HCMV即刻早期基因在大肠杆菌中的表达
作者：路永波 王斌 李怡 苏冬梅 邵济钧
单位：青岛医学院分子病毒学研究室(青岛266021)
关键词：巨细胞病毒属;DNA，重组；基因表达
青岛医学院学报990202 【摘要】 ①目的 在大肠杆菌中表达人类巨细胞病毒(HCMV)AD169株即刻早期基因UL37×1，并检测原核表达蛋白的免疫原性。②方法 将原核表达质粒pIE1转入大肠杆菌DH5α菌中，并通过温控的方式诱导目的基因的表达，用SDS-PAGE电泳及Western-Blot实验分析原核表达蛋白的表达情况及其免疫原性。③结果 获得了HCMV即刻早期基因的原核表达产物。④结论 HCMV即刻早期基因UL37×1的原核表达产物具有一定的免疫原性，可与HCMV感染者阳性血清起反应。
中国图书馆分类法分类号 R373.9
, 百拇医药
EXPRESSION OF HCMV IMMEDIATE -EARLY GENE IN E.coli. DH5α
Lu Yongbo， Wang Bin， Li Yi， et al
Labo ratory of Molecular Virology， Qingdao Medical College ，Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To express HCMV strain AD169 immedia te-early gene UL37×1 gene fragment in E.coli. DH5α and determine the antigeni city of the prokaryotic expression products. Methods The prokaryotic expression plasmid pIE1 was transformed into E.coli. DH5α, and the inserted gene was then expressed with temperature -controlled condition and the prokaryotic expression products were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis and Western-Blot analysis. Results The prokaryotic expression products of HCMV immediate-ea rly gene UL37×1 were acquired. Conclusion The prokaryotic expression products of HCMV strain AD1 69 immediate-early gene UL37×1 had antigenicity to some degree and could r esponse with antibody IgG of the positive sera of the HCMV infected person.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 cytomegaloviruses; DNA, recombinant; gene express ion
人类巨细胞病毒(HCMV)是引起胎儿先天性畸形以及智力低下的重要原因，因此有必要对孕妇进行活动性HCMV感染的定期检测，以进行必要的药物治疗或人工流产,以确保胎儿的正常发育。目前,国内外都试图通过DNA的重组技术开发基因工程抗原,用于孕期活动性HCMV感染的诊断，以增加诊断的特异性和敏感性。我们已经通过DNA重组技术，构建成HCMV即刻早期基因UL37×1(UL37基因的第1个外显子)的原核表达质粒pIE1〔1〕，本文将在大肠杆菌DH5α菌中诱导目的基因的表达，并进一步分析原核表达产物的免疫原性。
1 材料和方法
1.1 重组质粒的转化
用CaCl2(0.1mol/L)法〔2〕制备新鲜的大肠杆菌DH5α感受态细菌，然后将原核表达质粒pIE1转入大肠杆菌DH5α宿主菌中。取200μL已转化的感受态细菌转移到LB琼脂培养基上(含氨苄青霉素100mg/L)，于37℃培养12～16h，可见菌落长出。
, 百拇医药
1.2 重组目的基因在大肠杆菌中的诱导表达
从上述培养基上挑取单个菌落，接种于100mLLB培养基(含氨苄青霉素100mg/L)上，用温控的方式诱导目的基因在大肠杆菌DH5α菌中表达。分别于变温后0,1,2,3,4h取菌液3mL，用SDS凝胶加样缓冲液提取细菌蛋白。用SDS-PAGE电泳分析原核表达蛋白的表达情况〔2〕。同时用未转化DH5α菌和未诱导的转化DH5α菌样品作对照。
1.3 蛋白质的凝胶电转
将SDS-PAGE凝胶上蛋白质条带用Bio-Rad石墨电转仪转移到硝酸纤维素滤膜上〔2〕。
1.4 蛋白印迹实验
转移有蛋白质条带的硝酸纤维素滤膜，用HCMV感染者阳性血清(由本室刘希英副教授提供)检测原核表达产物的免疫原性。所用病人血清均经过ELISA检测示IgM和IgA阳性。
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2 结果
2.1 SDS-PAGE电泳结果
用SDS-PAGE蛋白电泳后，考马斯亮蓝R-250染色，可见经诱导的含质粒pIE1的DH5α菌在相对分子质量为3.2万的位置出现一条蛋白条带，而DH5α宿主菌本身以及未诱导的含质粒pIE1的转化菌则无此蛋白条带。
2.2 原核表达蛋白的蛋白印迹实验结果
在蛋白印迹实验中,检测了3份HCMV感染者阳性血清的IgG抗体,实验证实原核表达蛋白可与其中的2份血清起反应，另1份血清呈阴性。发生反应的2份阳性血清与DH5α菌以及未诱导的含重组质粒pIE1的DH5α菌的相应区域没有反应。
3 讨论
本文用CaCl2法将原核表达质粒pIE1转入大肠杆菌DH5α菌中，并通过温控的方式诱导目的基因在DH5α菌中表达，经SDS-PAGE电泳可观察到经诱导的含有质粒pIE1的DH5α菌在相对分子质量为3.2万的位置处出现一条蛋白带，而DH5α菌本身及未诱导的转化菌则无此蛋白带，因而此蛋白带的出现与在42℃下诱导有关。诱导时间的长短对原核表达蛋白的产量影响不大。从SDS-PAGE电泳观察到的原核表达蛋白的相对分子质量，要高于从目的基因碱基序列预测的大小(相对分子质量2.2万)，这可能是由于蛋白质本身的电荷效应所引起的。用计算机PROSIS对所表达蛋白的氨基酸序列进行的亲水性分析也证明了这一点，因为该蛋白除氨基端一小部分为疏水性外，绝大部分为亲水性的。
, 百拇医药
用蛋白印迹实验检测了3份HCMV感染者阳性血清的HCMVIgG抗体，实验证实原核表达蛋白可与其中的2份血清起反应。这2份阳性血清与DH5α菌以及未诱导的含重组质粒pIE1的DH5α菌的相应区域没有反应，这可排除由细菌蛋白引起的非特异性反应。3份HCMV感染者阳性血清中有1份假阴性。其原因可能是病人血清中相应的IgG抗体效价太低，以致在本实验条件下检测不到；通过纯化原核表达蛋白以及降低血清稀释度或者用血清学实验取代蛋白印迹实验，或许可以避免这种假阴性的产生〔3〕。另外，假阴性的产生还可能与HCMV即刻早期抗原刺激机体产生一类短时存在IgG抗体有关，也正因如此，HCMV即刻早期抗原有可能被应用于HCMV活动性感染的早期诊断。
目前，临床上检测HCMV特异性抗体的各种血清学方法，由于所用的病毒抗原通常是从细胞培养适应株制备的全病毒抗原，其效价及特异性均较低，使诊断的敏感性和特异性均受到影响并难以标化。本文的工作为进一步制备或组装HCMV基因工程抗原试剂盒，以提高检测HCMV诊断的特异性和敏感性提供了依据。
, 百拇医药
参考文献
1 路永波，王斌，李怡，等.HCMV即刻早期基因原核表达克隆的构建.青岛医学院学报，1998,34(1):6
2 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社，1992.55
3 Landini MP, Guan MX, Jahn W, et al. Large-scale screening of human s era with cytomegalovirus recombinant antigens. J Clin Micro, 1990, 28(6):1 375
(1998-11-06收稿 1999-03-21修回), 百拇医药
单位：青岛医学院分子病毒学研究室(青岛266021)
关键词：巨细胞病毒属;DNA，重组；基因表达
青岛医学院学报990202 【摘要】 ①目的 在大肠杆菌中表达人类巨细胞病毒(HCMV)AD169株即刻早期基因UL37×1，并检测原核表达蛋白的免疫原性。②方法 将原核表达质粒pIE1转入大肠杆菌DH5α菌中，并通过温控的方式诱导目的基因的表达，用SDS-PAGE电泳及Western-Blot实验分析原核表达蛋白的表达情况及其免疫原性。③结果 获得了HCMV即刻早期基因的原核表达产物。④结论 HCMV即刻早期基因UL37×1的原核表达产物具有一定的免疫原性，可与HCMV感染者阳性血清起反应。
中国图书馆分类法分类号 R373.9
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EXPRESSION OF HCMV IMMEDIATE -EARLY GENE IN E.coli. DH5α
Lu Yongbo， Wang Bin， Li Yi， et al
Labo ratory of Molecular Virology， Qingdao Medical College ，Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To express HCMV strain AD169 immedia te-early gene UL37×1 gene fragment in E.coli. DH5α and determine the antigeni city of the prokaryotic expression products. Methods The prokaryotic expression plasmid pIE1 was transformed into E.coli. DH5α, and the inserted gene was then expressed with temperature -controlled condition and the prokaryotic expression products were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis and Western-Blot analysis. Results The prokaryotic expression products of HCMV immediate-ea rly gene UL37×1 were acquired. Conclusion The prokaryotic expression products of HCMV strain AD1 69 immediate-early gene UL37×1 had antigenicity to some degree and could r esponse with antibody IgG of the positive sera of the HCMV infected person.
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【KEY WORDS】 cytomegaloviruses; DNA, recombinant; gene express ion
人类巨细胞病毒(HCMV)是引起胎儿先天性畸形以及智力低下的重要原因，因此有必要对孕妇进行活动性HCMV感染的定期检测，以进行必要的药物治疗或人工流产,以确保胎儿的正常发育。目前,国内外都试图通过DNA的重组技术开发基因工程抗原,用于孕期活动性HCMV感染的诊断，以增加诊断的特异性和敏感性。我们已经通过DNA重组技术，构建成HCMV即刻早期基因UL37×1(UL37基因的第1个外显子)的原核表达质粒pIE1〔1〕，本文将在大肠杆菌DH5α菌中诱导目的基因的表达，并进一步分析原核表达产物的免疫原性。
1 材料和方法
1.1 重组质粒的转化
用CaCl2(0.1mol/L)法〔2〕制备新鲜的大肠杆菌DH5α感受态细菌，然后将原核表达质粒pIE1转入大肠杆菌DH5α宿主菌中。取200μL已转化的感受态细菌转移到LB琼脂培养基上(含氨苄青霉素100mg/L)，于37℃培养12～16h，可见菌落长出。
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1.2 重组目的基因在大肠杆菌中的诱导表达
从上述培养基上挑取单个菌落，接种于100mLLB培养基(含氨苄青霉素100mg/L)上，用温控的方式诱导目的基因在大肠杆菌DH5α菌中表达。分别于变温后0,1,2,3,4h取菌液3mL，用SDS凝胶加样缓冲液提取细菌蛋白。用SDS-PAGE电泳分析原核表达蛋白的表达情况〔2〕。同时用未转化DH5α菌和未诱导的转化DH5α菌样品作对照。
1.3 蛋白质的凝胶电转
将SDS-PAGE凝胶上蛋白质条带用Bio-Rad石墨电转仪转移到硝酸纤维素滤膜上〔2〕。
1.4 蛋白印迹实验
转移有蛋白质条带的硝酸纤维素滤膜，用HCMV感染者阳性血清(由本室刘希英副教授提供)检测原核表达产物的免疫原性。所用病人血清均经过ELISA检测示IgM和IgA阳性。
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2 结果
2.1 SDS-PAGE电泳结果
用SDS-PAGE蛋白电泳后，考马斯亮蓝R-250染色，可见经诱导的含质粒pIE1的DH5α菌在相对分子质量为3.2万的位置出现一条蛋白条带，而DH5α宿主菌本身以及未诱导的含质粒pIE1的转化菌则无此蛋白条带。
2.2 原核表达蛋白的蛋白印迹实验结果
在蛋白印迹实验中,检测了3份HCMV感染者阳性血清的IgG抗体,实验证实原核表达蛋白可与其中的2份血清起反应，另1份血清呈阴性。发生反应的2份阳性血清与DH5α菌以及未诱导的含重组质粒pIE1的DH5α菌的相应区域没有反应。
3 讨论
本文用CaCl2法将原核表达质粒pIE1转入大肠杆菌DH5α菌中，并通过温控的方式诱导目的基因在DH5α菌中表达，经SDS-PAGE电泳可观察到经诱导的含有质粒pIE1的DH5α菌在相对分子质量为3.2万的位置处出现一条蛋白带，而DH5α菌本身及未诱导的转化菌则无此蛋白带，因而此蛋白带的出现与在42℃下诱导有关。诱导时间的长短对原核表达蛋白的产量影响不大。从SDS-PAGE电泳观察到的原核表达蛋白的相对分子质量，要高于从目的基因碱基序列预测的大小(相对分子质量2.2万)，这可能是由于蛋白质本身的电荷效应所引起的。用计算机PROSIS对所表达蛋白的氨基酸序列进行的亲水性分析也证明了这一点，因为该蛋白除氨基端一小部分为疏水性外，绝大部分为亲水性的。
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用蛋白印迹实验检测了3份HCMV感染者阳性血清的HCMVIgG抗体，实验证实原核表达蛋白可与其中的2份血清起反应。这2份阳性血清与DH5α菌以及未诱导的含重组质粒pIE1的DH5α菌的相应区域没有反应，这可排除由细菌蛋白引起的非特异性反应。3份HCMV感染者阳性血清中有1份假阴性。其原因可能是病人血清中相应的IgG抗体效价太低，以致在本实验条件下检测不到；通过纯化原核表达蛋白以及降低血清稀释度或者用血清学实验取代蛋白印迹实验，或许可以避免这种假阴性的产生〔3〕。另外，假阴性的产生还可能与HCMV即刻早期抗原刺激机体产生一类短时存在IgG抗体有关，也正因如此，HCMV即刻早期抗原有可能被应用于HCMV活动性感染的早期诊断。
目前，临床上检测HCMV特异性抗体的各种血清学方法，由于所用的病毒抗原通常是从细胞培养适应株制备的全病毒抗原，其效价及特异性均较低，使诊断的敏感性和特异性均受到影响并难以标化。本文的工作为进一步制备或组装HCMV基因工程抗原试剂盒，以提高检测HCMV诊断的特异性和敏感性提供了依据。
, 百拇医药
参考文献
1 路永波，王斌，李怡，等.HCMV即刻早期基因原核表达克隆的构建.青岛医学院学报，1998,34(1):6
2 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社，1992.55
3 Landini MP, Guan MX, Jahn W, et al. Large-scale screening of human s era with cytomegalovirus recombinant antigens. J Clin Micro, 1990, 28(6):1 375
(1998-11-06收稿 1999-03-21修回), 百拇医药