逆转录聚合酶链反应检测HCV RNA血标本保存条件分析
作者：陆应玉 李京培 王明丽 史百芬 陈禹保
单位：陆应玉(安徽医科大学附属医院检验科，合肥 230022)；李京培 王明丽 史百芬(安徽医科大学微生物学教研室，合肥 230032)；陈禹保(北京美迪科生物技术公司，北京 100012)
关键词：血液保存；C型肝炎样病毒属；RNA；聚合酸链反应
安徽医科大学学报000314 摘要 目的 确定用于丙型肝炎病毒(HCV) RNA逆转录聚合酶链反应测定的血清(浆)标本的最佳收集和保存条件。方法 按设定的不同条件处理，用逆转录聚合酶链反应测定HCV RNA。结果 用高压消毒的离心管与未用高压消毒的离心管收集、保存 HCV RNA血清，其阳性检出率有差异(P<0.05)。血凝固后4 h内离心分离血清对HCV RNA阳性检出率不造成明显改变(阳性率为85%)；12 h后检测则变化明显(阳性率降至75%)。采用枸橼酸钠和EDTA-K2抗凝剂的血浆管 HCV RNA检出率分别为90%和95%，显著高于血清管(为65%)。反复冻融影响标本阳性检出率，标本在-20℃保存3个月或半年几乎不影响检测结果。结论 收集和保存HCV RNA检测标本应尽量用EDTA抗凝管，在4 h内分离血浆；若用血清标本，最好在4 h之内分离血清，标本长期保存应分装且存放在-70℃。
, http://www.100md.com
中图分类号 R954
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)03-0202-03
Analysis of reserved conditions of blood sample
for detection of HCV RNA with RT-PCR
Lu Yingyu， Li Jingpei， Wang Mingli et al
(Dept of Clinical Laboratories, The First Affiliated Hospital
of Anhui Medical University, Hefei 230032)
, http://www.100md.com
Abstract Objective To investigate the optimal collection and storage parameters of plasma (serum) for HCV RNA detection. Methods The serum (plasma) obtained from HCV RNA positive by different means and different processing and storage conditions, then HCV RNA was detected with RT-PCR. Results When HCV RNA serum is collected and reserved with disinfectant tube and infectant tube. The centrifugation was performed within 4 hours after formation of the clot, the positive rate of HCV RNA was 85%; the significart change of HCV RNA positive rate 75% was observed after 12 h. The positive rate of HCV RNA in plasma with anticoagulants were much higher than that in serum samples (citrate sodium anticoagulized 90%, EDTA-anticoagulated 95%). A significant decrease in HCV RNA positive rate was observed with up to three freeze thaw cycles. There was no change of HCV RNA at -20℃ after three months or six months. Conclusion It is important to process and store clinical samples for HCV RNA detection. The EDTA-K2 as anticoagulants the plasma must be collected within 24 h; and the serum must be prepared within 4 h after hemosposia. It is essential to store the sample under -70℃ for the stability of HCV RNA for a longer time.
, http://www.100md.com
MeSH blood preservation; hepatitis C-like viruses；RNA； polymerase chain reaction
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV-RNA)已在许多实验室开展，但由于该技术受影响因素多，实际上仍难在所有医院使用。该法血标本中RNA易受外界环境中核酸酶的作用而降解，它直接影响到检测结果的准确性，血标本的采集和保存相当重要。本研究就血影响标本采集和保存的一些因素进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 患者血清(浆)标本 来自HCV-IgG和HCV RNA阳性的丙型肝炎患者。
1.2 试剂 HCV RT-PCR试剂盒由北京美迪科生物技术公司提供。
1.3 仪器 北京科海PCR 401型DNA扩增仪。
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1.4 标本的采集及处理 将HCV RNA阳性的20例患者每人取血5 ml，再分0.5 ml血加入取样管，分离血清或血浆，按每份30 μl分装，实验按以下方式分组：①离心管未经高压灭菌组和离心管已高压灭菌组；②血凝固后立即离心分离血清组与4℃放置24 h后分离血清组；③血凝固血按放置时间的不同(0、1、2、4、12、24 h)分组；④使用不同抗凝剂分离血浆组；⑤不同温度(室温、4℃、-20℃和-70℃)贮存和反复冻融(-20℃组)等条件处理后，-70℃冻存的各组。然后检测各组HCV RNA阳性率。
1.5 检测方法 取血清(血浆)标本30 μl，按试剂盒提供的方法进行提取RNA模板，逆转录，扩增和产物鉴定。
根据Kwok等[1]和李勃等[2]报道的方法，分配实验单元和进行实验操作。防止污染发生，同时消除非特异性扩增。
2 结果
, 百拇医药
2.1 血清(血浆)标本的收集和处理对HCV RNA稳定性的影响
2.1.1 RT-PCR检测HCV RNA的灵敏度和重复性 实验过程中设立各种阴、阳性对照。空白对照结果为阴性，阳性对照结果为阳性。PCR产物大小与试剂盒设计的片段完全吻合为174 bP，且与marker标准条带一致。证明本实验具有高度特异性。取血5份，凝固后立即离心，取血清置-70℃保存，将该血清10倍倍比稀释后检测，结果有4份标本稀释至103倍时检测结果仍为阳性，另1份标本稀释至104倍时检测结果仍为阳性，完全重复的占80%。
2.1.2 血液置入经高压灭菌的离心管与未经高压灭菌的离心管对HCV RNA的影响 用高压灭菌与非高压灭菌普通玻璃试管取血标本各20份，在离心后将血清转入高压灭菌的离心管中，前者阳性率100%(20/20)，后者则阳性率75%(15/20)，其HCV RNA阳性检出率仍有明显改变(P<0.05)。
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2.1.3 血液凝固后于4℃放置不同时间其HCV RNA的改变 在血液凝固后立即离心取血清于1 h、2 h或4 h后离心取血清检测HCV RNA，阳性率结果几乎无差异。放置12 h后离心，血清HCV RNA阳性检出率只有75%，与立即离心检测结果有明显差异(P<0.05)。而放置24 h后离心分离血清检测，HCV RNA阳性率为70%，差异有显著性(P<0.01)，放置48h后则检测HCV RNA，则阳性率只有45%(P<0.01)。见表1。
表1 血标本凝固后不同时间离心
分离血清对HCV-RNA阳性率的影响 血凝固后离心
分离血清时间(h)
n
RT-PCR
阳性数
, http://www.100md.com
阳性率(%)
(1) 0
20
20
100
(2) 1
20
19
95
(3) 2
20
19
95
, 百拇医药
(4) 4
20
17
85
(5) 12
20
15
75
(6) 24
20
12
60
(7) 48
, 百拇医药
20
9
45
( )内为组别；与(1)比较：P<0.05
2.1.4 血液凝固后立即离心与不离心对HCV RNA的影响 血液凝固后无论离心与否，在4℃放置24 h后HCV RNA阳性率均有很明显的降低，离心后放置的阳性率65%，未离心的阳性率60%，二者差异无显著性(P>0.05)。
2.1.5 血浆标本的处理对HCV RNA稳定性的影响 血凝固后立即离心，并用灭菌离心管存放血清，以在4℃放置24 h管作为对照，比较109 mmol*L-1枸橼酸钠抗凝管和150 g*L-1 EDTA-K2抗凝管血浆HCV RNA的阳性检出率。结果见表2。
, 百拇医药
表2 不同抗凝剂分离血浆与血清的HCV RNA阳性率比较 组 别
n
RT-PCR HCV-RNA
阳性数
阳性率(%)
枸橼酸钠抗凝4℃ 24 h血浆
20
18
90
EDTA-K2抗凝4℃ 24 h血浆
20
, http://www.100md.com 19
95
血清△
20
13
65
△血清为凝固后立即离心分离后放4℃ 24 h
与血清组比较：P<0.052.2 血清(血浆)样本的贮存温度及反复冻融对HCV RNA稳定性的影响
2.2.1 血标本的不同贮存温度对HCV RNA阳性检出率的影响 血液凝固后立即离心，并用灭菌离心管取出，在-70℃冻存，以此标本作为对照，比较室温、4℃或-20℃经1周、2周、1个月、3个月或6个月贮存对标本在HCV RNA阳性检出率的影响。其结果室温下贮存1周HCV RNA几乎完全降解，阳性检出率为5%(1/20)。4℃贮存2周平均阳性检出率35%(7/20)，4℃贮存1个月阳性检出率5%(1/20)。-20℃贮存3个月阳性检出率100% (20/20)，-20℃贮存6个月阳性检出率为95%(19/20)。结果表明血清(浆)标本-20℃贮存半年其HCV RNA稳定，检出率几乎没有变化。
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2.2.2 反复冻融对标本HCV RNA稳定性的影响 将15份阳性血清贮存于-20℃，每日冻融1次并取样检测HCV RNA，其中7份标本冻融7次后检测HCV RNA结果仍为阳性，但其它标本在冻融1次(2份)、3次(4份)和5次(2份)时，检测结果即转为阴性。这表明实验过程中，反复冻融会影响标本HCV RNA检测结果。标本抗冻融能力可能与HCV RNA含量有关，应尽早检测所采集标本，若不能即时检测，要分装保存，避免反复冻融。
3 讨论
HCV系单股正链RNA病毒，由于其基因易变，在不同国家和地区已发现不少于5种HCV基因型〔3，4〕，因此该试剂盒引物选用HCV 5′末端变异较少的非编码区，检出率较高。PCR扩增HCV RNA，以PCR技术本身而言，影响因素很多(如引物选择、PCR反应液中成分比例)，循环温度与时间等都可以相对固定，而HCV RNA易受内源性核酸酶分解，因此HCV RNA血清或血浆标本采集和保存是检测HCV RNA成功的关键因素之一。本研究结果提示采用血清标本进行HCV RNA RT-PCR测定应在4 h内离心，分离血清。另外，外源性RNase的作用同样不能忽视，采用普通小试管(无盖)和经过高压处理小试管，二者阳性检出率有差异(P<0.05)。这是由于标本从采集到血液凝固过程中均暴露在空气中，而试管又未经高压灭菌，使外源性RNase对血标本中的HCV RNA产生降解作用。
, 百拇医药
我们采用临床检验科常用的枸橼酸钠和EDTA-K2两种抗凝剂，结果表明血浆中HCV RNA阳性检出率(90%、95%)明显高于24 h后血清阳性检出率(65%)。但如果不及时离心分离血浆RNA亦会影响阳性检出率，尤其是枸橼酸钠抗凝的血浆标本。有资料〔5，6〕报道肝素对PCR测定有影响，原因除了细胞中的血红素分子对Taq酶有抑制作用外，粒细胞和单核细胞释放的蛋白酶和核酸酶对病毒颗粒的降解作用也很主要。而EDTA-K2是钙离子鳌合剂是否对PCR有影响尚不清楚。
4℃室温、反复冻融对HCV RNA测定的结果与对照血清亦有差异。4℃贮存两周 HCV RNA阳性检出率下降一大半(35%)，这一点在实际操作中非常重要，即标本不能在24 h内检测，亦应在4 h内分离血清或血浆，冷冻保存。-20℃的贮存标本条件对于临床常规性检验标本是适合的，放置3个月，HCV RNA的阳性检出率几乎没有变化。在临床科研中，用于临床回顾性检测 HCV RNA标本或用于以后研究的标本应在严格一致条件下收集和贮存，以保证这些材料所提供的数据的可靠性和准确性。总之， HCV RNA检测标本应遵循如下原则：首先，用灭菌的EDTA或枸橼酸钠抗凝管收集血标本，4 h以内离心血浆；其次，如果不用抗凝剂，在血液凝固后应立即离心，分离血清；最后，长期贮存标本应贮存在-70℃(若无-70℃条件，标本亦可放置-20℃冻存)，避免反复冻融。
, 百拇医药
作者简介：陆应玉，男，38岁，主管检验师
参考文献
1，Kwok S, Hignchi R. Avoiding false positives with PCR. Nature, 1989；339(628)：237～242
2，李勃，潘毓宣，张春燕等. PCR结合索氏转移杂交在结核病诊断中的应用。中华结核和呼吸杂志，1994，17(4)： 238～241
3，Houghton M, Weiner A, Han J et al. Molecular biology of the hepatitis C Viruses: implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology, 1991； 14(2):381～385
, http://www.100md.com
4，杜绍财,陶其敏,朱凌等. 丙型肝炎病毒基因5′-末端非编码区酶切分型研究. 中华医学杂志，1993；73(1)：1～3
5，Holodniy M, Kim S, katzenstein DA et al. Inhibition of human immunodeficiency virus gene amplification by heparin. J Clin Microbiol,1991;29(3)：676～679
6，Wang JT, Wang TH, Sheu JC et al. Effects of anticoagulants and storage of blood sample on efficacy of the palymerase chain reaction assay for hepatitis C virus. J Clin Microbiol, 1992;30(2):750～753
2000-01-08收稿，2000-05-20修回, 百拇医药
单位：陆应玉(安徽医科大学附属医院检验科，合肥 230022)；李京培 王明丽 史百芬(安徽医科大学微生物学教研室，合肥 230032)；陈禹保(北京美迪科生物技术公司，北京 100012)
关键词：血液保存；C型肝炎样病毒属；RNA；聚合酸链反应
安徽医科大学学报000314 摘要 目的 确定用于丙型肝炎病毒(HCV) RNA逆转录聚合酶链反应测定的血清(浆)标本的最佳收集和保存条件。方法 按设定的不同条件处理，用逆转录聚合酶链反应测定HCV RNA。结果 用高压消毒的离心管与未用高压消毒的离心管收集、保存 HCV RNA血清，其阳性检出率有差异(P<0.05)。血凝固后4 h内离心分离血清对HCV RNA阳性检出率不造成明显改变(阳性率为85%)；12 h后检测则变化明显(阳性率降至75%)。采用枸橼酸钠和EDTA-K2抗凝剂的血浆管 HCV RNA检出率分别为90%和95%，显著高于血清管(为65%)。反复冻融影响标本阳性检出率，标本在-20℃保存3个月或半年几乎不影响检测结果。结论 收集和保存HCV RNA检测标本应尽量用EDTA抗凝管，在4 h内分离血浆；若用血清标本，最好在4 h之内分离血清，标本长期保存应分装且存放在-70℃。
, http://www.100md.com
中图分类号 R954
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)03-0202-03
Analysis of reserved conditions of blood sample
for detection of HCV RNA with RT-PCR
Lu Yingyu， Li Jingpei， Wang Mingli et al
(Dept of Clinical Laboratories, The First Affiliated Hospital
of Anhui Medical University, Hefei 230032)
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Abstract Objective To investigate the optimal collection and storage parameters of plasma (serum) for HCV RNA detection. Methods The serum (plasma) obtained from HCV RNA positive by different means and different processing and storage conditions, then HCV RNA was detected with RT-PCR. Results When HCV RNA serum is collected and reserved with disinfectant tube and infectant tube. The centrifugation was performed within 4 hours after formation of the clot, the positive rate of HCV RNA was 85%; the significart change of HCV RNA positive rate 75% was observed after 12 h. The positive rate of HCV RNA in plasma with anticoagulants were much higher than that in serum samples (citrate sodium anticoagulized 90%, EDTA-anticoagulated 95%). A significant decrease in HCV RNA positive rate was observed with up to three freeze thaw cycles. There was no change of HCV RNA at -20℃ after three months or six months. Conclusion It is important to process and store clinical samples for HCV RNA detection. The EDTA-K2 as anticoagulants the plasma must be collected within 24 h; and the serum must be prepared within 4 h after hemosposia. It is essential to store the sample under -70℃ for the stability of HCV RNA for a longer time.
, http://www.100md.com
MeSH blood preservation; hepatitis C-like viruses；RNA； polymerase chain reaction
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV-RNA)已在许多实验室开展，但由于该技术受影响因素多，实际上仍难在所有医院使用。该法血标本中RNA易受外界环境中核酸酶的作用而降解，它直接影响到检测结果的准确性，血标本的采集和保存相当重要。本研究就血影响标本采集和保存的一些因素进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 患者血清(浆)标本 来自HCV-IgG和HCV RNA阳性的丙型肝炎患者。
1.2 试剂 HCV RT-PCR试剂盒由北京美迪科生物技术公司提供。
1.3 仪器 北京科海PCR 401型DNA扩增仪。
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1.4 标本的采集及处理 将HCV RNA阳性的20例患者每人取血5 ml，再分0.5 ml血加入取样管，分离血清或血浆，按每份30 μl分装，实验按以下方式分组：①离心管未经高压灭菌组和离心管已高压灭菌组；②血凝固后立即离心分离血清组与4℃放置24 h后分离血清组；③血凝固血按放置时间的不同(0、1、2、4、12、24 h)分组；④使用不同抗凝剂分离血浆组；⑤不同温度(室温、4℃、-20℃和-70℃)贮存和反复冻融(-20℃组)等条件处理后，-70℃冻存的各组。然后检测各组HCV RNA阳性率。
1.5 检测方法 取血清(血浆)标本30 μl，按试剂盒提供的方法进行提取RNA模板，逆转录，扩增和产物鉴定。
根据Kwok等[1]和李勃等[2]报道的方法，分配实验单元和进行实验操作。防止污染发生，同时消除非特异性扩增。
2 结果
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2.1 血清(血浆)标本的收集和处理对HCV RNA稳定性的影响
2.1.1 RT-PCR检测HCV RNA的灵敏度和重复性 实验过程中设立各种阴、阳性对照。空白对照结果为阴性，阳性对照结果为阳性。PCR产物大小与试剂盒设计的片段完全吻合为174 bP，且与marker标准条带一致。证明本实验具有高度特异性。取血5份，凝固后立即离心，取血清置-70℃保存，将该血清10倍倍比稀释后检测，结果有4份标本稀释至103倍时检测结果仍为阳性，另1份标本稀释至104倍时检测结果仍为阳性，完全重复的占80%。
2.1.2 血液置入经高压灭菌的离心管与未经高压灭菌的离心管对HCV RNA的影响 用高压灭菌与非高压灭菌普通玻璃试管取血标本各20份，在离心后将血清转入高压灭菌的离心管中，前者阳性率100%(20/20)，后者则阳性率75%(15/20)，其HCV RNA阳性检出率仍有明显改变(P<0.05)。
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2.1.3 血液凝固后于4℃放置不同时间其HCV RNA的改变 在血液凝固后立即离心取血清于1 h、2 h或4 h后离心取血清检测HCV RNA，阳性率结果几乎无差异。放置12 h后离心，血清HCV RNA阳性检出率只有75%，与立即离心检测结果有明显差异(P<0.05)。而放置24 h后离心分离血清检测，HCV RNA阳性率为70%，差异有显著性(P<0.01)，放置48h后则检测HCV RNA，则阳性率只有45%(P<0.01)。见表1。
表1 血标本凝固后不同时间离心
分离血清对HCV-RNA阳性率的影响 血凝固后离心
分离血清时间(h)
n
RT-PCR
阳性数
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阳性率(%)
(1) 0
20
20
100
(2) 1
20
19
95
(3) 2
20
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(4) 4
20
17
85
(5) 12
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15
75
(6) 24
20
12
60
(7) 48
, 百拇医药
20
9
45
( )内为组别；与(1)比较：P<0.05
2.1.4 血液凝固后立即离心与不离心对HCV RNA的影响 血液凝固后无论离心与否，在4℃放置24 h后HCV RNA阳性率均有很明显的降低，离心后放置的阳性率65%，未离心的阳性率60%，二者差异无显著性(P>0.05)。
2.1.5 血浆标本的处理对HCV RNA稳定性的影响 血凝固后立即离心，并用灭菌离心管存放血清，以在4℃放置24 h管作为对照，比较109 mmol*L-1枸橼酸钠抗凝管和150 g*L-1 EDTA-K2抗凝管血浆HCV RNA的阳性检出率。结果见表2。
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表2 不同抗凝剂分离血浆与血清的HCV RNA阳性率比较 组 别
n
RT-PCR HCV-RNA
阳性数
阳性率(%)
枸橼酸钠抗凝4℃ 24 h血浆
20
18
90
EDTA-K2抗凝4℃ 24 h血浆
20
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血清△
20
13
65
△血清为凝固后立即离心分离后放4℃ 24 h
与血清组比较：P<0.052.2 血清(血浆)样本的贮存温度及反复冻融对HCV RNA稳定性的影响
2.2.1 血标本的不同贮存温度对HCV RNA阳性检出率的影响 血液凝固后立即离心，并用灭菌离心管取出，在-70℃冻存，以此标本作为对照，比较室温、4℃或-20℃经1周、2周、1个月、3个月或6个月贮存对标本在HCV RNA阳性检出率的影响。其结果室温下贮存1周HCV RNA几乎完全降解，阳性检出率为5%(1/20)。4℃贮存2周平均阳性检出率35%(7/20)，4℃贮存1个月阳性检出率5%(1/20)。-20℃贮存3个月阳性检出率100% (20/20)，-20℃贮存6个月阳性检出率为95%(19/20)。结果表明血清(浆)标本-20℃贮存半年其HCV RNA稳定，检出率几乎没有变化。
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2.2.2 反复冻融对标本HCV RNA稳定性的影响 将15份阳性血清贮存于-20℃，每日冻融1次并取样检测HCV RNA，其中7份标本冻融7次后检测HCV RNA结果仍为阳性，但其它标本在冻融1次(2份)、3次(4份)和5次(2份)时，检测结果即转为阴性。这表明实验过程中，反复冻融会影响标本HCV RNA检测结果。标本抗冻融能力可能与HCV RNA含量有关，应尽早检测所采集标本，若不能即时检测，要分装保存，避免反复冻融。
3 讨论
HCV系单股正链RNA病毒，由于其基因易变，在不同国家和地区已发现不少于5种HCV基因型〔3，4〕，因此该试剂盒引物选用HCV 5′末端变异较少的非编码区，检出率较高。PCR扩增HCV RNA，以PCR技术本身而言，影响因素很多(如引物选择、PCR反应液中成分比例)，循环温度与时间等都可以相对固定，而HCV RNA易受内源性核酸酶分解，因此HCV RNA血清或血浆标本采集和保存是检测HCV RNA成功的关键因素之一。本研究结果提示采用血清标本进行HCV RNA RT-PCR测定应在4 h内离心，分离血清。另外，外源性RNase的作用同样不能忽视，采用普通小试管(无盖)和经过高压处理小试管，二者阳性检出率有差异(P<0.05)。这是由于标本从采集到血液凝固过程中均暴露在空气中，而试管又未经高压灭菌，使外源性RNase对血标本中的HCV RNA产生降解作用。
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我们采用临床检验科常用的枸橼酸钠和EDTA-K2两种抗凝剂，结果表明血浆中HCV RNA阳性检出率(90%、95%)明显高于24 h后血清阳性检出率(65%)。但如果不及时离心分离血浆RNA亦会影响阳性检出率，尤其是枸橼酸钠抗凝的血浆标本。有资料〔5，6〕报道肝素对PCR测定有影响，原因除了细胞中的血红素分子对Taq酶有抑制作用外，粒细胞和单核细胞释放的蛋白酶和核酸酶对病毒颗粒的降解作用也很主要。而EDTA-K2是钙离子鳌合剂是否对PCR有影响尚不清楚。
4℃室温、反复冻融对HCV RNA测定的结果与对照血清亦有差异。4℃贮存两周 HCV RNA阳性检出率下降一大半(35%)，这一点在实际操作中非常重要，即标本不能在24 h内检测，亦应在4 h内分离血清或血浆，冷冻保存。-20℃的贮存标本条件对于临床常规性检验标本是适合的，放置3个月，HCV RNA的阳性检出率几乎没有变化。在临床科研中，用于临床回顾性检测 HCV RNA标本或用于以后研究的标本应在严格一致条件下收集和贮存，以保证这些材料所提供的数据的可靠性和准确性。总之， HCV RNA检测标本应遵循如下原则：首先，用灭菌的EDTA或枸橼酸钠抗凝管收集血标本，4 h以内离心血浆；其次，如果不用抗凝剂，在血液凝固后应立即离心，分离血清；最后，长期贮存标本应贮存在-70℃(若无-70℃条件，标本亦可放置-20℃冻存)，避免反复冻融。
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作者简介：陆应玉，男，38岁，主管检验师
参考文献
1，Kwok S, Hignchi R. Avoiding false positives with PCR. Nature, 1989；339(628)：237～242
2，李勃，潘毓宣，张春燕等. PCR结合索氏转移杂交在结核病诊断中的应用。中华结核和呼吸杂志，1994，17(4)： 238～241
3，Houghton M, Weiner A, Han J et al. Molecular biology of the hepatitis C Viruses: implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology, 1991； 14(2):381～385
, http://www.100md.com
4，杜绍财,陶其敏,朱凌等. 丙型肝炎病毒基因5′-末端非编码区酶切分型研究. 中华医学杂志，1993；73(1)：1～3
5，Holodniy M, Kim S, katzenstein DA et al. Inhibition of human immunodeficiency virus gene amplification by heparin. J Clin Microbiol,1991;29(3)：676～679
6，Wang JT, Wang TH, Sheu JC et al. Effects of anticoagulants and storage of blood sample on efficacy of the palymerase chain reaction assay for hepatitis C virus. J Clin Microbiol, 1992;30(2):750～753
2000-01-08收稿，2000-05-20修回, 百拇医药