神经突触化学传递中胞吐作用的分子机制
作者：王尧 吕立夏
单位：王尧(同济大学医学院生物化学教研室，上海 200070)；吕立夏(同济大学医学院生物化学教研室，上海 200070)
关键词：
生理科学进展000323 目录
一、参与胞吐作用的相关蛋白
(一)突触囊泡膜蛋白
(二)突触前膜有关蛋白
(三)胞液可溶性蛋白质
(四)其他蛋白质
二、突触囊泡泊靠和融合的分子机制
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突触传递是神经系统实现其功能的最基本方式。详细阐述突触传递的机制对人们理解神经信息传递的特异性、行为和可塑性以及学习和记忆等都是至关重要的。近年来，随着分子生物学的发展，在分子水平阐明突触传递的机制才有可能。
神经末梢的突触前部分通常含有两类囊泡：一是透明的较小囊泡，含有乙酰胆碱、儿茶酚胺等经典递质；另一类是有致密核心的较大囊泡，含有神经肽类物质。迄今研究较深入的仅仅是前一类小囊泡，而大部分的材料来自对神经肌接头(通常其后部分不是神经元)的研究结果。小囊泡直径约50nm，一个囊泡所含的递质是释放递质的“最小包装”，是量子释放的基础，依其功能的不同可分为两种：(1)可释放的囊泡库，占总囊泡的一少部分，当神经冲动传来时，部分囊泡能与突触前膜融合，将其包含的神经递质释放至突触间隙；(2)囊泡贮存库，通常被锚定在细胞骨架网上，当细胞生理需要时可补充前一种可释放囊泡库。突触前小囊泡的释放过程称为“胞吐作用”。神经末梢的胞吐作用可能包括下述一系列步骤：(1)神经脉冲的动作电位引起突触前膜去极化；(2)引起电压门控的N型钙通道开放，Ca2+内流；(3)可释放库中部分小囊泡向突触前膜的“活性带”“泊靠”(docking)，突触囊泡蛋白与质膜蛋白相互作用而形成突触囊泡泌体(synaptosecretosome);(4)囊泡在活性带部分与突触前膜“融合”，并形成一个“融合孔”，从而使囊泡中所含的神经递质排至突触间隙中。融合过程有两种方式：一种是形成暂时的融合孔，即所谓的“吻了就跑”(kiss-and-run)的方式；另一种是全融合的方式[1]。在一般正常的情况下，以前一种方式为主；(5)“卸货”以后的囊泡，通过胞饮作用重新被回收至突触前，再次填充神经递质，并再包装恢复至起始状态。如此反复而形成突触囊泡循环。
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一、参与胞吐作用的相关蛋白
突触传递的一系列操作都是以其分子构筑为基础的。一系列的研究表明囊泡的“泊靠”及“融合”作用都由特异的蛋白质家族所介导。这些蛋白质可分为三类：(1)位于突触囊泡膜的蛋白质；(2)突触前膜上的蛋白质；(3)胞液中的蛋白质。现将迄今已经鉴定并认为涉及囊泡泊靠及融合且研究较多的一些蛋白质介绍如下。
(一)突触囊泡膜蛋白
1. 囊泡锚定蛋白(Synapsin)：Synapsin为一磷酸化蛋白家族，特异地与突触囊泡的胞浆面缔合。此家族含SynapsinⅠa、Ⅰb和Ⅱa、Ⅱb四种同源蛋白，约占总囊泡蛋白的9%。SynapsinⅠ、Ⅱ分别由单基因编码，a、b异构体为相应的转录物经不同剪辑而成；异构体的结构差异仅限于羧基端的一部分，从氨基端至大半分子序列高度同源，在不同物种中非常保守。晶体结构分析提示此区与一些ATPase结构非常相似，有高亲和性的ATP结合特性[2]。SynapsinⅠ、Ⅱ为PKA、CaMKⅠ的生理底物。体外试验中SynapsinⅠ能将囊泡锚定于神经末梢中的以肌动蛋白为基础的细胞骨架上。这种作用与神经末梢突触囊泡的生理性积聚有关，同时可调节胞吐的有效性。静息条件下，SynapsinⅠ处于去磷酸化状态，大多数囊泡被锚定于细胞骨架上；当神经元活动和发生与SynapsinⅠ相关的磷酸化作用时，囊泡、SynapsinⅠ与肌动蛋白三联体解离，促进SynapsinⅠ由“贮存库”向“可释放库”囊泡的转换。SynapsinⅡ与SynapsinⅠ有相似的性质，参与胞吐的调节。
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2. 囊泡膜缔合蛋白家族(vesicle-associated membrane protein ，VAMP/Synaptobrevin)：VAMP是突触囊泡膜的主要组成成分，在筛选电鳐电器官的cDNA文库时首先被分离(VAMP1)[3]，后来亦自牛、人等生物先后克隆了此蛋白的cDNA。电鳐VAMP的cDNA编码一120个氨基酸的蛋白，包括三个功能域：一为N端富含脯氨酸，约28个氨基酸残基，根据此区序列及长度分为三种异构体；二为中心亲水的极性功能域，在不同物种高度保守，含有9个氨基酸残基基序的重复拷贝，定名为V1和V2，V1是肉毒杆菌毒DF的识别位点，V2则是肉毒杆菌毒素F的结合位点[3]。三为C端的疏水区，将VAMP锚定于囊泡膜上。VAMP有三个异构体VAMP 1、VAMP 2和细胞短蛋白(cellubrevin)，但差异分布。异构体有相似的功能，异构体的不同分布与其介导不同种类细胞的胞吐机制有关。VAMP含有两个两性螺旋结构，能够与其他蛋白的超螺旋-超螺旋区域结合，也能与脂类相互作用。
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3. 囊泡纤夫蛋白(synaptotagmin，Syt) 即p65：它是第一个被分离出的突触囊泡整合蛋白，在神经组织和非神经组织中均有表达。至今已分离出8个异构体，其中5个为脑特异的，至少SytⅠ在突触囊泡膜高度富集。Syt含有一个单一的跨膜域，一个小的囊泡内域及一个大的胞浆尾。胞浆尾含两个C2功能域，分别与PKC的Ca2+调节区、磷脂结合区同源。靠近囊泡膜最近的C2域定名为C2A，与Syx、磷脂结合，晶体学分析显示Syt的C2A域仅有一个可鉴定的钙结合位点，为Ca2+的传感器。第二个C2域定名为C2B，能与笼形蛋白结合蛋白AP2结合，与胞吞有关。C2A与C2B域差异调控突触囊胞运输[4]。Syt的C端也可与突触前膜外伸蛋白neurexin结合。体外试验表明Syt能与多种分子相互作用，与囊泡向活性带的泊靠运动有关,因此被命名为“囊泡纤夫蛋白”。果蝇Syt缺陷的突变体表现诱发的神经递质释放明显降低，而自发的量子式释放的频率明显增加，在枪乌贼大突触的突触前末梢注射Syt能够抑制递质释放。
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4.囊泡整合蛋白家族(synaptophysin family)：此家族包括囊泡整合蛋白(synaptophysin,Syn)、突触孔蛋白(synaptoporin)、疏泡蛋白(pathophysin，HL-5)、囊泡循环蛋白(synaptogyrin)等，它们具有相似的立体结构：(1)分子量小，平均为25～29kD；(2)所有蛋白域腔(lumenal)内有偶数半胱氨酸残基，可形成二硫键；(3)所有蛋白存在于高度弯曲的细胞器上，赋于膜弯曲区域的高度稳定性；(4)所有蛋白在非神经元细胞中有其相对应的异构体，表明它们是细胞质膜的基本组成成分，对细胞内膜运输的调节有重要作用。
(1)囊泡整合蛋白： 即p38，它是一种主要的突触囊泡膜的整合蛋白，占突触囊泡分级组成的7%，有四个跨膜域，C端及N端均面向胞浆面，有糖基化位点，在胞浆尾有一些小的氨基酸串的重复序列。CaMKⅡ作用于Syn的丝氨酸残基，原癌基因c-src 产物pp60作用于Syn的酪氨酸残基。Syn对突触囊泡的融合及递质释放非常必要。抗Syn抗体及Syn mRNA的反义寡核苷酸均能抑制Ca2+-依赖的神经递质释放。Syn具有离子通道活性以及同型低聚性质(homooligomerization)，在脂质双层重建时形成通道，主要参与胞吐融合孔的形成，但胞吐融合孔的形成与开放需Syn与定位于质膜的另一蛋白泡友蛋白(physiophilin)相互作用[5]。
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(2)突触孔蛋白：与Syn有58%的同源性，穿膜区高度保守，而胞浆区段不同。
(3)囊泡循环蛋白：又称p29，是均一分布于神经系统的突触囊泡蛋白，在神经元及神经内分泌细胞高度表达，它是酪氨酸激酶的一个重要的囊泡相关底物。synaptogyrin为多基因家族编码，异构体的cDNA序列同源性为32%～46%。人的囊泡循环蛋白 cDNA有一阅读框架，编码234个氨基酸，分子量约25,683Da，有四个跨膜域，N端与C端朝向囊泡的胞质面，无糖基化位点，蛋白分子胞浆尾的氨基酸序列与Syp有74%的同源性。
(4)疏泡蛋白: 在所有细胞中均有表达。
5.原癌基因产物 Rab3a：Rab是ras超家族的最大的亚家族成员，为小分子量的GTP-结合蛋白，至少有40个Rab蛋白被分离[6]，特异地定位于不同的细胞器及运输囊泡。与GTPase一样，Rab蛋白通过结合核苷酸的磷酸化状态在不同的构象之间转换。在细胞内膜运输的过程中，Rab蛋白的GTP-GDP的循环常伴随与膜的结合与解离，这些蛋白质作为分子转换器穿梭于活性及失活的构象之间。对神经元而言，Rab3主要参与介导胞吐机制。Rab3有四种异构体，分别为Rab3a、 Rab3b、 Rab3c和 Rab3d，它们氨基酸序列同源性在77%～85%。其中Rab3a丰度最高，与Rab3c特异地在神经元及神经内分泌细胞中表达。应用酵母双杂交系统分离的两个Rab3a的效应子为Rabphilin 3a和与Rab相互作用分子(Rab interacting molecular, RIM)[6]。
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6.双C2域蛋白(DOC2)：DOC2为新近发现的一个突触囊泡相关蛋白，因有两个C2域(Double C2)而得名。其C端的两个C2域分别结合钙和磷脂。Naito等自人小脑cDNA文库克隆了DOC2另一同源物为DOC2α，DOC2α高度富集于突触囊泡，主要在神经元中表达[7]。
7.位于突触囊泡的蛋白激酶及磷蛋白：包括pp60c-src+、CaMKⅡ、酪蛋白激酶Ⅱ，突触囊泡维系磷蛋白(synaptic vesicle-associated phosphoprotein，SVAPP)等亦可能与囊泡的运输有关。
(二)突触前膜有关蛋白
1.突触前膜列阵蛋白(syntaxin,Syx)：Bennett等先后从大鼠中分离出六个Syx相关蛋白，称之为Syx家族[8]。它们有相似的结构特点：含288～301个氨基酸残基，C端高度疏水，为膜锚定功能域，含有数个α-螺旋的超螺旋-超螺旋(coil)的结构，靠近C端的一个超螺旋-超螺旋域约有70(201～269)个氨基酸残基，在家族中高度保守，介导Syx与其它蛋白的相互作用。SyxA和B亦称p35A及p35B，后被改名为Syx1A和Syx 1B，两者氨基酸序列有84%的同源性，是神经系统特有的囊泡蛋白。定位于轴突和树突，分子量35kD， pI约5.1。Syt通过竞争Syx的N端结合位点以阻止α-SNAP的结合。Syx是肉毒杆菌毒素C1的底物。Syx对囊泡导向及融合有重要作用。
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2.突触体维系蛋白-25(synaptosomal-associated protein of 25kD, SNAP-25)：因分子量25kD而得名。SNAP-25的N端和C端面向胞质，C端与VAMP结合，C端也是肉毒杆菌毒素A和E蛋白以及梭菌毒素的靶的。SNAP-25特异地在神经元表达，定位于突触。SNAP-25有两个异构体a与b，它们分布不同[9]。在神经元发育过程中差异表达。SNAP-25除了与递质释放有关，它在发育过程中与轴突的延伸也有关系。
3.生长相关蛋白-43(growth-associated protein-43，GAP-43)： 亦称F1，B-50，神经调素(neuromodulin)或pp46。在轴突生长、神经再生及长时程增强(LTP)中均有作用。GAP-43通过半胱氨酸软脂酰化定位于突触前膜的胞浆面。其N端对于CaM结合、PKC磷酸化及膜靶向十分重要，而C端有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。在大鼠脑及神经营养因子依赖的已分化的P12细胞发现GAP-43能与突触核心复合体(Syx、SNAP-25和VAMP)相互作用，亦能与syt和CaM作用，这种作用是Ca2+依赖的，并且偶联PKC介导GAP-43的磷酸化[10]。GAP-43通过与CaM的相互作用从而改变钙的水平，所以它被看作CaM的“海绵”(calmodulin sponge)。改变GAP-43的可溶库将改变它对神经递质释放的影响。
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4.突触前膜外伸蛋白(neurexin)：neurexin是高度多形性神经元表面蛋白的一个大家族，分子量29～220kD不等。编码该蛋白基因有两种，经RNA选择性剪辑产生1000多个异构体。neurexin有一个较短的胞内域和一个很长的胞外域[11]，后者含有层粘连蛋白(laminin)A同源的G功能域；此域在集聚蛋白(agrin)、基底膜蛋白聚糖(perlecan)以及裂隙蛋白(slit protein)等中也存在。其C端细胞内40个氨基酸残基能与Syt结合。据证实：此蛋白在细胞识别和/或突触发生中有作用；通过黑寡妇蜘蛛毒对它的作用，推测它在神经递质释放过程中亦扮演某种角色。
5.半胱氨酸串连蛋白(cysteine string protein, CSP)：CSP特异定位于中枢及周围神经的富含突触的区域，CSP分子量为22kD，C端有一富含半胱氨酸串的功能域，此域由11个连续的半胱氨酸残基组成；N端含有一个“J功能域”，此域与各种热休克蛋白相互作用，J域中保守的三肽(HPD)序列对此作用非常重要。在调节胞吐过程中发挥“分子伴侣”作用，可影响蛋白质构象的稳定性或蛋白复合物的组装。在蛙卵母细胞中发现CSP对N型Ca2+通道表达十分重要。果蝇CSP的无义突变及严重的减效突变均有致死表型，小部分存活者诱发突触电位缺陷。果蝇CSP基因敲除后导致温度敏感的诱发递质释放的障碍[12]。
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6.泡友蛋白 (physophilin)：它是膜整合蛋白。大鼠脑突触体及小鼠脑的初代培养物所鉴定的泡友蛋白为36kD，pI约7.8，为单链结构。它与Syn相互作用，在囊泡向突触膜泊靠并与之融合的过程中起一定作用。
(三)胞液可溶性蛋白质
1.n-Sec Ⅰ：分子量68kD，在神经元中特异表达。多种不同种属的同源物已被分离，如酵母sec Ⅰp、线虫unc-18和果蝇rop。同一种属的单细胞中，也往往有数种异构体表达。n-Sec Ⅰ在神经递质释放起作用的观点得到遗传学实验的强有力的支持。线虫的unc-18的突变显示为瘫痪表型，有乙酰胆碱积聚，提示递质释放的缺陷；突变主要影响突触囊泡向活性带的泊靠。unc-18直接与Syx的超螺旋—超螺旋相互作用[13]。rop基因过度表达时，其胚胎神经肌接头能显著减弱诱发突触电位的强度及自发突触电位的频率。
2.N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ehtylmaleimide-sensitive factor, NSF)：NSF是一种可溶性的胞液蛋白，在神经元中NSF与突触囊泡紧密结合；NSF与膜的结合由SNAPs和SNAREs所介导。NSF分子量75kD，为同源二聚体，有ATP酶活性。NSF分子由三个功能域组成，有两个ATP结合域(D1，D2)和一个N端功能域，对ATP结合功能域进行定向突变实验表明：它对膜融合过程是必不可少的。
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3.可溶性NSF附着蛋白(soluble NSF attachment proteins,SNAPs)：必需说明此处的SNAPs与前述的SNAP-25虽然缩写符号类似，但两者是无关的。SNAPs是包括一类35～40kD蛋白质的家族的统称。SNAPs有三种异构体:α-SNAP(35kD)、β-SNAP(36kD)和γ-SNAP(39kD)。α-SNAP和γ-SNAP表达广泛，β-SNAP为脑组织特异的。当SNAPs与特异的膜受体结合后，能够募集NSF至膜上。β-SNAP能与Syt相互作用，可能在Ca2+调节的胞吐作用过程中有作用[14]。
(四)其他蛋白质参与胞吐作用的侯选者可能还包括：(1)磷脂酰肌醇转移蛋白(posphatidylinositol transfer protein，PITP)和磷脂酰肌醇-4-磷酸5-磷酸激酶(phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase, PIP5K)；(2)膜联蛋白(annexins)；(3)Exo蛋白；(4)分泌必需的钙依赖性活化蛋白(calcium-dependent activator protein for secretion， CAPS)；(5)胞转相关蛋白(transcytosis-associated protein ，TAP)等。
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涉及胞吐作用的蛋白质不断有新的“候选者”被发现，可以预见，随着科学的发展，新成员会陆续诞生，这将为阐明胞吐作用的分子机制铺平最后的冲刺道路。
二、突触囊泡泊靠和融合的分子机制
目前SNARE学说被公认为突触神经递质释放的机制[15]。SNARE为Soluble NSF attachment protein receptor的缩写，即可溶性NSF附着蛋白受体。此学说认为SNARE由囊泡的靶向/泊靠核心复合物组成，是NSF的受体。当NSF依赖的ATP水解，使SNARE复合物解体，触发膜的融合。简言之，在装配成泊靠复合体之前，N-secⅠ与Syx结合在一起，而VAMP是与Syn连接在一起的，从而起到一种制动的作用。当囊泡泊靠启动时，n-secⅠ与Syx解聚，导致由Syx、Syt、VAMP和SNAP-25形成一种复合物。进而当α-SNAP与此种复合物结合，而Syt却与此复合物解离。一旦α-SNAP结合，继之NSF亦加盟进一步形成更大的20S复合物。如能防止ATP水解，此种复合物是稳定的；而当ATP水解时，这一多元复合物解离并导致膜融合发生。
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SNARE复合物由VAMP、Syx和SNAP-25组成，从人到酵母高度同源。SNARE的形成是介导胞吐作用的关键步骤，形成的复合物蛋白质之间结合十分牢固，可抵抗SDS的溶解作用。 参与调节泊靠过程的候选者首推n-secⅠ蛋白，它能与SNAP-25及VAMP竞争性地与Syx结合，从而抑制SNARE复合物的形成。利用果蝇n-secⅠ(rop)过度表达的体内实验已证实了这一点。另一方面，通过体内交联实验的结果表明：VAMP与Syn之间的缔合，在泊靠复合物的形成上也具有调节作用。VAMP要么与Syn缔合，要么参与SNARE复合物的形成，两者不可兼得。最近Tolar等[16]提出另一种看法：对温度敏感的果蝇NSF突变体中研究结果提示NSF的作用主要是解散SNARE复合物或使SNARE重排，这种重排对于维持突触囊泡的可释放库是必需的。
触发突触囊泡与其泊靠的突触前膜活性带部分发生膜融合，首先是由ATP水解引发；而ATP的水解被认为主要是NSF导致的，尽管有些报道称另有他种ATP水解过程参与。其次，临融合发生之前是一个钙依赖性步骤；虽然在上述的学说中未能包括一个钙依赖过程，但推测钙的敏感性可能需要一种目前尚不知道的其他成分(例如脂类物质)的介入。新近研究表明，膜融合这一关键性步骤的调控是由两个相反作用的蛋白所介导，Syt作为融合过程的钙传感器对于Ca2+触发的囊泡释放是必须的，而Rab3则可限制囊泡的融合数目，以便使Ca2+能以短暂的、有限的重复信号发挥作用[17]。
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有报道称：一些参与磷脂酰肌醇代谢的蛋白质，在某些体系的分泌过程中是至关重要的，这些成分可能改变局部脂质双层，从而降低膜融合的自由能，另一方面，磷脂可以直接与钙结合并改变可融合性(fusability)，这一事实进一步强调了局部的脂质环境在囊泡融合过程中的重要意义。
显而易见，膜融合的详细机制、钙触发的环节、囊泡的再循环细节以及生理调控的方式和位点均有待于进一步深入研究，方能最终阐明胞吐作用的详细机制。
参考文献
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一、参与胞吐作用的相关蛋白
(一)突触囊泡膜蛋白
(二)突触前膜有关蛋白
(三)胞液可溶性蛋白质
(四)其他蛋白质
二、突触囊泡泊靠和融合的分子机制
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突触传递是神经系统实现其功能的最基本方式。详细阐述突触传递的机制对人们理解神经信息传递的特异性、行为和可塑性以及学习和记忆等都是至关重要的。近年来，随着分子生物学的发展，在分子水平阐明突触传递的机制才有可能。
神经末梢的突触前部分通常含有两类囊泡：一是透明的较小囊泡，含有乙酰胆碱、儿茶酚胺等经典递质；另一类是有致密核心的较大囊泡，含有神经肽类物质。迄今研究较深入的仅仅是前一类小囊泡，而大部分的材料来自对神经肌接头(通常其后部分不是神经元)的研究结果。小囊泡直径约50nm，一个囊泡所含的递质是释放递质的“最小包装”，是量子释放的基础，依其功能的不同可分为两种：(1)可释放的囊泡库，占总囊泡的一少部分，当神经冲动传来时，部分囊泡能与突触前膜融合，将其包含的神经递质释放至突触间隙；(2)囊泡贮存库，通常被锚定在细胞骨架网上，当细胞生理需要时可补充前一种可释放囊泡库。突触前小囊泡的释放过程称为“胞吐作用”。神经末梢的胞吐作用可能包括下述一系列步骤：(1)神经脉冲的动作电位引起突触前膜去极化；(2)引起电压门控的N型钙通道开放，Ca2+内流；(3)可释放库中部分小囊泡向突触前膜的“活性带”“泊靠”(docking)，突触囊泡蛋白与质膜蛋白相互作用而形成突触囊泡泌体(synaptosecretosome);(4)囊泡在活性带部分与突触前膜“融合”，并形成一个“融合孔”，从而使囊泡中所含的神经递质排至突触间隙中。融合过程有两种方式：一种是形成暂时的融合孔，即所谓的“吻了就跑”(kiss-and-run)的方式；另一种是全融合的方式[1]。在一般正常的情况下，以前一种方式为主；(5)“卸货”以后的囊泡，通过胞饮作用重新被回收至突触前，再次填充神经递质，并再包装恢复至起始状态。如此反复而形成突触囊泡循环。
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突触传递的一系列操作都是以其分子构筑为基础的。一系列的研究表明囊泡的“泊靠”及“融合”作用都由特异的蛋白质家族所介导。这些蛋白质可分为三类：(1)位于突触囊泡膜的蛋白质；(2)突触前膜上的蛋白质；(3)胞液中的蛋白质。现将迄今已经鉴定并认为涉及囊泡泊靠及融合且研究较多的一些蛋白质介绍如下。
(一)突触囊泡膜蛋白
1. 囊泡锚定蛋白(Synapsin)：Synapsin为一磷酸化蛋白家族，特异地与突触囊泡的胞浆面缔合。此家族含SynapsinⅠa、Ⅰb和Ⅱa、Ⅱb四种同源蛋白，约占总囊泡蛋白的9%。SynapsinⅠ、Ⅱ分别由单基因编码，a、b异构体为相应的转录物经不同剪辑而成；异构体的结构差异仅限于羧基端的一部分，从氨基端至大半分子序列高度同源，在不同物种中非常保守。晶体结构分析提示此区与一些ATPase结构非常相似，有高亲和性的ATP结合特性[2]。SynapsinⅠ、Ⅱ为PKA、CaMKⅠ的生理底物。体外试验中SynapsinⅠ能将囊泡锚定于神经末梢中的以肌动蛋白为基础的细胞骨架上。这种作用与神经末梢突触囊泡的生理性积聚有关，同时可调节胞吐的有效性。静息条件下，SynapsinⅠ处于去磷酸化状态，大多数囊泡被锚定于细胞骨架上；当神经元活动和发生与SynapsinⅠ相关的磷酸化作用时，囊泡、SynapsinⅠ与肌动蛋白三联体解离，促进SynapsinⅠ由“贮存库”向“可释放库”囊泡的转换。SynapsinⅡ与SynapsinⅠ有相似的性质，参与胞吐的调节。
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2. 囊泡膜缔合蛋白家族(vesicle-associated membrane protein ，VAMP/Synaptobrevin)：VAMP是突触囊泡膜的主要组成成分，在筛选电鳐电器官的cDNA文库时首先被分离(VAMP1)[3]，后来亦自牛、人等生物先后克隆了此蛋白的cDNA。电鳐VAMP的cDNA编码一120个氨基酸的蛋白，包括三个功能域：一为N端富含脯氨酸，约28个氨基酸残基，根据此区序列及长度分为三种异构体；二为中心亲水的极性功能域，在不同物种高度保守，含有9个氨基酸残基基序的重复拷贝，定名为V1和V2，V1是肉毒杆菌毒DF的识别位点，V2则是肉毒杆菌毒素F的结合位点[3]。三为C端的疏水区，将VAMP锚定于囊泡膜上。VAMP有三个异构体VAMP 1、VAMP 2和细胞短蛋白(cellubrevin)，但差异分布。异构体有相似的功能，异构体的不同分布与其介导不同种类细胞的胞吐机制有关。VAMP含有两个两性螺旋结构，能够与其他蛋白的超螺旋-超螺旋区域结合，也能与脂类相互作用。
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3. 囊泡纤夫蛋白(synaptotagmin，Syt) 即p65：它是第一个被分离出的突触囊泡整合蛋白，在神经组织和非神经组织中均有表达。至今已分离出8个异构体，其中5个为脑特异的，至少SytⅠ在突触囊泡膜高度富集。Syt含有一个单一的跨膜域，一个小的囊泡内域及一个大的胞浆尾。胞浆尾含两个C2功能域，分别与PKC的Ca2+调节区、磷脂结合区同源。靠近囊泡膜最近的C2域定名为C2A，与Syx、磷脂结合，晶体学分析显示Syt的C2A域仅有一个可鉴定的钙结合位点，为Ca2+的传感器。第二个C2域定名为C2B，能与笼形蛋白结合蛋白AP2结合，与胞吞有关。C2A与C2B域差异调控突触囊胞运输[4]。Syt的C端也可与突触前膜外伸蛋白neurexin结合。体外试验表明Syt能与多种分子相互作用，与囊泡向活性带的泊靠运动有关,因此被命名为“囊泡纤夫蛋白”。果蝇Syt缺陷的突变体表现诱发的神经递质释放明显降低，而自发的量子式释放的频率明显增加，在枪乌贼大突触的突触前末梢注射Syt能够抑制递质释放。
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4.囊泡整合蛋白家族(synaptophysin family)：此家族包括囊泡整合蛋白(synaptophysin,Syn)、突触孔蛋白(synaptoporin)、疏泡蛋白(pathophysin，HL-5)、囊泡循环蛋白(synaptogyrin)等，它们具有相似的立体结构：(1)分子量小，平均为25～29kD；(2)所有蛋白域腔(lumenal)内有偶数半胱氨酸残基，可形成二硫键；(3)所有蛋白存在于高度弯曲的细胞器上，赋于膜弯曲区域的高度稳定性；(4)所有蛋白在非神经元细胞中有其相对应的异构体，表明它们是细胞质膜的基本组成成分，对细胞内膜运输的调节有重要作用。
(1)囊泡整合蛋白： 即p38，它是一种主要的突触囊泡膜的整合蛋白，占突触囊泡分级组成的7%，有四个跨膜域，C端及N端均面向胞浆面，有糖基化位点，在胞浆尾有一些小的氨基酸串的重复序列。CaMKⅡ作用于Syn的丝氨酸残基，原癌基因c-src 产物pp60作用于Syn的酪氨酸残基。Syn对突触囊泡的融合及递质释放非常必要。抗Syn抗体及Syn mRNA的反义寡核苷酸均能抑制Ca2+-依赖的神经递质释放。Syn具有离子通道活性以及同型低聚性质(homooligomerization)，在脂质双层重建时形成通道，主要参与胞吐融合孔的形成，但胞吐融合孔的形成与开放需Syn与定位于质膜的另一蛋白泡友蛋白(physiophilin)相互作用[5]。
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(2)突触孔蛋白：与Syn有58%的同源性，穿膜区高度保守，而胞浆区段不同。
(3)囊泡循环蛋白：又称p29，是均一分布于神经系统的突触囊泡蛋白，在神经元及神经内分泌细胞高度表达，它是酪氨酸激酶的一个重要的囊泡相关底物。synaptogyrin为多基因家族编码，异构体的cDNA序列同源性为32%～46%。人的囊泡循环蛋白 cDNA有一阅读框架，编码234个氨基酸，分子量约25,683Da，有四个跨膜域，N端与C端朝向囊泡的胞质面，无糖基化位点，蛋白分子胞浆尾的氨基酸序列与Syp有74%的同源性。
(4)疏泡蛋白: 在所有细胞中均有表达。
5.原癌基因产物 Rab3a：Rab是ras超家族的最大的亚家族成员，为小分子量的GTP-结合蛋白，至少有40个Rab蛋白被分离[6]，特异地定位于不同的细胞器及运输囊泡。与GTPase一样，Rab蛋白通过结合核苷酸的磷酸化状态在不同的构象之间转换。在细胞内膜运输的过程中，Rab蛋白的GTP-GDP的循环常伴随与膜的结合与解离，这些蛋白质作为分子转换器穿梭于活性及失活的构象之间。对神经元而言，Rab3主要参与介导胞吐机制。Rab3有四种异构体，分别为Rab3a、 Rab3b、 Rab3c和 Rab3d，它们氨基酸序列同源性在77%～85%。其中Rab3a丰度最高，与Rab3c特异地在神经元及神经内分泌细胞中表达。应用酵母双杂交系统分离的两个Rab3a的效应子为Rabphilin 3a和与Rab相互作用分子(Rab interacting molecular, RIM)[6]。
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6.双C2域蛋白(DOC2)：DOC2为新近发现的一个突触囊泡相关蛋白，因有两个C2域(Double C2)而得名。其C端的两个C2域分别结合钙和磷脂。Naito等自人小脑cDNA文库克隆了DOC2另一同源物为DOC2α，DOC2α高度富集于突触囊泡，主要在神经元中表达[7]。
7.位于突触囊泡的蛋白激酶及磷蛋白：包括pp60c-src+、CaMKⅡ、酪蛋白激酶Ⅱ，突触囊泡维系磷蛋白(synaptic vesicle-associated phosphoprotein，SVAPP)等亦可能与囊泡的运输有关。
(二)突触前膜有关蛋白
1.突触前膜列阵蛋白(syntaxin,Syx)：Bennett等先后从大鼠中分离出六个Syx相关蛋白，称之为Syx家族[8]。它们有相似的结构特点：含288～301个氨基酸残基，C端高度疏水，为膜锚定功能域，含有数个α-螺旋的超螺旋-超螺旋(coil)的结构，靠近C端的一个超螺旋-超螺旋域约有70(201～269)个氨基酸残基，在家族中高度保守，介导Syx与其它蛋白的相互作用。SyxA和B亦称p35A及p35B，后被改名为Syx1A和Syx 1B，两者氨基酸序列有84%的同源性，是神经系统特有的囊泡蛋白。定位于轴突和树突，分子量35kD， pI约5.1。Syt通过竞争Syx的N端结合位点以阻止α-SNAP的结合。Syx是肉毒杆菌毒素C1的底物。Syx对囊泡导向及融合有重要作用。
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2.突触体维系蛋白-25(synaptosomal-associated protein of 25kD, SNAP-25)：因分子量25kD而得名。SNAP-25的N端和C端面向胞质，C端与VAMP结合，C端也是肉毒杆菌毒素A和E蛋白以及梭菌毒素的靶的。SNAP-25特异地在神经元表达，定位于突触。SNAP-25有两个异构体a与b，它们分布不同[9]。在神经元发育过程中差异表达。SNAP-25除了与递质释放有关，它在发育过程中与轴突的延伸也有关系。
3.生长相关蛋白-43(growth-associated protein-43，GAP-43)： 亦称F1，B-50，神经调素(neuromodulin)或pp46。在轴突生长、神经再生及长时程增强(LTP)中均有作用。GAP-43通过半胱氨酸软脂酰化定位于突触前膜的胞浆面。其N端对于CaM结合、PKC磷酸化及膜靶向十分重要，而C端有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。在大鼠脑及神经营养因子依赖的已分化的P12细胞发现GAP-43能与突触核心复合体(Syx、SNAP-25和VAMP)相互作用，亦能与syt和CaM作用，这种作用是Ca2+依赖的，并且偶联PKC介导GAP-43的磷酸化[10]。GAP-43通过与CaM的相互作用从而改变钙的水平，所以它被看作CaM的“海绵”(calmodulin sponge)。改变GAP-43的可溶库将改变它对神经递质释放的影响。
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4.突触前膜外伸蛋白(neurexin)：neurexin是高度多形性神经元表面蛋白的一个大家族，分子量29～220kD不等。编码该蛋白基因有两种，经RNA选择性剪辑产生1000多个异构体。neurexin有一个较短的胞内域和一个很长的胞外域[11]，后者含有层粘连蛋白(laminin)A同源的G功能域；此域在集聚蛋白(agrin)、基底膜蛋白聚糖(perlecan)以及裂隙蛋白(slit protein)等中也存在。其C端细胞内40个氨基酸残基能与Syt结合。据证实：此蛋白在细胞识别和/或突触发生中有作用；通过黑寡妇蜘蛛毒对它的作用，推测它在神经递质释放过程中亦扮演某种角色。
5.半胱氨酸串连蛋白(cysteine string protein, CSP)：CSP特异定位于中枢及周围神经的富含突触的区域，CSP分子量为22kD，C端有一富含半胱氨酸串的功能域，此域由11个连续的半胱氨酸残基组成；N端含有一个“J功能域”，此域与各种热休克蛋白相互作用，J域中保守的三肽(HPD)序列对此作用非常重要。在调节胞吐过程中发挥“分子伴侣”作用，可影响蛋白质构象的稳定性或蛋白复合物的组装。在蛙卵母细胞中发现CSP对N型Ca2+通道表达十分重要。果蝇CSP的无义突变及严重的减效突变均有致死表型，小部分存活者诱发突触电位缺陷。果蝇CSP基因敲除后导致温度敏感的诱发递质释放的障碍[12]。
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6.泡友蛋白 (physophilin)：它是膜整合蛋白。大鼠脑突触体及小鼠脑的初代培养物所鉴定的泡友蛋白为36kD，pI约7.8，为单链结构。它与Syn相互作用，在囊泡向突触膜泊靠并与之融合的过程中起一定作用。
(三)胞液可溶性蛋白质
1.n-Sec Ⅰ：分子量68kD，在神经元中特异表达。多种不同种属的同源物已被分离，如酵母sec Ⅰp、线虫unc-18和果蝇rop。同一种属的单细胞中，也往往有数种异构体表达。n-Sec Ⅰ在神经递质释放起作用的观点得到遗传学实验的强有力的支持。线虫的unc-18的突变显示为瘫痪表型，有乙酰胆碱积聚，提示递质释放的缺陷；突变主要影响突触囊泡向活性带的泊靠。unc-18直接与Syx的超螺旋—超螺旋相互作用[13]。rop基因过度表达时，其胚胎神经肌接头能显著减弱诱发突触电位的强度及自发突触电位的频率。
2.N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ehtylmaleimide-sensitive factor, NSF)：NSF是一种可溶性的胞液蛋白，在神经元中NSF与突触囊泡紧密结合；NSF与膜的结合由SNAPs和SNAREs所介导。NSF分子量75kD，为同源二聚体，有ATP酶活性。NSF分子由三个功能域组成，有两个ATP结合域(D1，D2)和一个N端功能域，对ATP结合功能域进行定向突变实验表明：它对膜融合过程是必不可少的。
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3.可溶性NSF附着蛋白(soluble NSF attachment proteins,SNAPs)：必需说明此处的SNAPs与前述的SNAP-25虽然缩写符号类似，但两者是无关的。SNAPs是包括一类35～40kD蛋白质的家族的统称。SNAPs有三种异构体:α-SNAP(35kD)、β-SNAP(36kD)和γ-SNAP(39kD)。α-SNAP和γ-SNAP表达广泛，β-SNAP为脑组织特异的。当SNAPs与特异的膜受体结合后，能够募集NSF至膜上。β-SNAP能与Syt相互作用，可能在Ca2+调节的胞吐作用过程中有作用[14]。
(四)其他蛋白质参与胞吐作用的侯选者可能还包括：(1)磷脂酰肌醇转移蛋白(posphatidylinositol transfer protein，PITP)和磷脂酰肌醇-4-磷酸5-磷酸激酶(phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase, PIP5K)；(2)膜联蛋白(annexins)；(3)Exo蛋白；(4)分泌必需的钙依赖性活化蛋白(calcium-dependent activator protein for secretion， CAPS)；(5)胞转相关蛋白(transcytosis-associated protein ，TAP)等。
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涉及胞吐作用的蛋白质不断有新的“候选者”被发现，可以预见，随着科学的发展，新成员会陆续诞生，这将为阐明胞吐作用的分子机制铺平最后的冲刺道路。
二、突触囊泡泊靠和融合的分子机制
目前SNARE学说被公认为突触神经递质释放的机制[15]。SNARE为Soluble NSF attachment protein receptor的缩写，即可溶性NSF附着蛋白受体。此学说认为SNARE由囊泡的靶向/泊靠核心复合物组成，是NSF的受体。当NSF依赖的ATP水解，使SNARE复合物解体，触发膜的融合。简言之，在装配成泊靠复合体之前，N-secⅠ与Syx结合在一起，而VAMP是与Syn连接在一起的，从而起到一种制动的作用。当囊泡泊靠启动时，n-secⅠ与Syx解聚，导致由Syx、Syt、VAMP和SNAP-25形成一种复合物。进而当α-SNAP与此种复合物结合，而Syt却与此复合物解离。一旦α-SNAP结合，继之NSF亦加盟进一步形成更大的20S复合物。如能防止ATP水解，此种复合物是稳定的；而当ATP水解时，这一多元复合物解离并导致膜融合发生。
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SNARE复合物由VAMP、Syx和SNAP-25组成，从人到酵母高度同源。SNARE的形成是介导胞吐作用的关键步骤，形成的复合物蛋白质之间结合十分牢固，可抵抗SDS的溶解作用。 参与调节泊靠过程的候选者首推n-secⅠ蛋白，它能与SNAP-25及VAMP竞争性地与Syx结合，从而抑制SNARE复合物的形成。利用果蝇n-secⅠ(rop)过度表达的体内实验已证实了这一点。另一方面，通过体内交联实验的结果表明：VAMP与Syn之间的缔合，在泊靠复合物的形成上也具有调节作用。VAMP要么与Syn缔合，要么参与SNARE复合物的形成，两者不可兼得。最近Tolar等[16]提出另一种看法：对温度敏感的果蝇NSF突变体中研究结果提示NSF的作用主要是解散SNARE复合物或使SNARE重排，这种重排对于维持突触囊泡的可释放库是必需的。
触发突触囊泡与其泊靠的突触前膜活性带部分发生膜融合，首先是由ATP水解引发；而ATP的水解被认为主要是NSF导致的，尽管有些报道称另有他种ATP水解过程参与。其次，临融合发生之前是一个钙依赖性步骤；虽然在上述的学说中未能包括一个钙依赖过程，但推测钙的敏感性可能需要一种目前尚不知道的其他成分(例如脂类物质)的介入。新近研究表明，膜融合这一关键性步骤的调控是由两个相反作用的蛋白所介导，Syt作为融合过程的钙传感器对于Ca2+触发的囊泡释放是必须的，而Rab3则可限制囊泡的融合数目，以便使Ca2+能以短暂的、有限的重复信号发挥作用[17]。
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有报道称：一些参与磷脂酰肌醇代谢的蛋白质，在某些体系的分泌过程中是至关重要的，这些成分可能改变局部脂质双层，从而降低膜融合的自由能，另一方面，磷脂可以直接与钙结合并改变可融合性(fusability)，这一事实进一步强调了局部的脂质环境在囊泡融合过程中的重要意义。
显而易见，膜融合的详细机制、钙触发的环节、囊泡的再循环细节以及生理调控的方式和位点均有待于进一步深入研究，方能最终阐明胞吐作用的详细机制。
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