EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因小鼠的制备
作者：郭长占 周为民 潘秀芳 谷淑燕 田枫 刘斌 王兆绰 高晓明
单位：作者单位：郭长占 高晓明，北京医科大学免疫学系；潘秀芳 刘斌，北京医科大学组织胚胎学系；田枫 王兆绰，北京医科大学实验动物科学部，北京100083；周为民 谷淑燕，中国预防医学科学院病毒学研究所，北京100052
关键词：转基因小鼠 EB病毒 自身免疫病
基础医学与临床990507 摘要 TK基因-GCV系统是最有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一。为了提高基因靶向表达的效率，使之可以应用于体内实验，我们构建重组腺病毒AdCMVTK和带有CMV、CEA两个启动子的AdCMVCEATK，在五种癌细胞中进行了体外实验。发现腺病毒介导的TK基因赋予癌细胞GCV敏感性比对照组高2～3个数量级，并使感染病毒和未感染病毒细胞比例为1:10时仍产生较强的“旁观效应”。实验表明PG肺癌，CAE结肠癌，HeLa细胞是腺病毒介导的TK基因的理想靶细胞。
, http://www.100md.com
Characteristics of Adenovirus Vector Mediated TK-gene Expression
Promoted by CMV and CEA Promoters in Tumor Cells
Feng Yuxin Fang Xin Shi Guoli Dong Yuanshu Wang Wenjun Chen Defeng
(Institute of Molecular Biology，Nankai University，Tianjin300071)
Transfer of herpes simplex virus thymidine gene (HSVTK) into tumor cells provides a potential strategy for the treatment of malignancy.Because of the limitation of using retrovirus vectors for clinical application，the feasibility of using a recombinant adenovirus containing HSVTK was examined.A recombinant adenovirus (AdCMVTK) and a recombinant adenovirus that contains both CMV and CEA promoter were constructed to improve th efficiency of targeted gene expression and explore the possibility of applying in vivo.Cell lines derived from five human malignancies (carcinoma) infected with AdCMVTK and AdCMVCEATK showed strong sensitivity to ganciclovir that were 2～3 logs lower than uninfected cells or those infected with a control virus.A strong “bystander effect” was noted in tumor cell lines; these was no diminution in the efficacy of GCV treatment until the ratio of infected and uninfected cells fell below 1:10.This study thus demonstrates in vitro efficacy of an adenovirus-transduced HSVTK drug sensitization gene therapy system in PG (lung cancer)，CAE (colon carcinoma) and HeLa cells.
, 百拇医药
Key words cancer gene therapy HSVTK gene adenovirus vector CMV promoter CEA promoter
单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSVTK)可催化核苷类似物无环鸟苷(GCV)磷酸化，使之可以在DNA复制过程掺入DNA链，阻碍DNA复制，抑制细胞分裂，导致细胞在GCV存在时发生凋亡[1]，与之相邻的不表达TK基因的细胞也产生凋亡，称为“旁观效应”[1]。重组腺病毒载体比逆转录病毒载体更具安全性，能感染不同组织，滴度高，而且能感染分裂缓慢的细胞[2，3]。
基因治疗需避免治疗基因对正常组织的伤害。TK基因靶向表达是提高基因治疗安全性的理想方案，CEA启动子可引导外源基因靶向表达[4]。我们构建AdCMVTK和带有CEA启动子的重组腺病毒AdCMVCEATK，期望CMV启动子[5]增强CEA启动子的作用，探究腺病毒基因治疗和组织特异性表达的应用前景。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
细胞系：PG肺巨细胞瘤细胞系、结肠癌细胞系CAE、HCT购自北京医科大学，Hela细胞为中国医学科学院血液学研究所吴克复教授惠赠，BEL7402肝癌细胞为军事医学科学院放射医学研究所李煜惠赠，293细胞为美国阿拉巴马大学唐代驹博士惠赠。菌种E.coli HB101由美国加里福尼亚大学旧金山分校Harold E. Varmus教授惠赠。质粒pACCMVplpA，pJM17为阿拉巴马大学唐代驹博士惠赠。CEA启动子根据文献[6]由PCR获得。pBluescriptIITK为本实验室保存。实验所用分子生物学试剂及细胞培养试剂为GIBCO/BRL公司产品。
1.2 方法
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化、质粒DNA提取、DNA连接反应参照《分子克隆》(第二版)。细胞用含10%牛血清及青霉素、链霉素的高糖DMEM(BRL)培养基37 ℃，5% CO2培养。pACCMVCEATK，pACCMVTK分别与pJM17以磷酸钙或脂质体法[7，8]共转染293细胞。转染后8～10天出现病毒空斑，筛选病毒克隆在293细胞中扩增培养，提取病毒DNA， 以5'端5'-AATTGGATCCAGCCCCAGAGCCACCTCTC-3'和3'端5'-ATTTCTAGAATGGTCTCTGCTGTCTGCTCT-3'为引物，PCR扩增500bpCEA启动子片段，鉴定AdCMVCEATK；Southern Blot鉴定AdCMVTK。采用293细胞空斑实验测定重组腺病毒滴度[7]，方法是取病毒悬液加入适量培养基稀释为103～1010不同病毒浓度，感染80%汇合度的293细胞1h，吸出病毒液，PBS清洗细胞单层，用含0.5%琼脂的新鲜培养基覆盖细胞单层，部分换液培养数日，出现病毒空斑。空斑数量计数确定病毒滴度，然后以重组腺病毒感染体外细胞系。癌细胞在100mL培养瓶中培养至100%汇合度，消化计数按2万细胞/孔接种于24孔板，培养24h，以0～200MOI(重复感染率multipicity of infection)病毒粒子感染细胞1h，吸出病毒液，PBS清洗细胞单层，换入新鲜培养基培养24h，加入0～200mmol/L GCV，隔日换液培养一周，消化计数，分别绘制生长曲线，测定半数抑制浓度IC50。将感染病毒和未感染病毒的细胞按1～20倍比例接种于24孔板，培养24h，加入20mmol/L GCV，隔日换液培养一周。用台盼蓝染色进行活细胞计数测定旁观效应。
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2 结果
2.1 pACCMVTK和pACCMVCEATK质粒构建
用XbaI、HindⅢ双酶切pBluescriptIITK，回收1.8kbHSVTK基因片段，插入pACCMVplpA质粒的XbaI、HindⅢ多克隆位点，构建pACCMVTK。以PG肺巨细胞瘤基因组DNA为模板，PCR扩增得到约500bpCEA启动子片段[6]，BamHI、XbaI双酶切，插入pACCMVTK质粒的BamHI、XbaI切点，构建了pACCMVCEATK。 pACCMVTK和pACCMVCEATK的物理图谱见图1所示。
图1 pACCMVTK和pACCMVCEATK物理图谱
Fig1 The physical maps of plasmids pACCMVTK and pACCMVCEATK
, 百拇医药
2.2 重组腺病毒的获得
pJM17分别与pACCMVTK，pACCMVCEATK经磷酸钙或脂质体法共转染293细胞，pJM17是一被替换插入4.3kb外源片段的环状腺病毒基因组DNA，它提供除腺病毒E1区以外的主要腺病毒基因，利用同源重组可获得表达TK基因的重组腺病毒。转染8～10天后出现病毒空斑，挑出单一病毒空斑在293细胞中扩增培养，筛选病毒克隆，提取病毒DNA，分别经Southern blot和PCR鉴定得到AdCMVTK和AdCMVCEATK重组腺病毒。PCR扩增AdCMVCEATK重组腺病毒得到0.5kb CEA启动子片段见图2所示。293细胞空斑法测得AdCMVTK，AdCMVCEATK滴度均为1010 pfu/mL (plaque forming unit，空斑形成单位)左右。
图2 AdCMVCEATK的PCR鉴定
, 百拇医药
Fig2 Identification of CEA Promoter in AdCMVCEATK by PCR
2.3 重组腺病毒介导的TK基因在体外癌细胞中表达对癌细胞生长的影响
实验表明，200MOI以下病毒粒子对HeLa、PG、CAE、HCT及BEL-7402细胞的生长无明显影响。用30MOI AdCMVplpA、AdCMVTK和AdCMVCEATK分别感染各癌细胞系，加入0～200μmol/L GCV培养一周，用台盼蓝染色进行活细胞计数，测定五种癌细胞对GCV敏感性。结果见表1。
表1 AdCMVCEA和AdCMVTK感染细胞的GCV半抑制浓度测定结果
Table1 GCV IC50 of cells infected by AdCMVCEA and AdCMVTK respectively
, 百拇医药
Cell lines
IC50(μmol/L)
AdCMVCEATK
AdCMVTK
BEL-7402
3.1
5.0
CAE
0.1
-
HCT
1.0
, 百拇医药
-
HeLa
0.2
0.08
PG
0.08
-
2.4 旁观效应
将感染AdCMVTK、AdCMVCEATK及AdCMVplpA的癌细胞与未感染病毒的癌细胞按不同比例(1:1～1:100)接种于24孔板，加20μmol/L GCV(可用于患者体内治疗的GCV浓度)培养一周。测定的旁观效应结果见图3。
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图3 AdCMVCEATK和AdCMVTK对PG及Hela细胞的“旁观效应”
Fig3 “Bystander effect” of cells infected by AdCMVCEATK and AdCMVTK
3 讨论
本实验观察了人类腺病毒5型载体介导CMV启动子和CMV、CEA双启动子引导的TK基因在体外细胞系中表达，该系统能有效赋予体外癌细胞系GCV敏感性并测出HSVTK基因表达产生的旁观效应，说明腺病毒载体介导的TK基因是很有潜力的治疗系统。
实验表明被感染的癌细胞对GCV的IC50多在0.1～2μmol/L之间，大大低于可用于体内治疗的GCV血清浓度。不同细胞对GCV敏感性有差异，PG细胞与BEL-7402敏感性相差近60倍。这种差异可能是多种因素造成，TK基因表达水平、细胞表面腺病毒受体数量以及细胞自身特点都会影响GCV敏感性。在腺病毒受体较多的乳腺癌、肝癌细胞中，腺病毒介导的TK基因表达水平较高；而细胞在表面腺病毒受体较少的结肠癌、膀胱癌、孵巢癌细胞中，外源基因表达水平较低[9]。本实验中BEL-7402肝癌细胞对GCV的敏感性较差，该细胞对TK gene-GCV系统的抗性可能不是缺乏腺病毒受体所致。有文献报道bcl-2基因表达能抑制TK基因-GCV系统诱导的细胞凋亡[1]，但BEL-7402对GCV的敏感性是否与BCL-2基因表达相关，有待进一步研究。
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AdCMVTK，AdCMVCEATK感染细胞均能产生“旁观效应”。AdCMVCEATK感染的PG“旁观效应”最强，仅5%细胞感染病毒即可使细胞存活率低于30%。在HeLa细胞中AdCMVTK的“旁观效应”高于AdCMVCEATK。两种病毒在CAE中均无明显“旁观效应”，这可能与细胞形态有关。“旁观效应”需要细胞间相互接触，CAE细胞为圆形，呈集落生长，细胞间隙较大，妨碍细胞毒性物质在细胞间传递[1]。
本实验结果发现AdCMVCEATK赋予CEA阳性的PG细胞及CAE细胞较高的GCV敏感性和“旁观效应”，AdCMVK赋予CEA阴性的HeLa细胞表现出比AdCMVCEATK更高的GCV敏感性。但仍不能确定这种差异是否为CEA启动子造成。CEA启动的基因在CEA阴性的HeLa细胞中不表达[4]，但实验表明AdCMVTK和AdCMVCEATK使Hela细胞、PG细胞对GCV的敏感性产生差别，说明CMV可能不是全或无式地通读CEA启动子，CMV对CEA的影响有待深入探讨。
, 百拇医药
HeLa细胞和BEL-7402细胞对病毒的抗性高于其他细胞。腺病毒衣壳五邻体蛋白造成的细胞毒副作用在动物体内也会产生严重后果，有报道1.5×109 pfu病毒粒子与GCV共同作用可引起狒狒死亡[10]，因此必须严格控制实验中病毒浓度。
致谢 陈雅文、曹传海参加部分实验，特此致谢。
△国家自然科学资金资助项目(No.39670410)
参考文献
1 Hamel W，et al.Herpes Simplex Virus thymidine kinase/ganciclovir-mediated apoptotic death of bystander cells.Cancer Res，1996，56:2607
, 百拇医药 2 Smythe WR，et al.Use of recombinant adenovirus of transfer the herpes simplex virus thymidine kinese (HSV tk) gene to thoracic neoplasms: an effective in vitro drug ssensitization system.Cancer Res，1994，54:2055
3 Ross C，et al.Gene therapy in the United States: a five year status report.Human Gene Therapy，1996，7:1781
4 Tanaka T，et al.Adenovirus-mediated predrug gene therapy for carcinoembryonic antigen producing human
, 百拇医药
gastric carcinoma cells in vitro.Cancer Res，1996，56:1341
5 Boshart M，et al.A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovrius.Cells，1985，41:521
6 Dimaio J M，et al.Directed enzyme pro-drug gene therapy for pancreatic cancer in vivo.Surgery，1994，116(2):205
7 Becker TC，et al.Use of recombinant adenovirus for metabolic engineering of mammalian cells.Methods in cell biology.1994，Vol.43:161
, http://www.100md.com
8 Zhang WW，et al.Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated trans-fection and PCR analysis.Bio Techniques，1993，Vol.15 No.5:868
9 Harris MP，et al.Adenovirus-mediated p53 gene transfer inhibits growth of human tumor cells expressing mutant p53 protein.Cancer Gene Therapy，1995，Vol.3 No.2:121
10 Goodman JC，et al.Adenoviral-mediated thymidine kinase gene transfer into the primate brain followed by systemic ganciclovir pathologic，radiologic and molecular studies.Human Gene therapy，1996，7:1241, 百拇医药
单位：作者单位：郭长占 高晓明，北京医科大学免疫学系；潘秀芳 刘斌，北京医科大学组织胚胎学系；田枫 王兆绰，北京医科大学实验动物科学部，北京100083；周为民 谷淑燕，中国预防医学科学院病毒学研究所，北京100052
关键词：转基因小鼠 EB病毒 自身免疫病
基础医学与临床990507 摘要 TK基因-GCV系统是最有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一。为了提高基因靶向表达的效率，使之可以应用于体内实验，我们构建重组腺病毒AdCMVTK和带有CMV、CEA两个启动子的AdCMVCEATK，在五种癌细胞中进行了体外实验。发现腺病毒介导的TK基因赋予癌细胞GCV敏感性比对照组高2～3个数量级，并使感染病毒和未感染病毒细胞比例为1:10时仍产生较强的“旁观效应”。实验表明PG肺癌，CAE结肠癌，HeLa细胞是腺病毒介导的TK基因的理想靶细胞。
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Characteristics of Adenovirus Vector Mediated TK-gene Expression
Promoted by CMV and CEA Promoters in Tumor Cells
Feng Yuxin Fang Xin Shi Guoli Dong Yuanshu Wang Wenjun Chen Defeng
(Institute of Molecular Biology，Nankai University，Tianjin300071)
Transfer of herpes simplex virus thymidine gene (HSVTK) into tumor cells provides a potential strategy for the treatment of malignancy.Because of the limitation of using retrovirus vectors for clinical application，the feasibility of using a recombinant adenovirus containing HSVTK was examined.A recombinant adenovirus (AdCMVTK) and a recombinant adenovirus that contains both CMV and CEA promoter were constructed to improve th efficiency of targeted gene expression and explore the possibility of applying in vivo.Cell lines derived from five human malignancies (carcinoma) infected with AdCMVTK and AdCMVCEATK showed strong sensitivity to ganciclovir that were 2～3 logs lower than uninfected cells or those infected with a control virus.A strong “bystander effect” was noted in tumor cell lines; these was no diminution in the efficacy of GCV treatment until the ratio of infected and uninfected cells fell below 1:10.This study thus demonstrates in vitro efficacy of an adenovirus-transduced HSVTK drug sensitization gene therapy system in PG (lung cancer)，CAE (colon carcinoma) and HeLa cells.
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Key words cancer gene therapy HSVTK gene adenovirus vector CMV promoter CEA promoter
单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSVTK)可催化核苷类似物无环鸟苷(GCV)磷酸化，使之可以在DNA复制过程掺入DNA链，阻碍DNA复制，抑制细胞分裂，导致细胞在GCV存在时发生凋亡[1]，与之相邻的不表达TK基因的细胞也产生凋亡，称为“旁观效应”[1]。重组腺病毒载体比逆转录病毒载体更具安全性，能感染不同组织，滴度高，而且能感染分裂缓慢的细胞[2，3]。
基因治疗需避免治疗基因对正常组织的伤害。TK基因靶向表达是提高基因治疗安全性的理想方案，CEA启动子可引导外源基因靶向表达[4]。我们构建AdCMVTK和带有CEA启动子的重组腺病毒AdCMVCEATK，期望CMV启动子[5]增强CEA启动子的作用，探究腺病毒基因治疗和组织特异性表达的应用前景。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
细胞系：PG肺巨细胞瘤细胞系、结肠癌细胞系CAE、HCT购自北京医科大学，Hela细胞为中国医学科学院血液学研究所吴克复教授惠赠，BEL7402肝癌细胞为军事医学科学院放射医学研究所李煜惠赠，293细胞为美国阿拉巴马大学唐代驹博士惠赠。菌种E.coli HB101由美国加里福尼亚大学旧金山分校Harold E. Varmus教授惠赠。质粒pACCMVplpA，pJM17为阿拉巴马大学唐代驹博士惠赠。CEA启动子根据文献[6]由PCR获得。pBluescriptIITK为本实验室保存。实验所用分子生物学试剂及细胞培养试剂为GIBCO/BRL公司产品。
1.2 方法
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化、质粒DNA提取、DNA连接反应参照《分子克隆》(第二版)。细胞用含10%牛血清及青霉素、链霉素的高糖DMEM(BRL)培养基37 ℃，5% CO2培养。pACCMVCEATK，pACCMVTK分别与pJM17以磷酸钙或脂质体法[7，8]共转染293细胞。转染后8～10天出现病毒空斑，筛选病毒克隆在293细胞中扩增培养，提取病毒DNA， 以5'端5'-AATTGGATCCAGCCCCAGAGCCACCTCTC-3'和3'端5'-ATTTCTAGAATGGTCTCTGCTGTCTGCTCT-3'为引物，PCR扩增500bpCEA启动子片段，鉴定AdCMVCEATK；Southern Blot鉴定AdCMVTK。采用293细胞空斑实验测定重组腺病毒滴度[7]，方法是取病毒悬液加入适量培养基稀释为103～1010不同病毒浓度，感染80%汇合度的293细胞1h，吸出病毒液，PBS清洗细胞单层，用含0.5%琼脂的新鲜培养基覆盖细胞单层，部分换液培养数日，出现病毒空斑。空斑数量计数确定病毒滴度，然后以重组腺病毒感染体外细胞系。癌细胞在100mL培养瓶中培养至100%汇合度，消化计数按2万细胞/孔接种于24孔板，培养24h，以0～200MOI(重复感染率multipicity of infection)病毒粒子感染细胞1h，吸出病毒液，PBS清洗细胞单层，换入新鲜培养基培养24h，加入0～200mmol/L GCV，隔日换液培养一周，消化计数，分别绘制生长曲线，测定半数抑制浓度IC50。将感染病毒和未感染病毒的细胞按1～20倍比例接种于24孔板，培养24h，加入20mmol/L GCV，隔日换液培养一周。用台盼蓝染色进行活细胞计数测定旁观效应。
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2 结果
2.1 pACCMVTK和pACCMVCEATK质粒构建
用XbaI、HindⅢ双酶切pBluescriptIITK，回收1.8kbHSVTK基因片段，插入pACCMVplpA质粒的XbaI、HindⅢ多克隆位点，构建pACCMVTK。以PG肺巨细胞瘤基因组DNA为模板，PCR扩增得到约500bpCEA启动子片段[6]，BamHI、XbaI双酶切，插入pACCMVTK质粒的BamHI、XbaI切点，构建了pACCMVCEATK。 pACCMVTK和pACCMVCEATK的物理图谱见图1所示。
图1 pACCMVTK和pACCMVCEATK物理图谱
Fig1 The physical maps of plasmids pACCMVTK and pACCMVCEATK
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2.2 重组腺病毒的获得
pJM17分别与pACCMVTK，pACCMVCEATK经磷酸钙或脂质体法共转染293细胞，pJM17是一被替换插入4.3kb外源片段的环状腺病毒基因组DNA，它提供除腺病毒E1区以外的主要腺病毒基因，利用同源重组可获得表达TK基因的重组腺病毒。转染8～10天后出现病毒空斑，挑出单一病毒空斑在293细胞中扩增培养，筛选病毒克隆，提取病毒DNA，分别经Southern blot和PCR鉴定得到AdCMVTK和AdCMVCEATK重组腺病毒。PCR扩增AdCMVCEATK重组腺病毒得到0.5kb CEA启动子片段见图2所示。293细胞空斑法测得AdCMVTK，AdCMVCEATK滴度均为1010 pfu/mL (plaque forming unit，空斑形成单位)左右。
图2 AdCMVCEATK的PCR鉴定
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Fig2 Identification of CEA Promoter in AdCMVCEATK by PCR
2.3 重组腺病毒介导的TK基因在体外癌细胞中表达对癌细胞生长的影响
实验表明，200MOI以下病毒粒子对HeLa、PG、CAE、HCT及BEL-7402细胞的生长无明显影响。用30MOI AdCMVplpA、AdCMVTK和AdCMVCEATK分别感染各癌细胞系，加入0～200μmol/L GCV培养一周，用台盼蓝染色进行活细胞计数，测定五种癌细胞对GCV敏感性。结果见表1。
表1 AdCMVCEA和AdCMVTK感染细胞的GCV半抑制浓度测定结果
Table1 GCV IC50 of cells infected by AdCMVCEA and AdCMVTK respectively
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Cell lines
IC50(μmol/L)
AdCMVCEATK
AdCMVTK
BEL-7402
3.1
5.0
CAE
0.1
-
HCT
1.0
, 百拇医药
-
HeLa
0.2
0.08
PG
0.08
-
2.4 旁观效应
将感染AdCMVTK、AdCMVCEATK及AdCMVplpA的癌细胞与未感染病毒的癌细胞按不同比例(1:1～1:100)接种于24孔板，加20μmol/L GCV(可用于患者体内治疗的GCV浓度)培养一周。测定的旁观效应结果见图3。
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图3 AdCMVCEATK和AdCMVTK对PG及Hela细胞的“旁观效应”
Fig3 “Bystander effect” of cells infected by AdCMVCEATK and AdCMVTK
3 讨论
本实验观察了人类腺病毒5型载体介导CMV启动子和CMV、CEA双启动子引导的TK基因在体外细胞系中表达，该系统能有效赋予体外癌细胞系GCV敏感性并测出HSVTK基因表达产生的旁观效应，说明腺病毒载体介导的TK基因是很有潜力的治疗系统。
实验表明被感染的癌细胞对GCV的IC50多在0.1～2μmol/L之间，大大低于可用于体内治疗的GCV血清浓度。不同细胞对GCV敏感性有差异，PG细胞与BEL-7402敏感性相差近60倍。这种差异可能是多种因素造成，TK基因表达水平、细胞表面腺病毒受体数量以及细胞自身特点都会影响GCV敏感性。在腺病毒受体较多的乳腺癌、肝癌细胞中，腺病毒介导的TK基因表达水平较高；而细胞在表面腺病毒受体较少的结肠癌、膀胱癌、孵巢癌细胞中，外源基因表达水平较低[9]。本实验中BEL-7402肝癌细胞对GCV的敏感性较差，该细胞对TK gene-GCV系统的抗性可能不是缺乏腺病毒受体所致。有文献报道bcl-2基因表达能抑制TK基因-GCV系统诱导的细胞凋亡[1]，但BEL-7402对GCV的敏感性是否与BCL-2基因表达相关，有待进一步研究。
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AdCMVTK，AdCMVCEATK感染细胞均能产生“旁观效应”。AdCMVCEATK感染的PG“旁观效应”最强，仅5%细胞感染病毒即可使细胞存活率低于30%。在HeLa细胞中AdCMVTK的“旁观效应”高于AdCMVCEATK。两种病毒在CAE中均无明显“旁观效应”，这可能与细胞形态有关。“旁观效应”需要细胞间相互接触，CAE细胞为圆形，呈集落生长，细胞间隙较大，妨碍细胞毒性物质在细胞间传递[1]。
本实验结果发现AdCMVCEATK赋予CEA阳性的PG细胞及CAE细胞较高的GCV敏感性和“旁观效应”，AdCMVK赋予CEA阴性的HeLa细胞表现出比AdCMVCEATK更高的GCV敏感性。但仍不能确定这种差异是否为CEA启动子造成。CEA启动的基因在CEA阴性的HeLa细胞中不表达[4]，但实验表明AdCMVTK和AdCMVCEATK使Hela细胞、PG细胞对GCV的敏感性产生差别，说明CMV可能不是全或无式地通读CEA启动子，CMV对CEA的影响有待深入探讨。
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HeLa细胞和BEL-7402细胞对病毒的抗性高于其他细胞。腺病毒衣壳五邻体蛋白造成的细胞毒副作用在动物体内也会产生严重后果，有报道1.5×109 pfu病毒粒子与GCV共同作用可引起狒狒死亡[10]，因此必须严格控制实验中病毒浓度。
致谢 陈雅文、曹传海参加部分实验，特此致谢。
△国家自然科学资金资助项目(No.39670410)
参考文献
1 Hamel W，et al.Herpes Simplex Virus thymidine kinase/ganciclovir-mediated apoptotic death of bystander cells.Cancer Res，1996，56:2607
, 百拇医药 2 Smythe WR，et al.Use of recombinant adenovirus of transfer the herpes simplex virus thymidine kinese (HSV tk) gene to thoracic neoplasms: an effective in vitro drug ssensitization system.Cancer Res，1994，54:2055
3 Ross C，et al.Gene therapy in the United States: a five year status report.Human Gene Therapy，1996，7:1781
4 Tanaka T，et al.Adenovirus-mediated predrug gene therapy for carcinoembryonic antigen producing human
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gastric carcinoma cells in vitro.Cancer Res，1996，56:1341
5 Boshart M，et al.A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovrius.Cells，1985，41:521
6 Dimaio J M，et al.Directed enzyme pro-drug gene therapy for pancreatic cancer in vivo.Surgery，1994，116(2):205
7 Becker TC，et al.Use of recombinant adenovirus for metabolic engineering of mammalian cells.Methods in cell biology.1994，Vol.43:161
, http://www.100md.com
8 Zhang WW，et al.Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated trans-fection and PCR analysis.Bio Techniques，1993，Vol.15 No.5:868
9 Harris MP，et al.Adenovirus-mediated p53 gene transfer inhibits growth of human tumor cells expressing mutant p53 protein.Cancer Gene Therapy，1995，Vol.3 No.2:121
10 Goodman JC，et al.Adenoviral-mediated thymidine kinase gene transfer into the primate brain followed by systemic ganciclovir pathologic，radiologic and molecular studies.Human Gene therapy，1996，7:1241, 百拇医药