几丁质作为植骨材料生物相容性的实验研究
作者：陈富林 毛天球 曹梅讯 吴军正
单位：第四军医大学口腔医学院(陈富林 毛天球 吴军正)；中国科学院上海昆虫研究所 (曹梅讯)
关键词：几丁质；植骨材料；成骨细胞
实用口腔医学杂志990402 〔摘要〕 目的: 观察几丁质作为植骨材料的生物相容性。方法:通过体外实验与体内实验相结合的方法研究。结果: 几丁质对人成骨细胞具有良好的相容性,不影响人成骨细胞的增殖及ALP活性,人成骨细胞可以在几丁质膜表面较好地贴附和伸展, 但增殖较慢。培养40 d时可以形成矿化结节。几丁质植入肌肉中，周围组织无明显炎症反应，未发现组织变性和坏死，并可完全降解。结论:几丁质具有较好的骨性生物相容性，但仍需提高其表面活性。
Biocompatibility of chitin as bone substitute material
, 百拇医药
Chen Fulin,Mao Tianqiu,Cao Meixun,et al. Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To investigate the biocompatibility of chitin as bone substitute material.Methods:In vitro and in vivo model was employed for the study.Results:Extraction of chitin had no poisonous effect on the proliferation and ALP activity of human osteoblasts,and cells adhered and expanded well on the surface of chitin,but proliferated slowly;mineralized nodule was found 40 days after cells had been seeded on the membrane.In the in vivo test it was observed that chitin had no toxicity on surrounding tissue,and soft tissue could soon grow into its pores;20 mg chitin was completely degraded 6 weeks after implanted subcutaneously into mouse back and 10 weeks into mouse leg muscular porch.Conclusion:Chitin may be suitable for bone substitute material,but its surface shoud be modified to meet the requirments for bone inductive activity.
, 百拇医药
Key words Chitin;Bone substitute material;Osteoblast
医用材料的生物学评价已引起了人们的广泛重视，根据安全、有效的原则，理想的生物材料不仅要有临床所需的理化特性及有效性，同时还需要有良好的生物相容性。近年来,几丁质及其衍生物作为生物材料获得了广泛的重视〔1〕。本文重点研究了几丁质作为植骨材料的生物相容性。
1 材料与方法
1.1 材料
精制蚕蛹几丁质(中科院上海昆虫研究所)，MTT(Sigma)， ALP检测试剂盒(台湾BGH公司)，DMEM培养液(Gibco)。
1.2 方法
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1.2.1 几丁质浸出液对培养人成骨细胞(OB)增殖的影响
①几丁质浸出液的制备
盘状几丁质，计算其表面积后按每平方厘米加入10 ml DMEM培养液，置于37 ℃ DMEM培养液中， 24 h后取上清，加入FBS使之成为含体积分数为10%FBS的浸出液并作为起始浓度，按倍比稀释作梯度测试。
②人胚成骨细胞(OB)的培养
按司徒镇强等〔2〕介绍的方法进行。
③几丁质浸出液对人OB增殖的影响
取第五代人OB，胰酶消化后调整细胞浓度至2×104/ml，加入96孔板，每孔100 μl。培养24 h后，弃去培养液及未贴壁的细胞，加入倍比稀释的浸出液，共设6组，1/1(原始浸出液)、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，每组4孔,对照组仅加培养液。培养96 h后,进行MTT测定，结果进行统计学分析。
, 百拇医药
④几丁质浸出液对人OB ALP活性的影响
分组及浸出液加入同1.2.1.3, 细胞接种浓度为5×104/ml,每孔加入100 μl。培养96 h后，进行ALP测定，结果进行统计学分析。
⑤几丁质体内降解速度的实验研究
重20 mg块状几丁质，无菌条件下植入小鼠背部皮下和股部肌肉中。分别于术后2、4、6、8、10、12 周各处死4只小鼠，取出材料,干燥后称重。
⑥多孔几丁质组织相容性的实验研究
制备多孔几丁质,植入小鼠股部肌袋中，分别于术后2、4、6、8 周取材，进行材料周围软组织的肉眼观察及组织学检查。
⑦人OB在几丁质膜上生长及矿化的观察
, 百拇医药
在几丁质膜上接种人成骨细胞后，用矿化液进行培养,倒置显微镜观察。连续培养40 d，分别于3、20和40 d时取出标本,扫描电镜观察。
2 结 果
2.1 人OB的培养
人OB形状主要为三角形和四方形，5 d左右长满瓶底，此时细胞外观为铺路石状(图1)。用钙-钴法进行ALP染色，大部分细胞为阳性，胞浆染成棕黑色。
图1 第二代人成骨细胞(倒置显微镜，×100)
2.2 几丁质浸出液对人OB增殖的影响
MTT加入后4 h,各培养孔底部都有紫黑色结晶形成,基本均匀一致。测量吸光度值，经统计学分析，各组间均无显著差异(表1)。
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表1 不同浓度的几丁质浸出液对人OB增殖及ALP活性的影响
浸出液浓度
对照组
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/ 32
增殖
0.63±0.02
0.61±0.06
, 百拇医药
0.59±0.04
0.64±0.05
0.66±0.08
0.58±0.06
0.62±0.03
ALP活性
0.43±0.03
0.39±0.05
0.41±0.03
0.40±0.05
0.41±0.07
0.43±0.02
, 百拇医药
0.45±0.06
2.3 几丁质浸出液对人OB ALP活性的影响
测量吸光度值，经统计学分析各组间均无显著差异(表1)。
2.4 几丁质的降解速度
植入皮下2周时，几丁质与周围组织广泛粘连,体积膨胀；植入4周后，体积明显缩为原来大小的1/2左右；植入6 周后完全吸收。植入肌肉间隙中约10周完全吸收(图2)。
图2 几丁质的体内降解速率2.5 多孔几丁质植入肌肉中的组织学观察
植入2周时组织内可见少量中性粒细胞浸润，随时间延长逐渐消失。植入4周后，材料被组织分隔成岛状，周围有较多圆形巨噬细胞，内有大量颗粒状物质(图3)，植入8周后基本上吸收。各期标本在几丁质周围无中性粒细胞、淋巴细胞聚集现象，未见材料周围有组织坏死。
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图3 多孔几丁质植入肌间隙4周，材料被分割成岛状(HE，×40)
2.6 人OB在几丁质膜上的生长
经倒置显微镜观察，细胞3～4 h开始贴壁，约12 h左右完全伸展，约10 d长满整个膜表面。扫描电镜观察，接种3 d,细胞在几丁质膜表面形态良好,有较多伸展的突起(图4);20 d时,细胞已长满膜的表面，并开始叠层生长,局部可见合成的胶原纤维,40 d时观察到矿化结节(图5)。
图4 接种3 d，人OB在几丁质膜表面形态良好(扫描电镜，×300)
图5 接种40 d，人OB在几丁质膜表面形成矿化结节(扫描电镜，×2K)
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3 讨 论
几丁质是一种高度疏水的物质，不溶于水和大部分一般溶剂，其分子结构中的疏水基团是N-乙酰氨基，不同的取代或不同程度的脱乙酰基处理，可以获得不同理化性能的几丁质的衍生物,有学者用几丁质和聚乳酸、尼龙、聚乙烯形成共聚物, 因此几丁质及其衍生物作为生物材料有很大的潜力〔3〕。
体外培养OB已成为新型植骨材料筛选和研制的一个重要内容〔4〕。 通过观察OB在材料上的贴壁、伸展情况,测定细胞在材料上DNA、蛋白质合成及ALP活性, 可以初步判定材料表面环境对骨组织的相容性。
侯春林等〔5〕的实验证实，几丁质具有良好的生物相容性，其浸出液不影响成纤维细胞的生长，无热源反应，无溶血反应，无致敏性。但是有人报道几丁质有低致敏性〔6〕。我们采用6种浓度的几丁质浸出液进行测试，从而较全面地评价其细胞毒性。实验结果证实几丁质浸出液不影响人OB的增殖和ALP活性。从形态观察结果来看，OB可以在几丁质膜表面贴附，且伸展良好。根据六类毒性分级法，几丁质的毒性为0～1级〔7〕。OB可以在几丁质膜上生长40 d时形成矿化结节,表明材料对细胞具有较好的相容性。但细胞在几丁质表面生长较慢,说明本实验中所用的几丁质表面并不是OB生长的理想环境，这可能与分子中的疏水基团和分子表面电荷有关。
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几丁质体内的降解过程为：几丁质在脱氨基酶的作用下变为纤维素，在纤维素酶的作用下成为纤维二糖，并最终在纤维二糖酶的作用下生成葡萄糖〔1〕,因而对机体完全无害。其降解速度与分子中所含的乙酰基数目有关,乙酰基数目越多,降解速度越慢,另外加醛后其分子间产生交联,降解速度也变慢。根据我们的实验观察，几丁质植入不同的部位吸收速度不同，植入皮下组织中仅6周就完全降解,这可能是由于不同部位的吞噬细胞数量不同所致。
综合体内与体外实验结果,可以认为几丁质对骨组织也具有良好的相容性,适于作为植骨材料而进行进一步研究,但在材料的表面处理上仍有改进的必要。
参考文献
1John P. Chitin,chitosan and related enzymes. Academic press,1984.135～148
, 百拇医药 2 司徒镇强，吴军正主编. 细胞培养, 西安. 世界图书出版公司, 1996.111～112
3 Kurita K:Efficient graft copolymerizations onto chitin derivatives.In Cardoso R edited:The international research on chitin and chitosan.6th international conference on chitin and chitosan,Poland:ZWAT ltd,1994.67～71
4 Ishaug SL,Paucher D,Siman RT,et al.Osteoblast function on synthetic biodegradable polymers.J Biomed Mater Res,1994,28:1445
5 侯春林,卢建熙,曹梅讯,等.几丁质生物学特性的研究. 中国修复与重建外科杂志,1993,2:215
6 Hirano S,Noishiki Y. The blood compatibity of chitosan and N-acylchitosans. J Biomed Mater Res, 1985.19:413
7 上海市第二医科大学生物材料研究室编.非直接接触血液的医用生物材料生物学性能的测试.上海：上海卫生出版社,1985.26～39
(收稿：1998-05-06 修回：1999-01-10), 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院(陈富林 毛天球 吴军正)；中国科学院上海昆虫研究所 (曹梅讯)
关键词：几丁质；植骨材料；成骨细胞
实用口腔医学杂志990402 〔摘要〕 目的: 观察几丁质作为植骨材料的生物相容性。方法:通过体外实验与体内实验相结合的方法研究。结果: 几丁质对人成骨细胞具有良好的相容性,不影响人成骨细胞的增殖及ALP活性,人成骨细胞可以在几丁质膜表面较好地贴附和伸展, 但增殖较慢。培养40 d时可以形成矿化结节。几丁质植入肌肉中，周围组织无明显炎症反应，未发现组织变性和坏死，并可完全降解。结论:几丁质具有较好的骨性生物相容性，但仍需提高其表面活性。
Biocompatibility of chitin as bone substitute material
, 百拇医药
Chen Fulin,Mao Tianqiu,Cao Meixun,et al. Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To investigate the biocompatibility of chitin as bone substitute material.Methods:In vitro and in vivo model was employed for the study.Results:Extraction of chitin had no poisonous effect on the proliferation and ALP activity of human osteoblasts,and cells adhered and expanded well on the surface of chitin,but proliferated slowly;mineralized nodule was found 40 days after cells had been seeded on the membrane.In the in vivo test it was observed that chitin had no toxicity on surrounding tissue,and soft tissue could soon grow into its pores;20 mg chitin was completely degraded 6 weeks after implanted subcutaneously into mouse back and 10 weeks into mouse leg muscular porch.Conclusion:Chitin may be suitable for bone substitute material,but its surface shoud be modified to meet the requirments for bone inductive activity.
, 百拇医药
Key words Chitin;Bone substitute material;Osteoblast
医用材料的生物学评价已引起了人们的广泛重视，根据安全、有效的原则，理想的生物材料不仅要有临床所需的理化特性及有效性，同时还需要有良好的生物相容性。近年来,几丁质及其衍生物作为生物材料获得了广泛的重视〔1〕。本文重点研究了几丁质作为植骨材料的生物相容性。
1 材料与方法
1.1 材料
精制蚕蛹几丁质(中科院上海昆虫研究所)，MTT(Sigma)， ALP检测试剂盒(台湾BGH公司)，DMEM培养液(Gibco)。
1.2 方法
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1.2.1 几丁质浸出液对培养人成骨细胞(OB)增殖的影响
①几丁质浸出液的制备
盘状几丁质，计算其表面积后按每平方厘米加入10 ml DMEM培养液，置于37 ℃ DMEM培养液中， 24 h后取上清，加入FBS使之成为含体积分数为10%FBS的浸出液并作为起始浓度，按倍比稀释作梯度测试。
②人胚成骨细胞(OB)的培养
按司徒镇强等〔2〕介绍的方法进行。
③几丁质浸出液对人OB增殖的影响
取第五代人OB，胰酶消化后调整细胞浓度至2×104/ml，加入96孔板，每孔100 μl。培养24 h后，弃去培养液及未贴壁的细胞，加入倍比稀释的浸出液，共设6组，1/1(原始浸出液)、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，每组4孔,对照组仅加培养液。培养96 h后,进行MTT测定，结果进行统计学分析。
, 百拇医药
④几丁质浸出液对人OB ALP活性的影响
分组及浸出液加入同1.2.1.3, 细胞接种浓度为5×104/ml,每孔加入100 μl。培养96 h后，进行ALP测定，结果进行统计学分析。
⑤几丁质体内降解速度的实验研究
重20 mg块状几丁质，无菌条件下植入小鼠背部皮下和股部肌肉中。分别于术后2、4、6、8、10、12 周各处死4只小鼠，取出材料,干燥后称重。
⑥多孔几丁质组织相容性的实验研究
制备多孔几丁质,植入小鼠股部肌袋中，分别于术后2、4、6、8 周取材，进行材料周围软组织的肉眼观察及组织学检查。
⑦人OB在几丁质膜上生长及矿化的观察
, 百拇医药
在几丁质膜上接种人成骨细胞后，用矿化液进行培养,倒置显微镜观察。连续培养40 d，分别于3、20和40 d时取出标本,扫描电镜观察。
2 结 果
2.1 人OB的培养
人OB形状主要为三角形和四方形，5 d左右长满瓶底，此时细胞外观为铺路石状(图1)。用钙-钴法进行ALP染色，大部分细胞为阳性，胞浆染成棕黑色。
图1 第二代人成骨细胞(倒置显微镜，×100)
2.2 几丁质浸出液对人OB增殖的影响
MTT加入后4 h,各培养孔底部都有紫黑色结晶形成,基本均匀一致。测量吸光度值，经统计学分析，各组间均无显著差异(表1)。
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表1 不同浓度的几丁质浸出液对人OB增殖及ALP活性的影响
浸出液浓度
对照组
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/ 32
增殖
0.63±0.02
0.61±0.06
, 百拇医药
0.59±0.04
0.64±0.05
0.66±0.08
0.58±0.06
0.62±0.03
ALP活性
0.43±0.03
0.39±0.05
0.41±0.03
0.40±0.05
0.41±0.07
0.43±0.02
, 百拇医药
0.45±0.06
2.3 几丁质浸出液对人OB ALP活性的影响
测量吸光度值，经统计学分析各组间均无显著差异(表1)。
2.4 几丁质的降解速度
植入皮下2周时，几丁质与周围组织广泛粘连,体积膨胀；植入4周后，体积明显缩为原来大小的1/2左右；植入6 周后完全吸收。植入肌肉间隙中约10周完全吸收(图2)。
图2 几丁质的体内降解速率2.5 多孔几丁质植入肌肉中的组织学观察
植入2周时组织内可见少量中性粒细胞浸润，随时间延长逐渐消失。植入4周后，材料被组织分隔成岛状，周围有较多圆形巨噬细胞，内有大量颗粒状物质(图3)，植入8周后基本上吸收。各期标本在几丁质周围无中性粒细胞、淋巴细胞聚集现象，未见材料周围有组织坏死。
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图3 多孔几丁质植入肌间隙4周，材料被分割成岛状(HE，×40)
2.6 人OB在几丁质膜上的生长
经倒置显微镜观察，细胞3～4 h开始贴壁，约12 h左右完全伸展，约10 d长满整个膜表面。扫描电镜观察，接种3 d,细胞在几丁质膜表面形态良好,有较多伸展的突起(图4);20 d时,细胞已长满膜的表面，并开始叠层生长,局部可见合成的胶原纤维,40 d时观察到矿化结节(图5)。
图4 接种3 d，人OB在几丁质膜表面形态良好(扫描电镜，×300)
图5 接种40 d，人OB在几丁质膜表面形成矿化结节(扫描电镜，×2K)
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3 讨 论
几丁质是一种高度疏水的物质，不溶于水和大部分一般溶剂，其分子结构中的疏水基团是N-乙酰氨基，不同的取代或不同程度的脱乙酰基处理，可以获得不同理化性能的几丁质的衍生物,有学者用几丁质和聚乳酸、尼龙、聚乙烯形成共聚物, 因此几丁质及其衍生物作为生物材料有很大的潜力〔3〕。
体外培养OB已成为新型植骨材料筛选和研制的一个重要内容〔4〕。 通过观察OB在材料上的贴壁、伸展情况,测定细胞在材料上DNA、蛋白质合成及ALP活性, 可以初步判定材料表面环境对骨组织的相容性。
侯春林等〔5〕的实验证实，几丁质具有良好的生物相容性，其浸出液不影响成纤维细胞的生长，无热源反应，无溶血反应，无致敏性。但是有人报道几丁质有低致敏性〔6〕。我们采用6种浓度的几丁质浸出液进行测试，从而较全面地评价其细胞毒性。实验结果证实几丁质浸出液不影响人OB的增殖和ALP活性。从形态观察结果来看，OB可以在几丁质膜表面贴附，且伸展良好。根据六类毒性分级法，几丁质的毒性为0～1级〔7〕。OB可以在几丁质膜上生长40 d时形成矿化结节,表明材料对细胞具有较好的相容性。但细胞在几丁质表面生长较慢,说明本实验中所用的几丁质表面并不是OB生长的理想环境，这可能与分子中的疏水基团和分子表面电荷有关。
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几丁质体内的降解过程为：几丁质在脱氨基酶的作用下变为纤维素，在纤维素酶的作用下成为纤维二糖，并最终在纤维二糖酶的作用下生成葡萄糖〔1〕,因而对机体完全无害。其降解速度与分子中所含的乙酰基数目有关,乙酰基数目越多,降解速度越慢,另外加醛后其分子间产生交联,降解速度也变慢。根据我们的实验观察，几丁质植入不同的部位吸收速度不同，植入皮下组织中仅6周就完全降解,这可能是由于不同部位的吞噬细胞数量不同所致。
综合体内与体外实验结果,可以认为几丁质对骨组织也具有良好的相容性,适于作为植骨材料而进行进一步研究,但在材料的表面处理上仍有改进的必要。
参考文献
1John P. Chitin,chitosan and related enzymes. Academic press,1984.135～148
, 百拇医药 2 司徒镇强，吴军正主编. 细胞培养, 西安. 世界图书出版公司, 1996.111～112
3 Kurita K:Efficient graft copolymerizations onto chitin derivatives.In Cardoso R edited:The international research on chitin and chitosan.6th international conference on chitin and chitosan,Poland:ZWAT ltd,1994.67～71
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5 侯春林,卢建熙,曹梅讯,等.几丁质生物学特性的研究. 中国修复与重建外科杂志,1993,2:215
6 Hirano S,Noishiki Y. The blood compatibity of chitosan and N-acylchitosans. J Biomed Mater Res, 1985.19:413
7 上海市第二医科大学生物材料研究室编.非直接接触血液的医用生物材料生物学性能的测试.上海：上海卫生出版社,1985.26～39
(收稿：1998-05-06 修回：1999-01-10), 百拇医药