细胞数目累积增多，在免疫细胞成熟过程中亦起着重要的调节作用，其表达呈现阶段性变化[5-7]，在胸腺T细胞发育过程中进行阳性选择时，Bcl-2表达下降，调节CD4+CD8+双阳性细胞进入细胞凋亡，而CD4+或CD8+单阳性T淋巴细胞的Bcl-2表达则上调使之进一步发育成熟，由此建立正常的免疫系统。在本实验中，胸腺增生组织中Bcl-2的表达普遍上调，明显高于正常胸腺组织(P<0.001)，同Shiono[8]及Onodera[9]发现Bcl-2的高表达，使自反应性B和T淋巴细胞的清除受到抑制而使自身免疫出现异常的结果相符，提示由于Bcl-2表达升高，抑制了正常的免疫细胞的凋亡，使自反应性B淋巴细胞的克隆清除受到抑制，持续的分泌抗nAchR抗体。
, 百拇医药
值得注意的是，既然Bcl-2不正常的高表达能使生发中心的自反应性B淋巴细胞逃脱细胞凋亡，那么这种逃脱的细胞就可能不仅仅是nAchR特异性的，亦可能具有其他的抗原特异性，这也许可以解释为何有的重症肌无力患者伴有甲状腺机能亢进、系统性红斑狼疮等其他自身免疫性疾病。至于nAchR特异性自反应B淋巴细胞的发育成熟，可能与胸腺组织中的树突状细胞的抗原递呈作用有密切的关系。
本实验发现的增生胸腺Bcl-2的高表达，实际上反映了免疫细胞的凋亡受到抑制，这很可能是获得性自身免疫性重症肌无力发生的重要机制之一，但其确切发病机制尚有待于进一步的深入研究。
参考文献
1 许贤豪.神经免疫学.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1992,113-150.
2 MacLennam ICM. Germinal centers. Ann Rev Immunol,1994,12:117-139.
, http://www.100md.com
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4 Kirchner T, Hoppe F, Schalke B, et al. Microenvironment of thymic myoid cells in myasthenia gravis. Virchows Archiv B, 1988,54:295-302.
5 Gratiet-Deans J, Ding LY, Turka LA,et al. Bcl-2 proto-oncogene expression during human T cell development: evidence for biphasic regulation. J Immunol, 1993,151:83-91.
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6 Veis DJ, Sentman CL,Bach EA,et al. Expression of the Bcl-2 protein in murine and human thymocytes and in peripheral T lymphocyte. J Immunol, 1993,151:2546-2554.
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8 Shiono H, Fujii Y, Okumura M, et al. Failure to down-regulate Bcl-2 protein in thymic germinal center B cells in myasthenia gravis. Eur J Immunol, 1997,27:805-809.
9 Onodera J, Nakamura S, Nagano I,et al. Upregulation of Bcl-2 protein in the myasthenic thymus. Ann Neurol, 1996,39:521-528.
(收稿：1998-06-29 修回：1998-12-08), 百拇医药