强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞HLA-B27抗原的纯化
作者：官健 金大地 史占军 丁红 陆洁 曹琼 武大林
单位：官健(510515 广州，第一军医大学南方医院脊柱骨病科)；金大地(510515 广州，第一军医大学南方医院脊柱骨病科)；史占军(510515 广州，第一军医大学南方医院脊柱骨病科) 丁红(外科实验室) 陆洁(外科实验室) 曹琼(外科实验室) 武大林(外科实验室)
关键词：脊柱炎，强直性；色谱法，亲和；HLA-B27抗原
中华风湿病学杂志000407 【摘 要】 目的 纯化强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞表面的HLA-B27抗原。方法 HLA-B27单抗(FD705)亲和层析法。结果 纯化的抗原蛋白经SDS-PAGE显示为单一条带，经分析其相对分子量为56 400。结论 经此法可成功纯化强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞HLA-B27抗原。
Purification of HLA-B27 on peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis
, http://www.100md.com
GUAN Jian,JIN Dadi,SHI Zhanjun,et al.
Department of Orthopaedics,Nanfang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou 510515,China
【Abstract】 Objective To purify HLA-B27 on the surface of peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis.Method Specific affinity column,cyanogen bromide-activated sepharose 4B column coupled to anti-HLA-B27 monoclonal antibodies,was used for HLA-B27 purification.Results The purified antigen by this method showed a single band by SDS-PAGE,with a molecular mass of 56 400.Conclusion HLA-B27 on the surface of peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis is successfully purified.
, 百拇医药
【Key words】 Spondylitis,ankylosing； Chromatography,affinity； HLA-B27 antigen
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种主要侵犯中轴关节，以骶髂关节炎和脊柱强直为主要特点的风湿性疾病。病因及发病机制迄今未明。AS和HLA-B27之间存在着密切联系。本实验采用亲和层析法对AS患者外周血中的单个核细胞表面的HLA-B27抗原进行了纯化，旨在为进一步研究HLA-B27在AS发病中的作用提供物质基础。
1 资料与方法
1.1 病例来源
2例AS患者(经两种方法，PCR-SSP和单抗板细胞毒反应，确定为HLA-B27阳性)，均发生双髋关节强直于屈髋位，于我院施行双侧全髋假体置换手术，收集术中失血备用。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 单个核细胞分离：采用Ficoll淋巴细胞分离液进行，收集上层细胞，用生理盐水反复清洗后-80℃冻存。
1.2.2 亲和层析柱的制备：采用溴化氰活化的Sepharose 4B(Pharmacia)，每毫升凝胶约连接HLA-B27单抗(FD705，Lambda)2 mg，4 ℃保存于Tris缓冲液(0.025 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，0.02% NaN3，pH 7.3)中。具体制备方法参照文献[1]。
1.2.3 HLA-B27的纯化：参照Boisgérault等[2]的方法。具体如下：将分离的单个核细胞(108～109)裂解于TES (0.05 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，pH 7.4)缓冲液中，其中含Aprotinin 1%，Pepstatin 10-5mol/L，Leupeptin 10-5mol/L，苯*****化物2 mmol/L，碘化乙酰胺2.5 mmol/L，NP-40 1%，4 ℃处理1 h后，100 000×g离心1 h。取上清液按以下顺序过柱：①连接正常小鼠IgG的溴化氰活化的Sepharose 4B柱；②连接HLA-B27单抗的溴化氰活化的Sepharose 4B柱。完成后以大量TES缓冲液洗柱，然后用0.05 mol/L乙二胺，pH 11.5，将两柱分别洗脱，洗脱液以1 mol/L Tris，pH 7.4，立即中和，将此液以蒸馏水透析后冻干备用。
, 百拇医药
1.2.4 SDS-PAGE分析纯度：采用12%分离胶，以0.1%考马斯亮蓝R250(水∶甲醇∶冰醋酸＝5∶5∶2配制)染色1 h，放入含40%甲醇和10%冰醋酸的水溶液中脱色至背景清晰。用凝胶图像光密度分析系统(UVP-GDS7500型)扫描并分析条带相对分子量。
2 结 果
Marker选用低分子量标准蛋白(珠海东风生化试剂厂)，经亲和层析法分离、纯化的蛋白在SDS-PAGE中显示为单一条带，经分析其相对分子量为56 400。
3 讨 论
AS好发于青壮年男性，患者可因疼痛、活动受限和逐渐发展的畸形而严重影响劳动力和生活质量，而患者家庭因需支付长期的医疗费用而负担沉重，故研究AS的发病机制及临床诊治意义重大。1973年Brewerton等[3]发现人类组织相容性Ⅰ类抗原HLA-B27与AS发病密切相关，90%以上AS患者表达HLA-B27，而一般人群中HLA-B27阳性率只有3%～7%。迄今为止，在发现的所有与疾病相关的HLA抗原中，HLA-B27与AS的相关性最大。
, 百拇医药
HLA-B27分子是由2条多肽链组成的，一条是α链或重链，约44 000，包括3个侧链α1、α2和α3，它们与另一条β链或轻链，即β2微球蛋白(约12 000)结合共同组成B27分子，其相对分子量约56 000。以往纯化的HLA-B27分子均来源于HLA-B27基因转染的细胞株，然后对其提呈的多肽进行研究，但这不能反映体内的真实情况，更无法比较出B27(+)AS患者与B27(+)正常人群的差异。为实现这一目的，本实验采用了HLA-B27单抗—FD705(与其他抗原无交叉反应)亲和层析法纯化AS患者外周血单个核细胞表面的HLA-B27抗原。结果显示，经此法纯化的抗原蛋白在SDS-PAGE中显示为单一条带，分析其相对分子量为56 400，证实为高纯度的HLA-B27抗原。本实验在国内外尚未见报道，对进一步研究HLA-B27与AS发病的关系具有重要意义。
参 考 文 献
, 百拇医药 1.白英，沈倍奋，程知义，等.单克隆抗体在临床医学中的应用.北京：人民军医出版社，1985.289-308.
2.Boisgérault F,Khalil I,Tieng V,et al.Definition of the HLA-A29 peptide ligand motif allows prediction of potential T-cell epitopes from the retinal soluble antigen,a candidate autoantigen in birdshot retinopathy.Proc Natl Acad Sci USA,1996，93:3466-3470.
3.Brewerton DA,Hart FD,Caffrey M,et al.Ankylosing spondylitis and HLA-B27.Lancet,1973,1:904-907.
(收稿日期：1999-11-12), 百拇医药
单位：官健(510515 广州，第一军医大学南方医院脊柱骨病科)；金大地(510515 广州，第一军医大学南方医院脊柱骨病科)；史占军(510515 广州，第一军医大学南方医院脊柱骨病科) 丁红(外科实验室) 陆洁(外科实验室) 曹琼(外科实验室) 武大林(外科实验室)
关键词：脊柱炎，强直性；色谱法，亲和；HLA-B27抗原
中华风湿病学杂志000407 【摘 要】 目的 纯化强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞表面的HLA-B27抗原。方法 HLA-B27单抗(FD705)亲和层析法。结果 纯化的抗原蛋白经SDS-PAGE显示为单一条带，经分析其相对分子量为56 400。结论 经此法可成功纯化强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞HLA-B27抗原。
Purification of HLA-B27 on peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis
, http://www.100md.com
GUAN Jian,JIN Dadi,SHI Zhanjun,et al.
Department of Orthopaedics,Nanfang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou 510515,China
【Abstract】 Objective To purify HLA-B27 on the surface of peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis.Method Specific affinity column,cyanogen bromide-activated sepharose 4B column coupled to anti-HLA-B27 monoclonal antibodies,was used for HLA-B27 purification.Results The purified antigen by this method showed a single band by SDS-PAGE,with a molecular mass of 56 400.Conclusion HLA-B27 on the surface of peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis is successfully purified.
, 百拇医药
【Key words】 Spondylitis,ankylosing； Chromatography,affinity； HLA-B27 antigen
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种主要侵犯中轴关节，以骶髂关节炎和脊柱强直为主要特点的风湿性疾病。病因及发病机制迄今未明。AS和HLA-B27之间存在着密切联系。本实验采用亲和层析法对AS患者外周血中的单个核细胞表面的HLA-B27抗原进行了纯化，旨在为进一步研究HLA-B27在AS发病中的作用提供物质基础。
1 资料与方法
1.1 病例来源
2例AS患者(经两种方法，PCR-SSP和单抗板细胞毒反应，确定为HLA-B27阳性)，均发生双髋关节强直于屈髋位，于我院施行双侧全髋假体置换手术，收集术中失血备用。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 单个核细胞分离：采用Ficoll淋巴细胞分离液进行，收集上层细胞，用生理盐水反复清洗后-80℃冻存。
1.2.2 亲和层析柱的制备：采用溴化氰活化的Sepharose 4B(Pharmacia)，每毫升凝胶约连接HLA-B27单抗(FD705，Lambda)2 mg，4 ℃保存于Tris缓冲液(0.025 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，0.02% NaN3，pH 7.3)中。具体制备方法参照文献[1]。
1.2.3 HLA-B27的纯化：参照Boisgérault等[2]的方法。具体如下：将分离的单个核细胞(108～109)裂解于TES (0.05 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，pH 7.4)缓冲液中，其中含Aprotinin 1%，Pepstatin 10-5mol/L，Leupeptin 10-5mol/L，苯*****化物2 mmol/L，碘化乙酰胺2.5 mmol/L，NP-40 1%，4 ℃处理1 h后，100 000×g离心1 h。取上清液按以下顺序过柱：①连接正常小鼠IgG的溴化氰活化的Sepharose 4B柱；②连接HLA-B27单抗的溴化氰活化的Sepharose 4B柱。完成后以大量TES缓冲液洗柱，然后用0.05 mol/L乙二胺，pH 11.5，将两柱分别洗脱，洗脱液以1 mol/L Tris，pH 7.4，立即中和，将此液以蒸馏水透析后冻干备用。
, 百拇医药
1.2.4 SDS-PAGE分析纯度：采用12%分离胶，以0.1%考马斯亮蓝R250(水∶甲醇∶冰醋酸＝5∶5∶2配制)染色1 h，放入含40%甲醇和10%冰醋酸的水溶液中脱色至背景清晰。用凝胶图像光密度分析系统(UVP-GDS7500型)扫描并分析条带相对分子量。
2 结 果
Marker选用低分子量标准蛋白(珠海东风生化试剂厂)，经亲和层析法分离、纯化的蛋白在SDS-PAGE中显示为单一条带，经分析其相对分子量为56 400。
3 讨 论
AS好发于青壮年男性，患者可因疼痛、活动受限和逐渐发展的畸形而严重影响劳动力和生活质量，而患者家庭因需支付长期的医疗费用而负担沉重，故研究AS的发病机制及临床诊治意义重大。1973年Brewerton等[3]发现人类组织相容性Ⅰ类抗原HLA-B27与AS发病密切相关，90%以上AS患者表达HLA-B27，而一般人群中HLA-B27阳性率只有3%～7%。迄今为止，在发现的所有与疾病相关的HLA抗原中，HLA-B27与AS的相关性最大。
, 百拇医药
HLA-B27分子是由2条多肽链组成的，一条是α链或重链，约44 000，包括3个侧链α1、α2和α3，它们与另一条β链或轻链，即β2微球蛋白(约12 000)结合共同组成B27分子，其相对分子量约56 000。以往纯化的HLA-B27分子均来源于HLA-B27基因转染的细胞株，然后对其提呈的多肽进行研究，但这不能反映体内的真实情况，更无法比较出B27(+)AS患者与B27(+)正常人群的差异。为实现这一目的，本实验采用了HLA-B27单抗—FD705(与其他抗原无交叉反应)亲和层析法纯化AS患者外周血单个核细胞表面的HLA-B27抗原。结果显示，经此法纯化的抗原蛋白在SDS-PAGE中显示为单一条带，分析其相对分子量为56 400，证实为高纯度的HLA-B27抗原。本实验在国内外尚未见报道，对进一步研究HLA-B27与AS发病的关系具有重要意义。
参 考 文 献
, 百拇医药 1.白英，沈倍奋，程知义，等.单克隆抗体在临床医学中的应用.北京：人民军医出版社，1985.289-308.
2.Boisgérault F,Khalil I,Tieng V,et al.Definition of the HLA-A29 peptide ligand motif allows prediction of potential T-cell epitopes from the retinal soluble antigen,a candidate autoantigen in birdshot retinopathy.Proc Natl Acad Sci USA,1996，93:3466-3470.
3.Brewerton DA,Hart FD,Caffrey M,et al.Ankylosing spondylitis and HLA-B27.Lancet,1973,1:904-907.
(收稿日期：1999-11-12), 百拇医药