细胞吸附浓集法分离水中微量脊髓灰质炎病毒的实验研究
作者：邵荣标 钱绩虎 刘玲
单位：南通医学院微生物学与免疫学教研室，南通226001
关键词：脊髓灰质炎病毒；浓集；L20B细胞；水；细胞吸附法
南通医学院学报000112[摘 要] 目的：建立一种简便、实用的检测大量水样中的微量病毒的方法。方法：将L20B细胞加入大量的含微量脊髓灰质炎病毒的水中，充分作用后收集细胞，作病毒的分离培养。同时以NaCl—AlCl3沉淀法作对照。结果：1000ml水样中含病毒100、10TCD50时能全部检出；当含1—2TCD50时14份样本可检出13份。NaCl—AlCl3沉淀法:在100TCD50时4份样本中仅检出1份，其它各浓度的4份样都未能检出。结论：细胞吸附浓集法分离水中病毒敏感、实用。
, 百拇医药
[中图分类号] R373.2+2 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)01-0028-02
THE EXPERIMENTAL STUDY ON CULTURING VIRUSES IN ENVIRONMENTAL
WATER WITH THE METHOD OF L20B CELL ABSORPTION
SHAO Rongbiao QIAN Jihu LIU Lin
(Department of Microbiology, Nantong Medical College, Nantong 226001)
[Abstract] Objective: To set up a simple, practical, new method for detecting minimum viruses in large volume water. Methods: Adding L20B cells into the large volume water containing minimum viruses. Collecting the cells after they fully reacted with viruses, then culturing viruses, with the method of NaCl-AlCl3 sedimentation as control. Results: If the amount of viruses was 100,10TCID50 per 1000ml water, the viruses could be detected. When the amount was 1～2TCID50, the viruses in 13 of 14 samples could be detected .While the viruses ,of 100TCID50 per 1000ml water in 1 of 4 samples ,could be detected with the method of NaCl-AlCl3 sedimentation, but the viruses of other concentrations in all samples couldn't be detected. Conclusions: Absorbing viruses in water with the method of the cell absorption was sensitive and adaptive.
, 百拇医药
[Key words] virus;concentration;L20B cell;water
分离水中的病毒最关键的技术是病毒的浓集，目前所用的浓集方法主要有胶体沉淀法如NaCl—AlCl3沉淀法[1]和惰性固相吸附法如大孔性玻璃吸附[2]、正电渗滤介质颗粒法[3]、活性氧化铝吸附法等[4]，这些方法灵敏度低、病毒损耗太多、操作繁琐，几乎检不出1000 ml水中100 TCD50以下量的病毒。根据病毒感染细胞时首先特异性地与细胞膜表面的受体牢固结合的特点，我们设计了一种全新的浓集病毒的生物学方法即用敏感细胞吸附法，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 (1)病毒液：脊髓灰质炎病毒Ⅰ型,Sabin 株，其浓度6次测定的结果为106.1、106.26、106.30、106.31、106.43、106.56 TCID50/0.1ml，均值为106.3TCID50/0.1ml。(2)细胞：L20B细胞 脊髓灰质炎病毒受体转基因小鼠上皮细胞[5](仅对脊髓灰质炎病毒敏感，对其它肠道病毒不敏感),江苏省卫生防疫站惠赠。(3)稀释液：RPMI1640培养基(悬浮沉淀细胞时加抗菌素)。(4)细胞培养液：营养液10%小牛血清MEM；维持液2～3%小牛血清MEM。(5)10倍浓缩Earle’s平衡液：参照文献资料[6]，用无菌器材、灭菌水配制，调pH至6.8～7.0，蔡氏滤器过滤除菌。
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1.2 方法 本实验所有操作均采用无菌操作技术。(1)水样准备：取一瓶900ml灭菌双蒸水，加灭菌的10倍浓缩Earle’s平衡液100ml，摇匀，调pH至7.2～7.4。(2)稀释病毒：取1支病毒液,用RPMI1640培养基将其稀释成所需浓度，如100TCID50/0.1ml等，每次试验只做某个浓度的1份样本，以后再重复试验。(3)配制已知浓度病毒的水样：吸取2TCID50或者1TCID50等浓度的病毒液0.1ml加入已准备好的水样中，摇匀。临检测前放入37℃振荡水浴箱中预温15min。(4)细胞吸附法:①设对照孔：同时做2TCID50或者1TCID50病毒对照、细胞对照，2TCID50病毒做5孔(用96孔微量细胞培养板测定)、1TCID50病毒做10孔，每孔加病毒液0.1ml，补加RPMI1640 液0.1ml；细胞对照2孔：每孔加入RPMI1640 0.2ml。②培养板上加测定细胞：用0.02%EDTA-Na2消化1瓶形态良好、已长成单层的细胞，用9%小牛血清MEM 20ml洗下，制成悬液，将此悬液加入细胞板上病毒对照、细胞对照及准备测定水样的各孔中(每份水样10孔或20孔)，每孔0.1ml，37℃ CO2培养箱中培养1h以上。③水样中加入细胞吸附：用0.02%EDTA-Na2消化另1瓶形态良好、已长成单层的细胞，用10%小牛血清MEM10ml洗下,作细胞计数(细胞总数在106以上时可用)，然后将之加入含病毒的、已预温的水样中，37℃振荡保温1h。④收集吸附的细胞：将1000ml的水样分装于2只500ml的离心管中，1800～2000r/min,离心20min。吸弃上清液480ml，再吸取上清15ml放入1支50ml尖底离心管中，用余下的5ml液体将沉淀的细胞及其碎片充分悬浮后移入另1支50ml尖底离心管中，再用上述15ml上清液分3次充分洗大离心管，将洗液合并入细胞悬液中。同法处理另一500ml离心管，细胞收入上述同一50ml尖底离心管中。洗液约40ml，1800～2000r/min,离心20min后，充分吸弃上清液。⑤将收集的细胞加入细胞培养板：用RPMI1640液1ml将收集的细胞悬浮，然后移入已加了测定细胞的培养孔中，每孔0.1ml，再用RPMI1640液1ml分两次洗离心管，洗液再移入上述培养孔中，每孔0.1ml(每孔中共加入0.2ml，如果用20孔测定，则用双倍的RPMI1640液浮、洗)。37℃ CO2培养箱中培养。在培养36～48h时，用移液器轻轻吹吸各孔中的培养液，然后吸弃全部液体，补加2%小牛血清MEM 0.2ml后继续培养至7天，逐日观察有无细胞病变。当发生4个“+”病变时,将培养孔中的培养液吸出，放入一瓶形态良好、已长成单层的细胞中,核实病变。最终以3或4个“+”为阳性。(5)NaCl-AlCl3沉淀法：参照文献[1]方法进行。
, 百拇医药
2 结 果
应用细胞吸附法，测定了含不同浓度病毒的配制水样21份，用沉淀法测定了12份，测定结果见表1。 表1 两种方法水样测定结果
病毒浓度
(TCID50/0.1ml)
细胞吸附法
NaCl-AlCl3沉淀法
检测样本数
阳性份数
检测样本数
阳性份数
, 百拇医药 100
10
1～2
3
4
14
3
4*
13**
4
4
4
1
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0
0
*P<0.05,**P<0.01
3 讨 论
3.1 细胞吸附法的敏感性 根据病毒感染宿主细胞时必须首先吸附于细胞表面的受体上，病毒与受体的结合是特异的、不可逆的[7]理论，应用敏感细胞吸附大量水中的病毒，从理论上讲，如果水中有一个活的病毒颗粒，只要加入适当量的细胞、作用一定的时间，病毒就能吸附到细胞上而被检出。从我们的实验结果看，1000ml水中病毒含量低到10TCID50时，重复检验4次，能全部检出；当低至1～2TCID50时，重复试验14次，仍能检出13次(92.86%)，而目前广泛应用、效果最好的NaCl-AlCl3沉淀法，在10、1～2TCID50时重复试验4次均未检出，在100TCID50时，只有第1次检出了病毒，而以后的3次重复试验均未能检出。表明了细胞吸附法的敏感性比沉淀法高100倍左右(P<0.01)。
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3.2 用于吸附的细胞的浓度对实验结果的影响 从理论上说，加入的细胞越多越好，使水中的病毒有充分的机会与细胞接触，而被细胞吸附。我们每次用于实验的细胞经计数在2.6×106～1.8×107个/瓶之间。当细胞数超过107、检测孔数为10孔时，每孔中的细胞数太多，培养液很快变酸而不得不换液，使病毒还没有从吸附的细胞中增殖、扩散到检测细胞中就被吸弃，直接降低了检出率。吸附的细胞太少会降低吸附率，同样会降低检出率，因此每μl水样中至少应有1个细胞(106个细胞/1000ml水样)。一般情况下100ml的细胞瓶每瓶能生产2.6×106～1.8×107个细胞，因此，检测的细胞孔设20孔比较适宜。
3.3 自然水样检测的设想 当实验研究过程中所用双蒸水改成河水或污水时，水样中的污染物质会影响细胞培养。此时，我们可以采用处理粪便标本的方法来预处理水样，即采用冰冻、离心去沉浮渣，然后抗菌处理。处理后，分成若干份900ml的小样本进行细胞吸附。应当注意不能用过滤的方法去除不溶解的杂质，以防止吸附掉病毒。用L20B细胞做吸附和检测的细胞，可不受其它肠道病毒的影响，从而提高特异性，有利于L20B细胞敏感的脊髓灰质炎病毒的检出。同样，我们可以用其它细胞株检测该细胞株敏感的相应种类的病毒。
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[参考文献]
[1] 赵文彬.二种浓缩水中病毒分离方法的实验研究[J].中国卫生检验杂志,1997;7(2)∶115.
[2] Kontorovich VB，Ivanova OE， Eremeeva TP，et al.A method of concentrating viruses in environmental water sources[J]. Vopr Virusol,1996; 41(1)∶40.
[3] Li JW,Wang XW, Rui QY,et al.A new and simple method for concentration of enteric viruses from water[J]. J Virol Methods,1998;74(1)∶99.
[4] Amvros'eva TV, D'iakonova OV, Gudkov VG,et al.Active aluminum oxide-a new adsorbent for concentrating intestinal viruses from water[J]. Vopr Virusol，1999; 44(2)∶92.
[5] Wood DJ,Hull B. L20B cells simplify culture of polioviruses from clinical samples[J]. J Med Virol，1999; 58(2)∶188.
[6] 上海市卫生防疫站.卫生防疫检验(病毒检验分册)[M].上海：上海人民出版社,1977.11.
[7] 陆德源.医学微生物学[M].第4版.北京：人民卫生出版社，1996.216.
(1999-12-08收稿), 百拇医药
单位：南通医学院微生物学与免疫学教研室，南通226001
关键词：脊髓灰质炎病毒；浓集；L20B细胞；水；细胞吸附法
南通医学院学报000112[摘 要] 目的：建立一种简便、实用的检测大量水样中的微量病毒的方法。方法：将L20B细胞加入大量的含微量脊髓灰质炎病毒的水中，充分作用后收集细胞，作病毒的分离培养。同时以NaCl—AlCl3沉淀法作对照。结果：1000ml水样中含病毒100、10TCD50时能全部检出；当含1—2TCD50时14份样本可检出13份。NaCl—AlCl3沉淀法:在100TCD50时4份样本中仅检出1份，其它各浓度的4份样都未能检出。结论：细胞吸附浓集法分离水中病毒敏感、实用。
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[中图分类号] R373.2+2 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)01-0028-02
THE EXPERIMENTAL STUDY ON CULTURING VIRUSES IN ENVIRONMENTAL
WATER WITH THE METHOD OF L20B CELL ABSORPTION
SHAO Rongbiao QIAN Jihu LIU Lin
(Department of Microbiology, Nantong Medical College, Nantong 226001)
[Abstract] Objective: To set up a simple, practical, new method for detecting minimum viruses in large volume water. Methods: Adding L20B cells into the large volume water containing minimum viruses. Collecting the cells after they fully reacted with viruses, then culturing viruses, with the method of NaCl-AlCl3 sedimentation as control. Results: If the amount of viruses was 100,10TCID50 per 1000ml water, the viruses could be detected. When the amount was 1～2TCID50, the viruses in 13 of 14 samples could be detected .While the viruses ,of 100TCID50 per 1000ml water in 1 of 4 samples ,could be detected with the method of NaCl-AlCl3 sedimentation, but the viruses of other concentrations in all samples couldn't be detected. Conclusions: Absorbing viruses in water with the method of the cell absorption was sensitive and adaptive.
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[Key words] virus;concentration;L20B cell;water
分离水中的病毒最关键的技术是病毒的浓集，目前所用的浓集方法主要有胶体沉淀法如NaCl—AlCl3沉淀法[1]和惰性固相吸附法如大孔性玻璃吸附[2]、正电渗滤介质颗粒法[3]、活性氧化铝吸附法等[4]，这些方法灵敏度低、病毒损耗太多、操作繁琐，几乎检不出1000 ml水中100 TCD50以下量的病毒。根据病毒感染细胞时首先特异性地与细胞膜表面的受体牢固结合的特点，我们设计了一种全新的浓集病毒的生物学方法即用敏感细胞吸附法，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 (1)病毒液：脊髓灰质炎病毒Ⅰ型,Sabin 株，其浓度6次测定的结果为106.1、106.26、106.30、106.31、106.43、106.56 TCID50/0.1ml，均值为106.3TCID50/0.1ml。(2)细胞：L20B细胞 脊髓灰质炎病毒受体转基因小鼠上皮细胞[5](仅对脊髓灰质炎病毒敏感，对其它肠道病毒不敏感),江苏省卫生防疫站惠赠。(3)稀释液：RPMI1640培养基(悬浮沉淀细胞时加抗菌素)。(4)细胞培养液：营养液10%小牛血清MEM；维持液2～3%小牛血清MEM。(5)10倍浓缩Earle’s平衡液：参照文献资料[6]，用无菌器材、灭菌水配制，调pH至6.8～7.0，蔡氏滤器过滤除菌。
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1.2 方法 本实验所有操作均采用无菌操作技术。(1)水样准备：取一瓶900ml灭菌双蒸水，加灭菌的10倍浓缩Earle’s平衡液100ml，摇匀，调pH至7.2～7.4。(2)稀释病毒：取1支病毒液,用RPMI1640培养基将其稀释成所需浓度，如100TCID50/0.1ml等，每次试验只做某个浓度的1份样本，以后再重复试验。(3)配制已知浓度病毒的水样：吸取2TCID50或者1TCID50等浓度的病毒液0.1ml加入已准备好的水样中，摇匀。临检测前放入37℃振荡水浴箱中预温15min。(4)细胞吸附法:①设对照孔：同时做2TCID50或者1TCID50病毒对照、细胞对照，2TCID50病毒做5孔(用96孔微量细胞培养板测定)、1TCID50病毒做10孔，每孔加病毒液0.1ml，补加RPMI1640 液0.1ml；细胞对照2孔：每孔加入RPMI1640 0.2ml。②培养板上加测定细胞：用0.02%EDTA-Na2消化1瓶形态良好、已长成单层的细胞，用9%小牛血清MEM 20ml洗下，制成悬液，将此悬液加入细胞板上病毒对照、细胞对照及准备测定水样的各孔中(每份水样10孔或20孔)，每孔0.1ml，37℃ CO2培养箱中培养1h以上。③水样中加入细胞吸附：用0.02%EDTA-Na2消化另1瓶形态良好、已长成单层的细胞，用10%小牛血清MEM10ml洗下,作细胞计数(细胞总数在106以上时可用)，然后将之加入含病毒的、已预温的水样中，37℃振荡保温1h。④收集吸附的细胞：将1000ml的水样分装于2只500ml的离心管中，1800～2000r/min,离心20min。吸弃上清液480ml，再吸取上清15ml放入1支50ml尖底离心管中，用余下的5ml液体将沉淀的细胞及其碎片充分悬浮后移入另1支50ml尖底离心管中，再用上述15ml上清液分3次充分洗大离心管，将洗液合并入细胞悬液中。同法处理另一500ml离心管，细胞收入上述同一50ml尖底离心管中。洗液约40ml，1800～2000r/min,离心20min后，充分吸弃上清液。⑤将收集的细胞加入细胞培养板：用RPMI1640液1ml将收集的细胞悬浮，然后移入已加了测定细胞的培养孔中，每孔0.1ml，再用RPMI1640液1ml分两次洗离心管，洗液再移入上述培养孔中，每孔0.1ml(每孔中共加入0.2ml，如果用20孔测定，则用双倍的RPMI1640液浮、洗)。37℃ CO2培养箱中培养。在培养36～48h时，用移液器轻轻吹吸各孔中的培养液，然后吸弃全部液体，补加2%小牛血清MEM 0.2ml后继续培养至7天，逐日观察有无细胞病变。当发生4个“+”病变时,将培养孔中的培养液吸出，放入一瓶形态良好、已长成单层的细胞中,核实病变。最终以3或4个“+”为阳性。(5)NaCl-AlCl3沉淀法：参照文献[1]方法进行。
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2 结 果
应用细胞吸附法，测定了含不同浓度病毒的配制水样21份，用沉淀法测定了12份，测定结果见表1。 表1 两种方法水样测定结果
病毒浓度
(TCID50/0.1ml)
细胞吸附法
NaCl-AlCl3沉淀法
检测样本数
阳性份数
检测样本数
阳性份数
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10
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*P<0.05,**P<0.01
3 讨 论
3.1 细胞吸附法的敏感性 根据病毒感染宿主细胞时必须首先吸附于细胞表面的受体上，病毒与受体的结合是特异的、不可逆的[7]理论，应用敏感细胞吸附大量水中的病毒，从理论上讲，如果水中有一个活的病毒颗粒，只要加入适当量的细胞、作用一定的时间，病毒就能吸附到细胞上而被检出。从我们的实验结果看，1000ml水中病毒含量低到10TCID50时，重复检验4次，能全部检出；当低至1～2TCID50时，重复试验14次，仍能检出13次(92.86%)，而目前广泛应用、效果最好的NaCl-AlCl3沉淀法，在10、1～2TCID50时重复试验4次均未检出，在100TCID50时，只有第1次检出了病毒，而以后的3次重复试验均未能检出。表明了细胞吸附法的敏感性比沉淀法高100倍左右(P<0.01)。
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3.2 用于吸附的细胞的浓度对实验结果的影响 从理论上说，加入的细胞越多越好，使水中的病毒有充分的机会与细胞接触，而被细胞吸附。我们每次用于实验的细胞经计数在2.6×106～1.8×107个/瓶之间。当细胞数超过107、检测孔数为10孔时，每孔中的细胞数太多，培养液很快变酸而不得不换液，使病毒还没有从吸附的细胞中增殖、扩散到检测细胞中就被吸弃，直接降低了检出率。吸附的细胞太少会降低吸附率，同样会降低检出率，因此每μl水样中至少应有1个细胞(106个细胞/1000ml水样)。一般情况下100ml的细胞瓶每瓶能生产2.6×106～1.8×107个细胞，因此，检测的细胞孔设20孔比较适宜。
3.3 自然水样检测的设想 当实验研究过程中所用双蒸水改成河水或污水时，水样中的污染物质会影响细胞培养。此时，我们可以采用处理粪便标本的方法来预处理水样，即采用冰冻、离心去沉浮渣，然后抗菌处理。处理后，分成若干份900ml的小样本进行细胞吸附。应当注意不能用过滤的方法去除不溶解的杂质，以防止吸附掉病毒。用L20B细胞做吸附和检测的细胞，可不受其它肠道病毒的影响，从而提高特异性，有利于L20B细胞敏感的脊髓灰质炎病毒的检出。同样，我们可以用其它细胞株检测该细胞株敏感的相应种类的病毒。
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[参考文献]
[1] 赵文彬.二种浓缩水中病毒分离方法的实验研究[J].中国卫生检验杂志,1997;7(2)∶115.
[2] Kontorovich VB，Ivanova OE， Eremeeva TP，et al.A method of concentrating viruses in environmental water sources[J]. Vopr Virusol,1996; 41(1)∶40.
[3] Li JW,Wang XW, Rui QY,et al.A new and simple method for concentration of enteric viruses from water[J]. J Virol Methods,1998;74(1)∶99.
[4] Amvros'eva TV, D'iakonova OV, Gudkov VG,et al.Active aluminum oxide-a new adsorbent for concentrating intestinal viruses from water[J]. Vopr Virusol，1999; 44(2)∶92.
[5] Wood DJ,Hull B. L20B cells simplify culture of polioviruses from clinical samples[J]. J Med Virol，1999; 58(2)∶188.
[6] 上海市卫生防疫站.卫生防疫检验(病毒检验分册)[M].上海：上海人民出版社,1977.11.
[7] 陆德源.医学微生物学[M].第4版.北京：人民卫生出版社，1996.216.
(1999-12-08收稿), 百拇医药