大鼠钠尿肽B受体cDNA探针克隆载体的构建
作者：董明清 朱妙章 于军 高瞻 吕顺燕 郭海涛 冯华松
单位：董明清 朱妙章 于军 高瞻 吕顺燕 郭海涛(第四军医大学：基础部生理学教研室，陕西 西安 710032)；冯华松(唐都医院呼吸内科)
关键词：受体，钠尿肽；克隆；cDNA探针
心脏杂志000516摘 要：目的：构建大鼠钠尿肽B受体cDNA探针克隆载体，为研究该受体 基因表达奠定基础。方法：设计钠尿肽B受体特异的PCR引物，提取大鼠肺组织 总RNA，进行反转录PCR，扩增目的片段，回收目的片段，将其克隆入pGEM-T载体，酶切鉴 定并用双脱氧法测序。结果：PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定与所设计引物 大 小一致，克隆入pGEM-T载体后酶切可切出所需片段，测序证实为所设计序列。结 论：构建的pGEM-T重组质粒为进一步研究该受体基因表达、分布等创造了条件。
, 百拇医药 中图分类号：R33 文献标识码：A
文章编号：1005-3271(2000)05-038 7-02
Construction of cDNA probe clone vector for natriuretic peptide B receptor
DONG Ming-qing
(Department of Physiology)
ZHU Miao-zhang
(Department of Physiology)
YU Jun
(Department of Physiology)
, 百拇医药
GAO Zhan
(Department of Physiology)
LU Shun-ya n
(Department of Physiology)
GUO Hai-tao
(Department of Physiology)
FENG Hua-song
(Department of Respiratory， Tan gdu Hospital，Fourth Military Medical University, Xi'an 710032，Shaanxi, China)
, 百拇医药
Abstract： AIM: To construction of cDNA probe clone vector for B receptor of natriuretic peptide. METHODS: SD rat lungs were employed to clone the fragment of natriuretic peptide B receptor. Total RNA molecules were i solated from fresh lungs and mRNA were reversely transcriped into cDNAs. After a mplification by PCR,the fragment of DNA were cloned into vector pGEM-T. The met hod of dideoxy-termination was employed to sequence. RESULT: The gene fragment of B receptor of natriuretic peptide was successfully cloned in pGEM-T vector and the sequence was correct. CONCLUSION: The clone vector constr ucted can be a source of cDNA probe for natriuretic peptide B receptor and was u seful in study its gene express.
, http://www.100md.com
Key words：receptor，natriuretic peptide； clone； cDNA probe
钠尿肽家族具有利钠尿、扩血管、抗有丝分裂等多种效应，是维护体内水、电解质平衡 和血压稳定的重要肽类体液因子，包括心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)和C型钠尿肽 (CNP)等。钠尿肽受体有A，B，C三个亚型，其中A受体和B受体是鸟苷酸环化酶偶联受体， 钠尿肽与A、B受体结合后，激活鸟苷酸环化酶，通过升高细胞内cGMP发挥生理效应；C受体 为非偶联受体，主要介导钠尿肽的清除。正常情况下，三种受体在体内均广泛分布，但不同 组织中分布有很大差异，提示钠尿肽家族对不同组织器官生理性调控作用的差异。本研究中 作者通过应用反转录PCR等分子克隆技术，构建了大鼠钠尿肽B受体cDNA探针克隆载体，为研 究该受体基因在生理、病理条件下的基因表达与调控奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、DNA Ladder(100～1000 bp)、异丙基硫代 -β-D-半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β- D-半乳糖苷(X-gal)、大肠杆 菌JM109菌株、总RNA提取试剂盒、琼脂糖-DNA回收试剂盒均购自华美公司，质粒载体pGEM -T Vector、反转录试剂盒购自美国Promega公司，限制性内切酶EcoR52 I购自TaKaRa公司 ，质粒提取试剂盒购自博大公司，PCR引物由上海基康生物工程公司合成 ，PCR仪为美国Pro gene公司产品。
, 百拇医药
1.2 引物设计 根据Genebank检索结果及文献[1]报道引物序列，并经过计 算机引物辅助设计软件辅助设计了大鼠钠尿肽B受体引物，5′端引物序列(位于cDNA的1048 -1071位)为5′GCC CCA TCC CTG ATG AAC CTC ATT 3′, 3′端引物序列(位于cDNA的1398 -1411位)为5′CTT GGA CGA CCC ATC CTG TGA TAA 3′。
1.3 目的基因片段cDNA的获取、扩增 用总RNA提取试剂盒从健康成年SD大鼠新鲜肺 组织中提取总RNA，按反转录试剂盒说明将mRNA反转录成cDNA。PCR反应体系：总体积25 μl ，反转录cDNA模板2 μl，每种引物各12.5 pmol/L，4×dNTP(各2.5 mmol/L)混合物2 μl ， 10×PCR Reaction buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 2.5 μl, Taq DNA聚合酶1 U，加 灭菌去离子水至25 μl体积。PCR反应条件为：首次循环94℃ 3 min，中间94℃ 60 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s循环30次，最后72℃ 20 min。PCR产物经15 g/L 琼脂糖凝胶电泳[2]。
, 百拇医药
1.4 目的基因片段克隆、测序 用琼脂糖-DNA回收试剂盒回收特异性扩增的目的 片段，回收产物和pGEM-T载体连接，取连接反应产物转化入感受态大肠杆菌JM109菌株，经 氨卞青霉素和蓝白筛选，挑取白色菌落克隆扩大培养，以质粒提取试剂盒提取质粒经EcoR52 I酶切鉴定。阳性克隆的序列测定由上海基康生物技术有限公司完成。
2 结果
2.1 钠尿肽B受体基因片段PCR扩增 取扩增产物10 μl进行1 5 g/L 琼脂糖凝胶电泳，结果显示(图1)扩增片段长度约为374 bp，与预期大小基本相符 。
2.2 B受体基因扩增片段重组、克隆 电泳显示，插入片段大小与预期一致(图2) 。
2.3 序列测定 经EcoR52 I酶切鉴定为阳性的克隆由上海基康生物工程公司用ABI 377测序仪测序，测序结果经Genebank检索证实与预期序列完全一致，见图3。
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图 1 PCR扩增产物15 g/L 琼脂糖凝胶电泳结果
a. DNA marker; b. PCR产物
图 2 重组质粒及其酶切产物15 g/L 琼脂糖凝胶电泳结果
a.未经酶切的重组质粒；b. 重组质粒经EcoR52 I酶切产物；
c.100bp-1kb DNA Ladder
5′GCCCCATCCCTGATGAACCTCATTGCGGGCTGCTTCTAT
GATGGAATCCTGCTCTATGCCCAAGTCCTGAATGAGACAA
, 百拇医药
TACAGGAAGGGGGCACCCGGGAAGATGGACTTCGAATTGT
GGAGAAGATGCAGGGACGAAGATACCATGGTGTAACTGGA
CTGGTTGTTATGGACAAGAACAATGACAGAGAGACTGATT
TCGTCCTGTGGGCCATGGGAGACTTGGAGTCTGGCGACTT
TCAGCCTGCAGCCCATTACTCAGGAGCTGAGAAGCAGATT
TGGTGGACAGGCCGGCCAATTCCCTGGGTGAAGGGGGCCC
CACCTTTGGACAACCCCCCCTGTGCCTTTGACTTGGACGA
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CCCATCCTGTGATAA 3′
图 3 克隆的钠尿肽B受体基因片段序列，斜体为引物序列
3 讨论
基因探针可分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等，其中cDNA探针 互补于mRNA分子，对于检测基因表达尤其有用。cDNA探针并常克隆于载体中，具有可无限繁 殖，取之不尽，制备简单，不易降解，标志方法成熟等DNA探针的优点，又较寡核苷酸探针 特异性强，复杂度高，可获较强的杂交信号，因而在基因表达检测中应用更为广泛。
本研究中作者从大鼠新鲜肺组织中提取总RNA，应用反转录PCR扩增技术扩增了钠尿肽B受体c DNA片段，并成功克隆入pGEM-T载体中，经酶切鉴定大小与所设计片段大小相符，双脱氧法测序证实为钠尿肽B受体基因片段，与所设计序列 完全一致，这表明已成功构建了cDNA探针克隆载体。
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研究表明，在充血性心力衰竭、高血压、肺动脉高压等多种病理状态下，不但血浆钠尿肽水 平发生变化，而且钠尿肽受体会上调或下调[3～7]，从而更好地发挥调控作用。钠 尿肽B受体是C-型钠尿肽发挥生物活性的主要结合受体，在血管平滑肌细胞及多种组织器官 中均有广泛分布，作者成功构建的cDNA探针克隆载体，为进一步研究C-型钠尿肽和钠尿 肽B受体在不同生理病理过程中表达水平的变化及其调节奠定了基础。
基金项目：国家自 然科学基金资助项目 No.39770317, No.39970327
参考文献：
[1] Li H, Oparil S, Meng QC, et al. Selective downregulation of AN P -clearance receptor gene expression in lung of rats adapted to hypoxia[J]. Am J physiol,1995,268(2 pt 1):1328.
, 百拇医药
[2] 萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂 T, et al. 分子克隆实验指南[M]. 第2 版. 北京：科学技术出版社，1996.
[3] Lisy O, Burnett JC Jr. Potential future therapies: natriuretic peptide s[J]. Coron Artery Dis, 1999，10(6):389.
[4] Schrier RW, Abraham WT. Hormones and hemodynamics in heart failure[J ]. N Engl J Med, 1999,341(8):577.
[5] Mills RM, Lejemtel TH, Horton DP, et al. Sustained hemodynamic eff ects of an infusion of nesiritide (human b-type natriuretic peptide) in heart f ailure: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. Natreco r Study Group[J]. J Am Coll Cardiol, 1999, 34(1):155.
, http://www.100md.com
[6] Sasaki T, Kubo T, Komamura K, et al. Effects of long-term treatment with pimobendan on neurohumoral factors in patients with non-ischemic chronic m oderate heart failure[J]. J Cardiol, 1999, 33(6):317.
[7] Mair J, Friedl W, Thomas S， et al. Natriuretic peptides in assessment of left-ventricular dysfunction[J]. Scand J Clin Lab Invest Suppl， 1999 ，230:132
(收稿 1999-12-29), http://www.100md.com
单位：董明清 朱妙章 于军 高瞻 吕顺燕 郭海涛(第四军医大学：基础部生理学教研室，陕西 西安 710032)；冯华松(唐都医院呼吸内科)
关键词：受体，钠尿肽；克隆；cDNA探针
心脏杂志000516摘 要：目的：构建大鼠钠尿肽B受体cDNA探针克隆载体，为研究该受体 基因表达奠定基础。方法：设计钠尿肽B受体特异的PCR引物，提取大鼠肺组织 总RNA，进行反转录PCR，扩增目的片段，回收目的片段，将其克隆入pGEM-T载体，酶切鉴 定并用双脱氧法测序。结果：PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定与所设计引物 大 小一致，克隆入pGEM-T载体后酶切可切出所需片段，测序证实为所设计序列。结 论：构建的pGEM-T重组质粒为进一步研究该受体基因表达、分布等创造了条件。
, 百拇医药 中图分类号：R33 文献标识码：A
文章编号：1005-3271(2000)05-038 7-02
Construction of cDNA probe clone vector for natriuretic peptide B receptor
DONG Ming-qing
(Department of Physiology)
ZHU Miao-zhang
(Department of Physiology)
YU Jun
(Department of Physiology)
, 百拇医药
GAO Zhan
(Department of Physiology)
LU Shun-ya n
(Department of Physiology)
GUO Hai-tao
(Department of Physiology)
FENG Hua-song
(Department of Respiratory， Tan gdu Hospital，Fourth Military Medical University, Xi'an 710032，Shaanxi, China)
, 百拇医药
Abstract： AIM: To construction of cDNA probe clone vector for B receptor of natriuretic peptide. METHODS: SD rat lungs were employed to clone the fragment of natriuretic peptide B receptor. Total RNA molecules were i solated from fresh lungs and mRNA were reversely transcriped into cDNAs. After a mplification by PCR,the fragment of DNA were cloned into vector pGEM-T. The met hod of dideoxy-termination was employed to sequence. RESULT: The gene fragment of B receptor of natriuretic peptide was successfully cloned in pGEM-T vector and the sequence was correct. CONCLUSION: The clone vector constr ucted can be a source of cDNA probe for natriuretic peptide B receptor and was u seful in study its gene express.
, http://www.100md.com
Key words：receptor，natriuretic peptide； clone； cDNA probe
钠尿肽家族具有利钠尿、扩血管、抗有丝分裂等多种效应，是维护体内水、电解质平衡 和血压稳定的重要肽类体液因子，包括心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)和C型钠尿肽 (CNP)等。钠尿肽受体有A，B，C三个亚型，其中A受体和B受体是鸟苷酸环化酶偶联受体， 钠尿肽与A、B受体结合后，激活鸟苷酸环化酶，通过升高细胞内cGMP发挥生理效应；C受体 为非偶联受体，主要介导钠尿肽的清除。正常情况下，三种受体在体内均广泛分布，但不同 组织中分布有很大差异，提示钠尿肽家族对不同组织器官生理性调控作用的差异。本研究中 作者通过应用反转录PCR等分子克隆技术，构建了大鼠钠尿肽B受体cDNA探针克隆载体，为研 究该受体基因在生理、病理条件下的基因表达与调控奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、DNA Ladder(100～1000 bp)、异丙基硫代 -β-D-半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β- D-半乳糖苷(X-gal)、大肠杆 菌JM109菌株、总RNA提取试剂盒、琼脂糖-DNA回收试剂盒均购自华美公司，质粒载体pGEM -T Vector、反转录试剂盒购自美国Promega公司，限制性内切酶EcoR52 I购自TaKaRa公司 ，质粒提取试剂盒购自博大公司，PCR引物由上海基康生物工程公司合成 ，PCR仪为美国Pro gene公司产品。
, 百拇医药
1.2 引物设计 根据Genebank检索结果及文献[1]报道引物序列，并经过计 算机引物辅助设计软件辅助设计了大鼠钠尿肽B受体引物，5′端引物序列(位于cDNA的1048 -1071位)为5′GCC CCA TCC CTG ATG AAC CTC ATT 3′, 3′端引物序列(位于cDNA的1398 -1411位)为5′CTT GGA CGA CCC ATC CTG TGA TAA 3′。
1.3 目的基因片段cDNA的获取、扩增 用总RNA提取试剂盒从健康成年SD大鼠新鲜肺 组织中提取总RNA，按反转录试剂盒说明将mRNA反转录成cDNA。PCR反应体系：总体积25 μl ，反转录cDNA模板2 μl，每种引物各12.5 pmol/L，4×dNTP(各2.5 mmol/L)混合物2 μl ， 10×PCR Reaction buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 2.5 μl, Taq DNA聚合酶1 U，加 灭菌去离子水至25 μl体积。PCR反应条件为：首次循环94℃ 3 min，中间94℃ 60 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s循环30次，最后72℃ 20 min。PCR产物经15 g/L 琼脂糖凝胶电泳[2]。
, 百拇医药
1.4 目的基因片段克隆、测序 用琼脂糖-DNA回收试剂盒回收特异性扩增的目的 片段，回收产物和pGEM-T载体连接，取连接反应产物转化入感受态大肠杆菌JM109菌株，经 氨卞青霉素和蓝白筛选，挑取白色菌落克隆扩大培养，以质粒提取试剂盒提取质粒经EcoR52 I酶切鉴定。阳性克隆的序列测定由上海基康生物技术有限公司完成。
2 结果
2.1 钠尿肽B受体基因片段PCR扩增 取扩增产物10 μl进行1 5 g/L 琼脂糖凝胶电泳，结果显示(图1)扩增片段长度约为374 bp，与预期大小基本相符 。
2.2 B受体基因扩增片段重组、克隆 电泳显示，插入片段大小与预期一致(图2) 。
2.3 序列测定 经EcoR52 I酶切鉴定为阳性的克隆由上海基康生物工程公司用ABI 377测序仪测序，测序结果经Genebank检索证实与预期序列完全一致，见图3。
, 百拇医药
图 1 PCR扩增产物15 g/L 琼脂糖凝胶电泳结果
a. DNA marker; b. PCR产物
图 2 重组质粒及其酶切产物15 g/L 琼脂糖凝胶电泳结果
a.未经酶切的重组质粒；b. 重组质粒经EcoR52 I酶切产物；
c.100bp-1kb DNA Ladder
5′GCCCCATCCCTGATGAACCTCATTGCGGGCTGCTTCTAT
GATGGAATCCTGCTCTATGCCCAAGTCCTGAATGAGACAA
, 百拇医药
TACAGGAAGGGGGCACCCGGGAAGATGGACTTCGAATTGT
GGAGAAGATGCAGGGACGAAGATACCATGGTGTAACTGGA
CTGGTTGTTATGGACAAGAACAATGACAGAGAGACTGATT
TCGTCCTGTGGGCCATGGGAGACTTGGAGTCTGGCGACTT
TCAGCCTGCAGCCCATTACTCAGGAGCTGAGAAGCAGATT
TGGTGGACAGGCCGGCCAATTCCCTGGGTGAAGGGGGCCC
CACCTTTGGACAACCCCCCCTGTGCCTTTGACTTGGACGA
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CCCATCCTGTGATAA 3′
图 3 克隆的钠尿肽B受体基因片段序列，斜体为引物序列
3 讨论
基因探针可分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等，其中cDNA探针 互补于mRNA分子，对于检测基因表达尤其有用。cDNA探针并常克隆于载体中，具有可无限繁 殖，取之不尽，制备简单，不易降解，标志方法成熟等DNA探针的优点，又较寡核苷酸探针 特异性强，复杂度高，可获较强的杂交信号，因而在基因表达检测中应用更为广泛。
本研究中作者从大鼠新鲜肺组织中提取总RNA，应用反转录PCR扩增技术扩增了钠尿肽B受体c DNA片段，并成功克隆入pGEM-T载体中，经酶切鉴定大小与所设计片段大小相符，双脱氧法测序证实为钠尿肽B受体基因片段，与所设计序列 完全一致，这表明已成功构建了cDNA探针克隆载体。
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研究表明，在充血性心力衰竭、高血压、肺动脉高压等多种病理状态下，不但血浆钠尿肽水 平发生变化，而且钠尿肽受体会上调或下调[3～7]，从而更好地发挥调控作用。钠 尿肽B受体是C-型钠尿肽发挥生物活性的主要结合受体，在血管平滑肌细胞及多种组织器官 中均有广泛分布，作者成功构建的cDNA探针克隆载体，为进一步研究C-型钠尿肽和钠尿 肽B受体在不同生理病理过程中表达水平的变化及其调节奠定了基础。
基金项目：国家自 然科学基金资助项目 No.39770317, No.39970327
参考文献：
[1] Li H, Oparil S, Meng QC, et al. Selective downregulation of AN P -clearance receptor gene expression in lung of rats adapted to hypoxia[J]. Am J physiol,1995,268(2 pt 1):1328.
, 百拇医药
[2] 萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂 T, et al. 分子克隆实验指南[M]. 第2 版. 北京：科学技术出版社，1996.
[3] Lisy O, Burnett JC Jr. Potential future therapies: natriuretic peptide s[J]. Coron Artery Dis, 1999，10(6):389.
[4] Schrier RW, Abraham WT. Hormones and hemodynamics in heart failure[J ]. N Engl J Med, 1999,341(8):577.
[5] Mills RM, Lejemtel TH, Horton DP, et al. Sustained hemodynamic eff ects of an infusion of nesiritide (human b-type natriuretic peptide) in heart f ailure: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. Natreco r Study Group[J]. J Am Coll Cardiol, 1999, 34(1):155.
, http://www.100md.com
[6] Sasaki T, Kubo T, Komamura K, et al. Effects of long-term treatment with pimobendan on neurohumoral factors in patients with non-ischemic chronic m oderate heart failure[J]. J Cardiol, 1999, 33(6):317.
[7] Mair J, Friedl W, Thomas S， et al. Natriuretic peptides in assessment of left-ventricular dysfunction[J]. Scand J Clin Lab Invest Suppl， 1999 ，230:132
(收稿 1999-12-29), http://www.100md.com