霍乱弧菌以thyA基因为选择压力的染色体-质粒致死平衡系统的构建
作者：夏晓滨 祁国明 刘延清 高守一
单位：中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 卫生部分子细菌学重点实验室
关键词：霍乱弧菌；胸苷酸合成酶基因；染色体-质粒致死平衡系统
中华微生物学和免疫学杂志000318 【 摘要 】 目的 为构建霍乱弧菌口服活疫苗提供稳定实用的载体系统。 方法 在改良MM基本培养基的基础上，建立了霍乱弧菌thyA基因突变菌株的筛选方法，继而用PCR插入法克隆了大肠杆菌thyA基因全序列(pXXB106)，并电击转化入霍乱弧菌thyA基因缺陷株(PL102)，使后者在MM改良培养基上的生长恢复为野生状态。结果 选育出的thyA基因突变的霍乱弧菌IEM101菌株PL102突变性状及生物学性状基本稳定。进而构建了以thyA基因为选择压力的霍乱弧菌染色体-质粒致死平衡系统。 结论 构建成的抗原呈递系统作为构建肠道疫苗的受体菌株是稳定的，也是适用的。
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Development of a chromosome-plasmid balanced lethal gene
expression system of Vibrio cholerae based on thyA locus
XIA Xiaobin, QI Guoming, LIU Yanqing, et al. Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 102206, P.R.China
【 Abstract 】 Objective To make up a delivery vector for construction of live oral Vibrio cholorae vaccine candidate. Methods In a modified MM minimal medium, a Vibrio cholerae strain IEM101 of thyA gene mutant(PL102) was screened by adding trimethoprim (TMP) 15μg/ml and thymidine 50μg/ml. The PCR product of the thyA gene of E.coli was cloned into pUC18(pXXB106) and then transformed into PL102 by electroporation. Results The chromosome-plasmid balanced lethal gene expression system of Vibrio cholerae based on thyA locus was constructed. Conclusion The balanced system was defined as a delivery vector candidate for further study.
, 百拇医药
【 Subject words 】 Vibrio cholerae; Thymidylate synthase gene; Chromosome-plasmid balanced lethal system; Gene expression
霍乱是由定居在小肠的非侵袭性霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病，传播快、波及面广、危害严重，在世界许多国家，尤其是发展中国家，仍然是危害人民健康的重要公共卫生问题，发展疫苗是战胜该疾病最经济、最有效、也是最可靠的方法〔1〕。以往的灭活全菌疫苗保护效率低，且保护持续时间短，口服活疫苗虽有较好的保护，但仍存在残余毒力等问题。自1988年Nakayama等〔2〕首次成功地构建了以非抗生素抗性为选择压力的染色体-质粒致死平衡系统以来，在疫苗的发展中倍受青睐。该系统是以细菌的管家基因缺陷菌株作为受体菌，在质粒上克隆入完整的受体菌缺陷的基因，作为外源基因表达载体稳定的选择性压力。这就较好地解决了质粒稳定性和以抗生素抗性作为选择压力的问题，并能高效表达外源基因。无疑，该系统的建立为研制安全、高效、适用的霍乱疫苗带来了希望。本文报道了以编码胸苷酸合成酶的thyA基因为选择压力，构建的霍乱弧菌thyA基因缺陷的染色体-质粒致死平衡系统。
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材料与方法
实验用菌株、质粒：见表1。
表1 实验用菌株和质粒
Table 1. Strains and plasmids used in this study Strains and
plasmids
Source
Characters
Plasmids
pUC18
This study
Apr LacZ+
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pXXB106
This study
pUC18::thyA
Strains
DH5α
This lab
E. coli
IEM101
This lab
EVC.Og.1a
PL101
This study
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DH5α thyA-
PL102
This study
IEM101 thyA-
PL103
This study
PL102 pXXB106
培养基：MM培养基：M9培养基，0.5%葡萄糖。MM改良培养基：MM培养基，0.5%酪蛋白水解物，0.3%无水亚硫酸钠，1%柠檬酸钠，1%蔗糖。 MM选择培养基：MM改良培养基，TMP终浓度15μg/ml，胸腺嘧啶核苷终浓度50μg/ml。CBT培养基：MM培养基，0.5%酪蛋白水解物，0.1μg/ml维生素B1。CBT选择培养基：CBT培养基，TMP终浓度10μg/ml，胸腺嘧啶核苷终浓度50μg/ml。LB培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%氯化钠。LBA培养基：LB培养基，(1.5～1.8)%琼脂。
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试剂：三甲氧苄二氨嘧啶，胸腺嘧啶核苷购自Sigma公司；限制性内切酶，Taq酶，连接酶等购自华美生物工程公司；硝酸纤维素膜为北京化工学校工厂产品；地高辛试剂盒为德国 Boehringer Mannheim Biochemica 公司产品；其余试剂均为分析纯级。
实验仪器：PCR仪(Single BlockTM System)为ERICOM Inc产品，高速冷冻离心机BR20B3为HITACHI产品，电击仪(Gene PulserTM)为Bio-Rad产品。
方法
1.霍乱弧菌和大肠杆菌thyA基因突变菌株的选育：将待筛选的细菌液体培养物以适当浓度涂于MM选择培养基(用于霍乱弧菌的筛选)或CBT选择培养基(用于大肠杆菌的筛选)上，一般地，抗叶酸药物抗性菌株在含胸腺嘧啶核苷的培养基上比天然菌株生长迅速〔3〕，因而可以用此方法筛选出thyA基因突变的菌株。thyA基因突变菌株在基本培养基上生长不良或不生长，在加有胸腺嘧啶核苷的基本培养基或营养丰富的培养基上恢复生长。
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2.thyA基因突变菌株稳定性的研究〔4〕：将thyA基因突变的大肠杆菌分别在CBT、加有胸腺嘧啶核苷的CBT和LB培养基中，霍乱弧菌分别在MM改良培养基、加有胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基和LB培养基中转种培养100次，每10次取各培养物适量，涂于CBT(适于大肠杆菌)或MM改良培养基(适于霍乱弧菌)平皿上，观察菌株发生回复突变的情况。
3.大肠杆菌thyA基因的PCR扩增：根据已报道的大肠杆菌thyA基因序列〔5〕设计了一对引物，从第26位至第41位碱基为引物1(P1)，从第1121位至第1138位碱基为引物2(P2)，它们的序列如下：P1：5′ CCT GAG CTC CTG ATT GGT TAC GGC G 3′，P2：5′ GCA GGT ACC CCA GTT TCT ATT TCT TCG 3′。为便于克隆，在P1的5′端加有SacI酶切位点。扩增参数：预变性94℃ 4min，后续循环94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，末轮循环72℃ 7min。
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4.PCR产物的纯化：尽量吸去上层的石蜡油，加入等体积的酚-氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次，吸取上清，加入等体积的异丙醇，-20℃ 30min，以1200r/min离心10min，75%冷乙醇洗1次，干燥后，加一定体积的无菌去离子水溶解沉淀。
5.PCR产物的地高辛标记：PCR产物纯化后按产品说明书进行标记。
6.打点杂交：按文献常规操作〔6〕。
7.DNA常规操作：按文献〔7〕进行。
8.霍乱弧菌电击转化方法〔8〕：电击缓冲液为272mmol/L sucrose, 7mmol/L hepes, pH7.3, 1mmol/L MgCl2, 15% glycerol，电击参数为2.5kV, 25μF, 4.8mS，外接600Ω电阻。
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9.重组株质粒稳定性实验〔2〕：从选择培养基平板上挑单菌落接种于选择培养液中，37℃振荡培养至菌浓度达5×108CFU，转种于另一培养液中，菌浓度达106CFU，37℃培养过夜，培养物再转种另一培养液中，菌浓度为106CFU，37℃过夜培养，如此传100代，每10代取培养物适量涂于含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基上，再随机挑取100株种于MM改良培养基上，计算质粒稳定性。
结果
1.霍乱弧菌thyA基因突变菌株选育方法的建立：将霍乱弧菌接种在MM琼脂培养基上，经37℃ 48～72h培养，只呈现针尖大小的菌落，接种在MM液体培养基上，经37℃ 48～72h振荡培养，也只是出现101～103 CFU浓度的菌液，在此培养条件下很难完成thyA基因突变菌株的筛选。试用了多种培养基后，我们认为只有在MM培养基中加入0.5%的酪蛋白水解物及能刺激霍乱弧菌生长的无水亚硫酸钠、柠檬酸钠和蔗糖适量后，霍乱弧菌的生长在LB中的生长速度和菌落形态才能一致，并进而成功地用MM选择培养基选育出了霍乱弧菌thyA基因突变株。
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按方法1中的步骤，将霍乱弧菌IEM101和大肠杆菌DH5α单菌落分别转种、活化，涂于MM和CBT选择培养基上，37℃静止培养18～24h，挑取生长良好的抗TMP单菌落若干，分别接种CBT和MM选择培养基、含胸腺嘧啶核苷的CBT和MM改良培养基及CBT和MM改良培养基。在前两种培养基上thyA基因突变菌株生长良好，菌落形态与野生菌株一致，而在后一种培养基上无论是霍乱弧菌还是大肠杆菌的thyA基因突变株均不生长。我们把大肠杆菌和霍乱弧菌的thyA基因突变株分别命名为PL101和PL102。
2.PL101和PL102菌株稳定性实验：按方法5中的步骤，将PL101分别在LB、CBT和含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的CBT液体培养基中连续转种培养传代；PL102分别在LB、MM改良培养基和含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良液体培养基中连续传代，每转种10次取各培养物适量涂于CBT或MM改良培养基上，观察发生回复突变的情况。结果转种培养100次，共集菌10次，两株菌均未发现有回复突变株出现，故可认为PL101和PL102无论是在胸腺嘧啶核苷丰富还是贫乏的环境下，均能保持突变性状稳定，这对疫苗载体菌候选株来讲是极其重要的。
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3.大肠杆菌DH5α thyA基因的PCR扩增：PCR经29轮循环后的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上的结果如图1所示。由图1可见，PCR扩增产物约在1.13kb左右，与预计的thyA基因大小一致，且在图中未见非特异扩增条带。
图1 大肠杆菌thyA基因的PCR扩增
Fig 1. PCR products of thyA gene
1. Marker: λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ; 2. PCR products in E. coli; 3. Negative control; 4. PCR products in IEM101; 5. Marker: λDNA/HindⅢ
4.大肠杆菌thyA基因与霍乱弧菌IEM101 thyA基因同源性的研究：用如上所述的PCR产物，经Dig标记后作为探针，分别在68℃、53℃、42℃与IEM101的染色体DNA进行打点杂交，从图2可见均没有特异的杂交出现，表明两者的同源性很低。
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5.pXXB106的构建：PCR扩增大肠杆菌thyA基因产物用Klenow酶补平后再用SacⅠ酶切，载体pUC18用SacⅠ-SmaⅠ双酶切后，连接两片段并转化PL101，涂于CBT培养基，挑取单菌落，提取质粒、酶切鉴定，与预计的3.8kb大小相符(图3)，命名为pXXB106。
图2 大肠杆菌thyA基因探针与IEM101染色体在42℃、53℃和68℃杂交结果。
Fig 2. Dot blot hybridization of chromosome DNA of IEM101 with thyA gene of E. coli as the probe at 42℃, 53℃ and 68℃
1. Chromosome DNA of E. coli (positive control); 2. Chromosome DNA of IEM101; 3. PCR products of asd gene (negative control); 4. Chromosome DNA of 395
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图3 重组质粒pXXB106酶切鉴定结果
Fig 3. Identification of recombinant pXXB106 plasmid by enzyme digestion
1. Marker: λDNA/HindⅢ; 2. pXXB106; 3. pUC18
6.PL103菌株的构建：将pXXB106电击转入PL102中，涂于MM改良培养基，挑取单菌落，提取质粒，酶切后可见与原pXXB106质粒大小一致(图4)。
7.PL103菌株稳定性研究：在MM改良培养基、含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基和LB培养基中，传代含大肠杆菌thyA基因的PL103菌株，各传100次，每10次取各培养物适量，涂于含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基平板上，37℃过夜培养后，随机挑取100株点种于MM改良培养基，计算每100株菌中质粒丢失率，并提取质粒证实。如图5所示，PL103在MM改良培养基和LB培养基中是较稳定的，最小稳定性也在95%以上，而在含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基中传至50次时，仅有12%的菌株尚含有质粒，即在胸腺嘧啶核苷丰富(50μg/ml)的培养基中，PL103的稳定性仅为12%。
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图4 重组质粒pXXB106电击PL102前后比较
Fig 4. Comparison of recombinant pXXB106 plasmid before and after electroporation
1. pXXB106; 2. pXXB106; 3. Marker: λDNA/HindⅢ
图5 质粒稳定性研究
Fig 5. Studies on recombinant plasmid stability
1. MM modified medium; 2. LB medium; 3. MM modified medium containing 50μg/ml thymidine
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讨论
染色体-质粒致死平衡系统包含两个基本要素，即管家基因缺陷型受体菌和以管家基因作为选择标志和稳定因子的外源基因表达载体。管家基因通常存在于细菌的染色体上，它编码的产物催化细菌的基本代谢反应，该基因的缺陷导致细菌的营养缺陷型。营养缺陷型菌株在基本培养基上的生长必须依赖于相应物质的存在，或转入含有相应完整基因的重组质粒。染色体-质粒致死平衡系统正是以管家基因缺陷的菌株作为受体菌，用含有相应完整管家基因的质粒克隆外源基因，转化子因遗传互补效应而能在基本培养基上生长。此时，质粒对于细菌的生存已成为必须，而不再是可有可无，一旦转化子丢失了质粒，细菌则由于不能合成生存所必需的物质而不能生长或死亡。营养缺陷型菌株作为受体菌首先应该是稳定的，不易或不能发生回复突变，其次是所需的营养物质在动物和人体内含量极低，不能满足细菌的生长需求。芳香族氨基酸、胸腺嘧啶、二氨基庚二酸等在动物和人体内含量甚微或无，因而被广泛用于构建营养缺陷型菌株。
thyA基因编码胸苷酸合成酶(thymidylate synthase)，在体内DNA合成中起关键作用。 它催化dUMP向dTMP的转化，dTMP为DNA合成的基本原料dTTP的前体〔5〕，同时使5，10-甲基四氢叶酸转变为7，8-二氢叶酸。通常thyA基因突变株可直接从抗叶酸药物的菌株中筛选出来，用此方法已选育出的thyA突变菌株有：大肠杆菌〔3，4，9〕、鼠伤寒沙门菌〔9〕、乳球菌〔10〕、肠球菌〔11〕、嗜酸假单胞菌〔12〕、嗜麦芽黄单胞菌〔13〕、蜡样芽胞杆菌〔14〕以及苜蓿根瘤菌〔13〕，有关霍乱弧菌thyA基因突变株的筛选在国内外尚未见报道。
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霍乱弧菌对营养的要求不高，能在仅以氨盐作为唯一氮源的简单无机培养基中生存、繁殖，没有24种氨基酸的营养缺陷。但若接种量降低，则在最低营养培养基中不能生长，表明还需要某些生长因素，以促进氮源代谢过程，在此培养条件下很难进行thyA基因突变株的筛选。我们参照已有的thyA基因突变株的筛选方法及对霍乱弧菌培养特性的研究，试验了几种培养基后，发现MM改良培养基既能使霍乱弧菌可与在LB培养基上的生长一样良好，又可成功地用TMP法进行thyA基因突变株的筛选。选育出的PL102菌株无论在胸腺嘧啶核苷丰富或贫乏的培养基上，经100次转种后均未发现有回复突变的菌株，说明选育出的突变株突变性状基本稳定。该方法的建立，可方便地进行霍乱弧菌thyA基因突变株的筛选，并进而为非抗性霍乱弧菌口服活疫苗候选株的构建提供了稳定的受体候选菌株。
我们将编码胸苷酸合成酶的大肠杆菌thyA基因利用PCR插入技术克隆入质粒载体pUC18中，转化thyA基因突变导致该基因功能缺陷的霍乱弧菌IEM101菌株(PL102)，使后者在MM改良培养基上恢复生长，说明大肠杆菌thyA基因可以对霍乱弧菌thyA基因缺陷受体菌进行有效的功能互补。同时，我们用大肠杆菌thyA基因的PCR产物作为探针，与霍乱弧菌染色体DNA分别在68℃、53℃和42℃的条件下进行杂交分析，结果均为阴性，说明二者的thyA基因同源性较低，这样，两个功能相同的基因发生同源重组的机率也随之大为降低，这对以thyA基因为选择压力的thyA基因突变的霍乱弧菌染色体-大肠杆菌thyA基因致死平衡系统的稳定性来讲是非常有利的。作为体内定植并持续表达外源基因的疫苗载体质粒，其在受体菌中的稳定性是非常重要的。PL103在MM改良培养基中转种100次仍是100%稳定，在LB培养基中的稳定性为95%以上，这与仅含极微量胸腺嘧啶的人体肠道内环境是相适应的，因此也是稳定、适用的。
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综上所述，我们已成功地构建了以thyA基因为选择性压力的霍乱弧菌染色体-质粒致死平衡系统，载体质粒为3.8kb，含有7个位于LacZ基因中的可用于基因克隆的单酶切位点，这使首先在大肠杆菌中进行外源基因克隆，并进而在含IPTG和X-gal平板上的筛选非常简便、易行。质粒带有的大肠杆菌thyA基因可以对thyA基因突变的霍乱弧菌进行良好的功能互补。该系统稳定、方便、可操作性好，有望成为良好的疫苗载体系统，它的建立不仅为霍乱弧菌抗菌抗毒口服活疫苗候选株的研制开辟了一条新路，也为进一步构建肠道多价口服活疫苗奠定了基础。同时，由于霍乱弧菌具有良好的分泌性，外源基因表达的成份可分泌至胞外，因而该系统的建立还具有广阔的应用和开发前景，可作为多肽、蛋白质、细胞因子等生物活性物质的廉价加工厂，进行批量生产。
基金项目：国家“863”基金资助项目(863-102-07-03-01)
参考文献
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14 Farmer JL, Rothman F. Transformable thymine-requiring mutant of Bacillus subtilis. J Bacteriol, 1965, 89(1):262-263.
(收稿日期：1999-03-11), http://www.100md.com
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关键词：霍乱弧菌；胸苷酸合成酶基因；染色体-质粒致死平衡系统
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expression system of Vibrio cholerae based on thyA locus
XIA Xiaobin, QI Guoming, LIU Yanqing, et al. Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 102206, P.R.China
【 Abstract 】 Objective To make up a delivery vector for construction of live oral Vibrio cholorae vaccine candidate. Methods In a modified MM minimal medium, a Vibrio cholerae strain IEM101 of thyA gene mutant(PL102) was screened by adding trimethoprim (TMP) 15μg/ml and thymidine 50μg/ml. The PCR product of the thyA gene of E.coli was cloned into pUC18(pXXB106) and then transformed into PL102 by electroporation. Results The chromosome-plasmid balanced lethal gene expression system of Vibrio cholerae based on thyA locus was constructed. Conclusion The balanced system was defined as a delivery vector candidate for further study.
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【 Subject words 】 Vibrio cholerae; Thymidylate synthase gene; Chromosome-plasmid balanced lethal system; Gene expression
霍乱是由定居在小肠的非侵袭性霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病，传播快、波及面广、危害严重，在世界许多国家，尤其是发展中国家，仍然是危害人民健康的重要公共卫生问题，发展疫苗是战胜该疾病最经济、最有效、也是最可靠的方法〔1〕。以往的灭活全菌疫苗保护效率低，且保护持续时间短，口服活疫苗虽有较好的保护，但仍存在残余毒力等问题。自1988年Nakayama等〔2〕首次成功地构建了以非抗生素抗性为选择压力的染色体-质粒致死平衡系统以来，在疫苗的发展中倍受青睐。该系统是以细菌的管家基因缺陷菌株作为受体菌，在质粒上克隆入完整的受体菌缺陷的基因，作为外源基因表达载体稳定的选择性压力。这就较好地解决了质粒稳定性和以抗生素抗性作为选择压力的问题，并能高效表达外源基因。无疑，该系统的建立为研制安全、高效、适用的霍乱疫苗带来了希望。本文报道了以编码胸苷酸合成酶的thyA基因为选择压力，构建的霍乱弧菌thyA基因缺陷的染色体-质粒致死平衡系统。
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材料与方法
实验用菌株、质粒：见表1。
表1 实验用菌株和质粒
Table 1. Strains and plasmids used in this study Strains and
plasmids
Source
Characters
Plasmids
pUC18
This study
Apr LacZ+
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pXXB106
This study
pUC18::thyA
Strains
DH5α
This lab
E. coli
IEM101
This lab
EVC.Og.1a
PL101
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DH5α thyA-
PL102
This study
IEM101 thyA-
PL103
This study
PL102 pXXB106
培养基：MM培养基：M9培养基，0.5%葡萄糖。MM改良培养基：MM培养基，0.5%酪蛋白水解物，0.3%无水亚硫酸钠，1%柠檬酸钠，1%蔗糖。 MM选择培养基：MM改良培养基，TMP终浓度15μg/ml，胸腺嘧啶核苷终浓度50μg/ml。CBT培养基：MM培养基，0.5%酪蛋白水解物，0.1μg/ml维生素B1。CBT选择培养基：CBT培养基，TMP终浓度10μg/ml，胸腺嘧啶核苷终浓度50μg/ml。LB培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%氯化钠。LBA培养基：LB培养基，(1.5～1.8)%琼脂。
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试剂：三甲氧苄二氨嘧啶，胸腺嘧啶核苷购自Sigma公司；限制性内切酶，Taq酶，连接酶等购自华美生物工程公司；硝酸纤维素膜为北京化工学校工厂产品；地高辛试剂盒为德国 Boehringer Mannheim Biochemica 公司产品；其余试剂均为分析纯级。
实验仪器：PCR仪(Single BlockTM System)为ERICOM Inc产品，高速冷冻离心机BR20B3为HITACHI产品，电击仪(Gene PulserTM)为Bio-Rad产品。
方法
1.霍乱弧菌和大肠杆菌thyA基因突变菌株的选育：将待筛选的细菌液体培养物以适当浓度涂于MM选择培养基(用于霍乱弧菌的筛选)或CBT选择培养基(用于大肠杆菌的筛选)上，一般地，抗叶酸药物抗性菌株在含胸腺嘧啶核苷的培养基上比天然菌株生长迅速〔3〕，因而可以用此方法筛选出thyA基因突变的菌株。thyA基因突变菌株在基本培养基上生长不良或不生长，在加有胸腺嘧啶核苷的基本培养基或营养丰富的培养基上恢复生长。
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2.thyA基因突变菌株稳定性的研究〔4〕：将thyA基因突变的大肠杆菌分别在CBT、加有胸腺嘧啶核苷的CBT和LB培养基中，霍乱弧菌分别在MM改良培养基、加有胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基和LB培养基中转种培养100次，每10次取各培养物适量，涂于CBT(适于大肠杆菌)或MM改良培养基(适于霍乱弧菌)平皿上，观察菌株发生回复突变的情况。
3.大肠杆菌thyA基因的PCR扩增：根据已报道的大肠杆菌thyA基因序列〔5〕设计了一对引物，从第26位至第41位碱基为引物1(P1)，从第1121位至第1138位碱基为引物2(P2)，它们的序列如下：P1：5′ CCT GAG CTC CTG ATT GGT TAC GGC G 3′，P2：5′ GCA GGT ACC CCA GTT TCT ATT TCT TCG 3′。为便于克隆，在P1的5′端加有SacI酶切位点。扩增参数：预变性94℃ 4min，后续循环94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，末轮循环72℃ 7min。
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4.PCR产物的纯化：尽量吸去上层的石蜡油，加入等体积的酚-氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次，吸取上清，加入等体积的异丙醇，-20℃ 30min，以1200r/min离心10min，75%冷乙醇洗1次，干燥后，加一定体积的无菌去离子水溶解沉淀。
5.PCR产物的地高辛标记：PCR产物纯化后按产品说明书进行标记。
6.打点杂交：按文献常规操作〔6〕。
7.DNA常规操作：按文献〔7〕进行。
8.霍乱弧菌电击转化方法〔8〕：电击缓冲液为272mmol/L sucrose, 7mmol/L hepes, pH7.3, 1mmol/L MgCl2, 15% glycerol，电击参数为2.5kV, 25μF, 4.8mS，外接600Ω电阻。
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9.重组株质粒稳定性实验〔2〕：从选择培养基平板上挑单菌落接种于选择培养液中，37℃振荡培养至菌浓度达5×108CFU，转种于另一培养液中，菌浓度达106CFU，37℃培养过夜，培养物再转种另一培养液中，菌浓度为106CFU，37℃过夜培养，如此传100代，每10代取培养物适量涂于含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基上，再随机挑取100株种于MM改良培养基上，计算质粒稳定性。
结果
1.霍乱弧菌thyA基因突变菌株选育方法的建立：将霍乱弧菌接种在MM琼脂培养基上，经37℃ 48～72h培养，只呈现针尖大小的菌落，接种在MM液体培养基上，经37℃ 48～72h振荡培养，也只是出现101～103 CFU浓度的菌液，在此培养条件下很难完成thyA基因突变菌株的筛选。试用了多种培养基后，我们认为只有在MM培养基中加入0.5%的酪蛋白水解物及能刺激霍乱弧菌生长的无水亚硫酸钠、柠檬酸钠和蔗糖适量后，霍乱弧菌的生长在LB中的生长速度和菌落形态才能一致，并进而成功地用MM选择培养基选育出了霍乱弧菌thyA基因突变株。
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按方法1中的步骤，将霍乱弧菌IEM101和大肠杆菌DH5α单菌落分别转种、活化，涂于MM和CBT选择培养基上，37℃静止培养18～24h，挑取生长良好的抗TMP单菌落若干，分别接种CBT和MM选择培养基、含胸腺嘧啶核苷的CBT和MM改良培养基及CBT和MM改良培养基。在前两种培养基上thyA基因突变菌株生长良好，菌落形态与野生菌株一致，而在后一种培养基上无论是霍乱弧菌还是大肠杆菌的thyA基因突变株均不生长。我们把大肠杆菌和霍乱弧菌的thyA基因突变株分别命名为PL101和PL102。
2.PL101和PL102菌株稳定性实验：按方法5中的步骤，将PL101分别在LB、CBT和含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的CBT液体培养基中连续转种培养传代；PL102分别在LB、MM改良培养基和含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良液体培养基中连续传代，每转种10次取各培养物适量涂于CBT或MM改良培养基上，观察发生回复突变的情况。结果转种培养100次，共集菌10次，两株菌均未发现有回复突变株出现，故可认为PL101和PL102无论是在胸腺嘧啶核苷丰富还是贫乏的环境下，均能保持突变性状稳定，这对疫苗载体菌候选株来讲是极其重要的。
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3.大肠杆菌DH5α thyA基因的PCR扩增：PCR经29轮循环后的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上的结果如图1所示。由图1可见，PCR扩增产物约在1.13kb左右，与预计的thyA基因大小一致，且在图中未见非特异扩增条带。
图1 大肠杆菌thyA基因的PCR扩增
Fig 1. PCR products of thyA gene
1. Marker: λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ; 2. PCR products in E. coli; 3. Negative control; 4. PCR products in IEM101; 5. Marker: λDNA/HindⅢ
4.大肠杆菌thyA基因与霍乱弧菌IEM101 thyA基因同源性的研究：用如上所述的PCR产物，经Dig标记后作为探针，分别在68℃、53℃、42℃与IEM101的染色体DNA进行打点杂交，从图2可见均没有特异的杂交出现，表明两者的同源性很低。
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5.pXXB106的构建：PCR扩增大肠杆菌thyA基因产物用Klenow酶补平后再用SacⅠ酶切，载体pUC18用SacⅠ-SmaⅠ双酶切后，连接两片段并转化PL101，涂于CBT培养基，挑取单菌落，提取质粒、酶切鉴定，与预计的3.8kb大小相符(图3)，命名为pXXB106。
图2 大肠杆菌thyA基因探针与IEM101染色体在42℃、53℃和68℃杂交结果。
Fig 2. Dot blot hybridization of chromosome DNA of IEM101 with thyA gene of E. coli as the probe at 42℃, 53℃ and 68℃
1. Chromosome DNA of E. coli (positive control); 2. Chromosome DNA of IEM101; 3. PCR products of asd gene (negative control); 4. Chromosome DNA of 395
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图3 重组质粒pXXB106酶切鉴定结果
Fig 3. Identification of recombinant pXXB106 plasmid by enzyme digestion
1. Marker: λDNA/HindⅢ; 2. pXXB106; 3. pUC18
6.PL103菌株的构建：将pXXB106电击转入PL102中，涂于MM改良培养基，挑取单菌落，提取质粒，酶切后可见与原pXXB106质粒大小一致(图4)。
7.PL103菌株稳定性研究：在MM改良培养基、含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基和LB培养基中，传代含大肠杆菌thyA基因的PL103菌株，各传100次，每10次取各培养物适量，涂于含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基平板上，37℃过夜培养后，随机挑取100株点种于MM改良培养基，计算每100株菌中质粒丢失率，并提取质粒证实。如图5所示，PL103在MM改良培养基和LB培养基中是较稳定的，最小稳定性也在95%以上，而在含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基中传至50次时，仅有12%的菌株尚含有质粒，即在胸腺嘧啶核苷丰富(50μg/ml)的培养基中，PL103的稳定性仅为12%。
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图4 重组质粒pXXB106电击PL102前后比较
Fig 4. Comparison of recombinant pXXB106 plasmid before and after electroporation
1. pXXB106; 2. pXXB106; 3. Marker: λDNA/HindⅢ
图5 质粒稳定性研究
Fig 5. Studies on recombinant plasmid stability
1. MM modified medium; 2. LB medium; 3. MM modified medium containing 50μg/ml thymidine
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讨论
染色体-质粒致死平衡系统包含两个基本要素，即管家基因缺陷型受体菌和以管家基因作为选择标志和稳定因子的外源基因表达载体。管家基因通常存在于细菌的染色体上，它编码的产物催化细菌的基本代谢反应，该基因的缺陷导致细菌的营养缺陷型。营养缺陷型菌株在基本培养基上的生长必须依赖于相应物质的存在，或转入含有相应完整基因的重组质粒。染色体-质粒致死平衡系统正是以管家基因缺陷的菌株作为受体菌，用含有相应完整管家基因的质粒克隆外源基因，转化子因遗传互补效应而能在基本培养基上生长。此时，质粒对于细菌的生存已成为必须，而不再是可有可无，一旦转化子丢失了质粒，细菌则由于不能合成生存所必需的物质而不能生长或死亡。营养缺陷型菌株作为受体菌首先应该是稳定的，不易或不能发生回复突变，其次是所需的营养物质在动物和人体内含量极低，不能满足细菌的生长需求。芳香族氨基酸、胸腺嘧啶、二氨基庚二酸等在动物和人体内含量甚微或无，因而被广泛用于构建营养缺陷型菌株。
thyA基因编码胸苷酸合成酶(thymidylate synthase)，在体内DNA合成中起关键作用。 它催化dUMP向dTMP的转化，dTMP为DNA合成的基本原料dTTP的前体〔5〕，同时使5，10-甲基四氢叶酸转变为7，8-二氢叶酸。通常thyA基因突变株可直接从抗叶酸药物的菌株中筛选出来，用此方法已选育出的thyA突变菌株有：大肠杆菌〔3，4，9〕、鼠伤寒沙门菌〔9〕、乳球菌〔10〕、肠球菌〔11〕、嗜酸假单胞菌〔12〕、嗜麦芽黄单胞菌〔13〕、蜡样芽胞杆菌〔14〕以及苜蓿根瘤菌〔13〕，有关霍乱弧菌thyA基因突变株的筛选在国内外尚未见报道。
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霍乱弧菌对营养的要求不高，能在仅以氨盐作为唯一氮源的简单无机培养基中生存、繁殖，没有24种氨基酸的营养缺陷。但若接种量降低，则在最低营养培养基中不能生长，表明还需要某些生长因素，以促进氮源代谢过程，在此培养条件下很难进行thyA基因突变株的筛选。我们参照已有的thyA基因突变株的筛选方法及对霍乱弧菌培养特性的研究，试验了几种培养基后，发现MM改良培养基既能使霍乱弧菌可与在LB培养基上的生长一样良好，又可成功地用TMP法进行thyA基因突变株的筛选。选育出的PL102菌株无论在胸腺嘧啶核苷丰富或贫乏的培养基上，经100次转种后均未发现有回复突变的菌株，说明选育出的突变株突变性状基本稳定。该方法的建立，可方便地进行霍乱弧菌thyA基因突变株的筛选，并进而为非抗性霍乱弧菌口服活疫苗候选株的构建提供了稳定的受体候选菌株。
我们将编码胸苷酸合成酶的大肠杆菌thyA基因利用PCR插入技术克隆入质粒载体pUC18中，转化thyA基因突变导致该基因功能缺陷的霍乱弧菌IEM101菌株(PL102)，使后者在MM改良培养基上恢复生长，说明大肠杆菌thyA基因可以对霍乱弧菌thyA基因缺陷受体菌进行有效的功能互补。同时，我们用大肠杆菌thyA基因的PCR产物作为探针，与霍乱弧菌染色体DNA分别在68℃、53℃和42℃的条件下进行杂交分析，结果均为阴性，说明二者的thyA基因同源性较低，这样，两个功能相同的基因发生同源重组的机率也随之大为降低，这对以thyA基因为选择压力的thyA基因突变的霍乱弧菌染色体-大肠杆菌thyA基因致死平衡系统的稳定性来讲是非常有利的。作为体内定植并持续表达外源基因的疫苗载体质粒，其在受体菌中的稳定性是非常重要的。PL103在MM改良培养基中转种100次仍是100%稳定，在LB培养基中的稳定性为95%以上，这与仅含极微量胸腺嘧啶的人体肠道内环境是相适应的，因此也是稳定、适用的。
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综上所述，我们已成功地构建了以thyA基因为选择性压力的霍乱弧菌染色体-质粒致死平衡系统，载体质粒为3.8kb，含有7个位于LacZ基因中的可用于基因克隆的单酶切位点，这使首先在大肠杆菌中进行外源基因克隆，并进而在含IPTG和X-gal平板上的筛选非常简便、易行。质粒带有的大肠杆菌thyA基因可以对thyA基因突变的霍乱弧菌进行良好的功能互补。该系统稳定、方便、可操作性好，有望成为良好的疫苗载体系统，它的建立不仅为霍乱弧菌抗菌抗毒口服活疫苗候选株的研制开辟了一条新路，也为进一步构建肠道多价口服活疫苗奠定了基础。同时，由于霍乱弧菌具有良好的分泌性，外源基因表达的成份可分泌至胞外，因而该系统的建立还具有广阔的应用和开发前景，可作为多肽、蛋白质、细胞因子等生物活性物质的廉价加工厂，进行批量生产。
基金项目：国家“863”基金资助项目(863-102-07-03-01)
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(收稿日期：1999-03-11), http://www.100md.com