抗迟缓爱德华菌单克隆抗体的制备及鉴定
作者：金晓航 黄威权 夏永娟 李元 李别虎 张荣庆
单位：金晓航(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室)；黄威权(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室)；夏永娟(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室)；李元(微生物学教研 室,陕西西安710032)；李别虎(微生物学教研 室,陕西西安710032)张荣庆(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室)
关键词：迟缓爱德华菌；单克隆抗体；特性鉴定
细胞与分子免疫学杂志000228
中图号：R378.2 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0168-01
迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)是爱德华菌属中对人和鱼类均具有致病性的病原体，经口或创伤感染后 肾损害。目前，对该菌所致疾病的诊断主要靠临诊观察和细菌学检查，难以做到准确、及时。鉴于国内外尚未见抗该菌单克隆抗体(mAb)的报道，我们制备了抗该菌的mAb，以为临床诊断和保 护水产资源提供新的检测方法。
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1 材料和方法
1.1 材料 迟缓爱德华菌标准菌株，由青岛海洋大学生命学院提供；大肠杆菌和伤寒杆菌，由本校微生物学教研室惠赠。创伤弧菌和鳗弧菌购自北京生物制品公司；奇异变形杆菌、肺炎杆菌、阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌和异形枸橼酸杆菌，均购自本校西京医院检验科细菌室。Sp2/0骨髓瘤细胞由本校“863”课题组惠赠。Balb/c小鼠，雌性，6～8周龄，体重18～20g，购自本校动物中心。HRP标记的驴抗羊IgG和羊抗鼠IgG，购自华美生物工程公司。系列羊抗鼠IgG亚类血清，购自北京邦定 生物医学公司。
1.2 方法 以10mL/L甲醛溶液灭活的迟缓爱德华菌为免疫原，经ip免疫Balb/c小鼠(1×109菌体/只)。于1，7，14和28d各免疫1次，3d后按常规方法进行融合、筛选、克隆化及制备腹水[2]。mAb的效价测定和IgG亚类鉴定，参照文献[2]的方法。mAb与其它相 关菌的交叉反应性采用间接ELISA法。
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2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立 经细胞融合、筛选和克隆化后，获得10株能稳定分泌mAb的阳性克隆，阳性较强的4株为：3F7，1 B4，4D5和4D3。
2.2 mAb的特性鉴定 杂交瘤细胞培养上清及其诱生的腹水中mAb的ELISA效价分别为1×10-3和1×10-6。4株mAb(3F7，1B4，4D5和4D3)的IgG亚类：前两株分别为IgG2a和IgG2b，后两株均为IgG3。mAb与其它几种相关菌的交叉反应试验，结果见表1。
表1 抗迟缓爱德华菌mAb与其它相关细菌的反应性 菌株
3F7
1B4
4D5
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4D3
创伤弧菌
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鳗弧菌
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大肠杆菌
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伤寒流杆菌
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奇异变形杆菌
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肺炎杆菌
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, 百拇医药
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阴沟肠杆菌
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弗氏枸橼酸杆菌
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异形枸橼酸杆菌
, 百拇医药
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迟缓爱德华菌
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3 讨论
迟缓爱德华菌是肠杆菌科爱德华菌属中唯一对人有致病性的细菌，并证实其为条件致病菌。该菌含有长度为5.3Kb的溶血素基因，其表达产物为一种与铁相关的热不稳定性蛋白质[3]，具有很强的致病性。迟缓爱德华菌感染有暴发性发作的特点，其原发感染或其引起的继发感染，对人或鱼类的致病性均较严重。另外，本菌的抗原结构较为复杂，Tamura等[4]报道，其血清型分类方案中包含61个O抗原组和45个H抗原组，故我们采用10mL/L甲醛灭活的全菌体直接免疫Balb/c小鼠制备mAb。在mAb的特异性鉴定中，我们选择了肠杆菌科6个菌属中具有代表性的7种典型菌株和对海鱼具有致病性的两种常见菌进行交叉反应试验。而爱德华菌属中其它两种细菌及其它相关肠杆菌由于收集困难，未能在文中列出。交叉反应试验表明，mAb3F7和1B4的特异性较好，可供建立检测该菌的免疫学方法和以免疫组织化学方法检测病理标本。此外，该mAb的制备也为进一步制备 针对该菌的抗独特型疫苗创造了条件。
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基金项目：国家863计划海洋生物技术资助,No.819-02-06
作者简介：金晓航，男，24岁，硕士生西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374511
参考文献:
〔1〕 Janda JM, Abbott SL. Infections associated with the genus Edwardsiella: the role of Edwardsiella tarda in human disease〔J〕 . Clin Infect Dis , 1993 ; 17(4):742- 748.
〔2〕徐志凯，主编.实用单可隆抗体技术.西安：陕西科学 技术出版社：1992:27-102.
〔3〕 Chen JD, Lai SY, Huang SL. Molecular cloning, characterization, and sequencing of the hemolysin gene from Edwardsiella tarda〔 J〕 . Arch Microbiol,1996; 165(1):9- 17.
〔4〕 Tamura K, Sakazaki R. Edwardsiella tarda serotyping scheme for international use〔 J〕 . J Clin Microbiol,1988; 26(11):2343- 234.
收稿日期：1999-07-02
修回日期：1999-08-26, 百拇医药
单位：金晓航(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室)；黄威权(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室)；夏永娟(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室)；李元(微生物学教研 室,陕西西安710032)；李别虎(微生物学教研 室,陕西西安710032)张荣庆(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室)
关键词：迟缓爱德华菌；单克隆抗体；特性鉴定
细胞与分子免疫学杂志000228
中图号：R378.2 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0168-01
迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)是爱德华菌属中对人和鱼类均具有致病性的病原体，经口或创伤感染后 肾损害。目前，对该菌所致疾病的诊断主要靠临诊观察和细菌学检查，难以做到准确、及时。鉴于国内外尚未见抗该菌单克隆抗体(mAb)的报道，我们制备了抗该菌的mAb，以为临床诊断和保 护水产资源提供新的检测方法。
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1 材料和方法
1.1 材料 迟缓爱德华菌标准菌株，由青岛海洋大学生命学院提供；大肠杆菌和伤寒杆菌，由本校微生物学教研室惠赠。创伤弧菌和鳗弧菌购自北京生物制品公司；奇异变形杆菌、肺炎杆菌、阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌和异形枸橼酸杆菌，均购自本校西京医院检验科细菌室。Sp2/0骨髓瘤细胞由本校“863”课题组惠赠。Balb/c小鼠，雌性，6～8周龄，体重18～20g，购自本校动物中心。HRP标记的驴抗羊IgG和羊抗鼠IgG，购自华美生物工程公司。系列羊抗鼠IgG亚类血清，购自北京邦定 生物医学公司。
1.2 方法 以10mL/L甲醛溶液灭活的迟缓爱德华菌为免疫原，经ip免疫Balb/c小鼠(1×109菌体/只)。于1，7，14和28d各免疫1次，3d后按常规方法进行融合、筛选、克隆化及制备腹水[2]。mAb的效价测定和IgG亚类鉴定，参照文献[2]的方法。mAb与其它相 关菌的交叉反应性采用间接ELISA法。
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2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立 经细胞融合、筛选和克隆化后，获得10株能稳定分泌mAb的阳性克隆，阳性较强的4株为：3F7，1 B4，4D5和4D3。
2.2 mAb的特性鉴定 杂交瘤细胞培养上清及其诱生的腹水中mAb的ELISA效价分别为1×10-3和1×10-6。4株mAb(3F7，1B4，4D5和4D3)的IgG亚类：前两株分别为IgG2a和IgG2b，后两株均为IgG3。mAb与其它几种相关菌的交叉反应试验，结果见表1。
表1 抗迟缓爱德华菌mAb与其它相关细菌的反应性 菌株
3F7
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大肠杆菌
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肺炎杆菌
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3 讨论
迟缓爱德华菌是肠杆菌科爱德华菌属中唯一对人有致病性的细菌，并证实其为条件致病菌。该菌含有长度为5.3Kb的溶血素基因，其表达产物为一种与铁相关的热不稳定性蛋白质[3]，具有很强的致病性。迟缓爱德华菌感染有暴发性发作的特点，其原发感染或其引起的继发感染，对人或鱼类的致病性均较严重。另外，本菌的抗原结构较为复杂，Tamura等[4]报道，其血清型分类方案中包含61个O抗原组和45个H抗原组，故我们采用10mL/L甲醛灭活的全菌体直接免疫Balb/c小鼠制备mAb。在mAb的特异性鉴定中，我们选择了肠杆菌科6个菌属中具有代表性的7种典型菌株和对海鱼具有致病性的两种常见菌进行交叉反应试验。而爱德华菌属中其它两种细菌及其它相关肠杆菌由于收集困难，未能在文中列出。交叉反应试验表明，mAb3F7和1B4的特异性较好，可供建立检测该菌的免疫学方法和以免疫组织化学方法检测病理标本。此外，该mAb的制备也为进一步制备 针对该菌的抗独特型疫苗创造了条件。
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基金项目：国家863计划海洋生物技术资助,No.819-02-06
作者简介：金晓航，男，24岁，硕士生西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374511
参考文献:
〔1〕 Janda JM, Abbott SL. Infections associated with the genus Edwardsiella: the role of Edwardsiella tarda in human disease〔J〕 . Clin Infect Dis , 1993 ; 17(4):742- 748.
〔2〕徐志凯，主编.实用单可隆抗体技术.西安：陕西科学 技术出版社：1992:27-102.
〔3〕 Chen JD, Lai SY, Huang SL. Molecular cloning, characterization, and sequencing of the hemolysin gene from Edwardsiella tarda〔 J〕 . Arch Microbiol,1996; 165(1):9- 17.
〔4〕 Tamura K, Sakazaki R. Edwardsiella tarda serotyping scheme for international use〔 J〕 . J Clin Microbiol,1988; 26(11):2343- 234.
收稿日期：1999-07-02
修回日期：1999-08-26, 百拇医药