慢性应激对大鼠学习记忆能力和海马LTP的影响
作者：马强 王静 杨志华 刘洪涛 晁福寰
单位：军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050
关键词：慢性应激；海马；长时程增强；学习记忆
中国应用生理学杂志000408
摘要 目的和方法：本研究采用一种多因素的21 d慢性应激动物模型，以Y 迷宫和 LTP为指标，探讨慢性应激对动物学习记忆能力和海马神经突触可塑性的影响。结果：长期慢性应激使大鼠空间学习记忆能力下降，而且，使中枢海马齿状回LT P的诱生受到抑制。结论：慢性应激可能使大鼠海马齿状回神经突触可塑性 降低，并进一步影响到学习记忆的功能。
中图分类号： R338文献编识码:A
文章编号:10 00-6834(2000)04-0318-03
, 百拇医药
EFFECTS OF CHRONIC STRESS ON THE LEARNING AND
MEMORY ABILITY AND HIPPOCAMPAL LTP IN RATS
MA Qiang WANG Jing YANG Zhi-hua LIV Hong-tao CHAO Fu-huan
(Institute of Health and Environmental Medicine, Tianjin 300050)
ABSTRACT Aim and Methods: A chronic stress model in 21 days with multi-stres sors was applied to question the effects of stress on the learning and memory ab ility and the hippocampal neuronal synaptic plasticity in rats, using the Y maz e test and LTP electrophysiological recording in vivo. Results: The impairment of spatial learning and memory ability and an obvious suppression in LTP in hippocampal dentate gyrus was observed in stress group after chronic stress. Conclusion: The hippocampal synaptic plasticity may be decreased by the chronic stress. And then, the learning and memory ability may also be impaired consequently.
, http://www.100md.com
KEY WORDS: chronic stress; hipocampus; long-te rm potentiation(LTP); learning and memory
心理紧张、紧急突发事件和其它应激因素会使机体产生应激反应。生理范围内的应激反 应对机体有利，益于机体快速适应外界环境的变化；但如果应激反应过强、时间过长则对机 体有害。研究发现，当人或动物处于强烈的急性应激或长期慢性应激的状况时，其学习记忆 能力会受到明显的影响[1]。如今，应激对脑功能、尤其对学习记忆能力的影响引 起了人们极大的关注，并己成为神经科学和心理学领域研究的热点问题[2]。
在中枢神经系统中，海马属边缘系统，是与学习记忆和情绪、行为功能密切相关的重要 脑区，而海马神经的突触塑性则与学习记忆功能密切相关。在脑科学的研究中，长时程增强 (long-term potentiation，LTP)效应被认为是神经突触可塑性和突触传递的一种表现形式 ，是学习记忆的神经细胞学基础。 LTP作为衡量海马神经突触可塑性的重要指标，己被广泛 应用[3]。
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基于当前的研究热点，跟踪发展趋势，本研究采用一种多因素的慢性应激动物模型，以 Y迷宫和LTP为主要指标，就慢性应激对学习记忆能力及海马神经突触可塑性的影响进行了初 步研究。
1 方法
1.1 慢性应激动物模型
成年雄性Wistar大鼠20只(体重160 g左右，军事医学科学院卫生学环境医学研究所二级 动物房提供)，随机选10只作为应激组，10只作对照组。采用三种应激方式：束缚(6 h/d) 、电击足部(50 V，50 Hz，4 min/d)、 噪声(1 500 Hz，92 dB，1 h/d)，每天随机选一种 应激方式作用于应激组的动物，共应激21 d。具体过程为：第1、4、5、6、7、9、19 d噪声 应激，第2、8、14、15、16、17、18 d电击应激，第3、10、11、12、13、20、21 d束缚应 激。对照织在不受实验应激原的影响下，同期饲养21 d。
, 百拇医药
1.2 Y迷宫测验
动物于21 d应激后的第一天，进行Y迷宫测验。记录15次随机变换灯亮(电击)，动物向 灯亮处(正确)跑的次数。正确率＝正确次数/15。学习能力为第一天测验的正确率，记忆能 力为第二天测验的正确率。 Y迷宫的测验成绩反映空间学习记忆能力。
1.3 LTP记录
慢性应激48 h后，开始LTP实验。做过Y迷宫测验的动物，于测验结束24 h后做LTP。动 物用20%乌拉坦腹腔注射麻醉(1.5 g/kg)，在脑定位仪上固定头部。记录电极定位于大鼠 海马的齿状回(DG)(前囟后3.5 mm、中缝旁2.0 mm、硬脑膜下3.5 mm)，刺激电极定位于 脑同侧的中穿行通路(medial perforant pathway， MPP)上(前囟后8.0mm、中缝旁4.0 mm 、硬脑膜下3.0 mm)。
实验开始时，先用中等刺激电压的单刺激(interval 30 sec，duration 100usec)诱发 齿状回产生群峰电位(population spike， PS)，记录至少30 min，使PS幅值达到稳定。调 节刺激电压，使PS幅值达最大值；再下调刺激电压，使PS保持在其最大峰值的50%，固定此刺激电压。用单刺激，记录每5 min内P S的平均值，共记录30 min。然后，用高频刺激(hig h frequency stimulation，HFS)：2sec内10次 internal=5 msec， duration=100 usec，t rains=5的复合串刺激，诱发LTP。 HFS之后，再用 HFS前的单刺激，记录每5 min内P S的平均值，共记录60 min。
, 百拇医药
实验用生物电放大器及示波器： Dantec neuromatic 2 000 M。电刺激器： Nihonkohd en electronic stimulator sen-3201。
After
对 LTP实验，以 HFS前5 min内的 PS均值为100%,HFS前后各时间点记录的 PS均值与之 比较，以百分数(%)表示。
实验结果为同组各只动物实验数值的平均值，表示为：均数±标准差(
±s) 。
实验组与对照组数据比较：t检验(Excel 97的统计学程序)， P<0.05为有显著差 异。
2 结果
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2.1 慢性应激对学习记忆能力的影响
经过21 d应激，反映动物空间学习记忆能力的Y迷宫测验成绩明显下降，表明慢性应激 对短期的学习记忆能力会产生明显的影响(图1)。应激组(n=5)的学习能力和记忆保持能 力均差于对照组(n=5)，差异显著(P<0.01)。
Fig.1 Effect of chronic stress on lear
ning and memory ability of rats
* P<0.01 compared with control
2.2 慢性应激对LTP的影响
, 百拇医药
经过21 d的慢性应激，应激组动物海马齿状回 LTP的形成受到明显的抑制。 MPP在接受 象征学习信号的 HFS后，应激组动物海马齿状回群峰电位幅值增强(104.8±30.8%～117.3 ±39.6%， n=7)明显低于对照组(201.8±51.3%～242.2±84.3%，n=8 P<0 .01)。一般情况下， HFS后，与刺激前相比，PS增高在30%以上、并维持此高度较长时间(1 h以上)时，称为LTP。实验结果显示，给予MPP HFS后，应激组动物海马齿状回引出的PS增 高低于HFS前的30%，未能形成真正的LTP。表明本实验形式的长期慢性应激对大鼠海马齿状 回LTP的诱发有明显的抑制作用(图2)。
Fig.2 Effect of chronic stress on the formation
of LTP in hippocampal DG in rats
, 百拇医药
* P<0.01 compared with control
3 讨论
日常生活中及战争情况下应激事件经常发生，由于应激常导致学习记忆能力的下降，所以， 引起科学家们极大的兴趣而从事该方面的研究。在有关方面研究中采用的应激模型，多为单 一形式的应激模型，如束缚、强迫游泳等。为避免动物对一种应激原产生适应，防止单一应 激刺激的强度过大，使动物机体在短期内受到病理的伤害，本研究采用了一种多因素的慢性 应激模型，每天随机的将不同的应激刺激作用于动物体，使其不可预测，且不能产生适应。 从实验结果看，该模型达到了预期的目的。
应激反应时，体内应激激素分泌增高，其中主要是血浆糖皮质激素水平的升高。以往研 究表明，应激反应危害机体的主要原因之一，正是由体内过高浓度的糖皮质激素造成的 [2]。过高水平的糖皮质激素不但影响外周免疫系统和心血管系统的正常生理功能。而 且，血中游离的糖皮质激素还可以自由通过血脑屏障，进入脑组织，影响脑功能。研究发现 ，由于海马脑区神经元富含糖皮质激素受体(GR)，并且是中枢神经系统中 GR含量最高的部 位，所以，应激反应时，高水平的糖皮质激素会选择性的作用于海马，对其产生影响[ 4]。 Mc Ewen的研究发现，21天的慢性束缚应激会致大鼠海马CA3区神经细胞树突萎缩、 DG神经元生长受到抑制、神经突触塑性发生改变[5]。 Pavlides也曾报道，在长期 高浓度的糖皮质激素作用下，会使大鼠海马齿状回LTP的诱发受到抑制[6]。
, 百拇医药
LTP反应了海马神经突触传递的增强。在高频电刺激后，即受到学习信号的刺激，正常 海马的神经突触联系会增强，以达到记忆和传递外来信息的效果。慢性应激使LTP的形成发 生抑制，表明应激使神经突触的形态结构基础即突触可塑性发生了某些改变，这些改变不利 于信息的获取和保存。
具体分析本研究结果，可能由于长期慢性的应激使动物神经内分泌功能失衡，导致神经 内分泌亢进，使体内糖皮质激素水平异常升高(本研究未测血浆皮质酮的含量)；海马由于长 期受到过量的糖皮质激素的作用，导致海马神经元在形态结构和功能及突触塑性上发生某些 不利的改变，抑制了海马LTP的形成，并一步影响到学习记忆的功能。
本研究有待在应激致海马神经细胞及突触形态变化的病理切片观察、应激水平糖皮质激 素对海马神经细胞损伤机制等方面进行深入的研究。
作者简介：马强(1964-)，男 ，河北省人，助研，博士，从事应激医 学研究。
, 百拇医药
4 参考文献
[1] Quervain D J, Roozendaal B, McGaugh J L. Stress and glucocorticoids impair retrieval of long-term spatial memory[J]. Nature，1998,394(6695): 787-90.
[2] Jeansok J K, Kenneth S Y. Stress: metaplastic effects on the hippocampus[ J]. Trends in Neuroscience， 1998,21(12):505-509.
[3] Bliss T V P, Collingridge G L. A synaptic model of memory: long-term pote ntiation in the hippocampus[J]. Nature, 1993,361:31-39.
, 百拇医药
[4] Sapolsky R M. Why stress is bad for your brain[J]. Science 1996,273( 5276):749-750.
[5] McEwen B S. Stress and hippocampal plasticity[J]. Annu Rev Neurosci ， 1999,22:105-122 .
[6] Pavlides C,Ogawa S.Role of adrenal steroid mineralocorticoid and glucoco rticoid receptors in long-term potentiation in the CA1 field of hippocampal sli ces[J]. Brain Res,1996,738(2):229-235.
收稿日期：1999-08-02
修回日期:2000-06-12, 百拇医药
单位：军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050
关键词：慢性应激；海马；长时程增强；学习记忆
中国应用生理学杂志000408
摘要 目的和方法：本研究采用一种多因素的21 d慢性应激动物模型，以Y 迷宫和 LTP为指标，探讨慢性应激对动物学习记忆能力和海马神经突触可塑性的影响。结果：长期慢性应激使大鼠空间学习记忆能力下降，而且，使中枢海马齿状回LT P的诱生受到抑制。结论：慢性应激可能使大鼠海马齿状回神经突触可塑性 降低，并进一步影响到学习记忆的功能。
中图分类号： R338文献编识码:A
文章编号:10 00-6834(2000)04-0318-03
, 百拇医药
EFFECTS OF CHRONIC STRESS ON THE LEARNING AND
MEMORY ABILITY AND HIPPOCAMPAL LTP IN RATS
MA Qiang WANG Jing YANG Zhi-hua LIV Hong-tao CHAO Fu-huan
(Institute of Health and Environmental Medicine, Tianjin 300050)
ABSTRACT Aim and Methods: A chronic stress model in 21 days with multi-stres sors was applied to question the effects of stress on the learning and memory ab ility and the hippocampal neuronal synaptic plasticity in rats, using the Y maz e test and LTP electrophysiological recording in vivo. Results: The impairment of spatial learning and memory ability and an obvious suppression in LTP in hippocampal dentate gyrus was observed in stress group after chronic stress. Conclusion: The hippocampal synaptic plasticity may be decreased by the chronic stress. And then, the learning and memory ability may also be impaired consequently.
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KEY WORDS: chronic stress; hipocampus; long-te rm potentiation(LTP); learning and memory
心理紧张、紧急突发事件和其它应激因素会使机体产生应激反应。生理范围内的应激反 应对机体有利，益于机体快速适应外界环境的变化；但如果应激反应过强、时间过长则对机 体有害。研究发现，当人或动物处于强烈的急性应激或长期慢性应激的状况时，其学习记忆 能力会受到明显的影响[1]。如今，应激对脑功能、尤其对学习记忆能力的影响引 起了人们极大的关注，并己成为神经科学和心理学领域研究的热点问题[2]。
在中枢神经系统中，海马属边缘系统，是与学习记忆和情绪、行为功能密切相关的重要 脑区，而海马神经的突触塑性则与学习记忆功能密切相关。在脑科学的研究中，长时程增强 (long-term potentiation，LTP)效应被认为是神经突触可塑性和突触传递的一种表现形式 ，是学习记忆的神经细胞学基础。 LTP作为衡量海马神经突触可塑性的重要指标，己被广泛 应用[3]。
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基于当前的研究热点，跟踪发展趋势，本研究采用一种多因素的慢性应激动物模型，以 Y迷宫和LTP为主要指标，就慢性应激对学习记忆能力及海马神经突触可塑性的影响进行了初 步研究。
1 方法
1.1 慢性应激动物模型
成年雄性Wistar大鼠20只(体重160 g左右，军事医学科学院卫生学环境医学研究所二级 动物房提供)，随机选10只作为应激组，10只作对照组。采用三种应激方式：束缚(6 h/d) 、电击足部(50 V，50 Hz，4 min/d)、 噪声(1 500 Hz，92 dB，1 h/d)，每天随机选一种 应激方式作用于应激组的动物，共应激21 d。具体过程为：第1、4、5、6、7、9、19 d噪声 应激，第2、8、14、15、16、17、18 d电击应激，第3、10、11、12、13、20、21 d束缚应 激。对照织在不受实验应激原的影响下，同期饲养21 d。
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1.2 Y迷宫测验
动物于21 d应激后的第一天，进行Y迷宫测验。记录15次随机变换灯亮(电击)，动物向 灯亮处(正确)跑的次数。正确率＝正确次数/15。学习能力为第一天测验的正确率，记忆能 力为第二天测验的正确率。 Y迷宫的测验成绩反映空间学习记忆能力。
1.3 LTP记录
慢性应激48 h后，开始LTP实验。做过Y迷宫测验的动物，于测验结束24 h后做LTP。动 物用20%乌拉坦腹腔注射麻醉(1.5 g/kg)，在脑定位仪上固定头部。记录电极定位于大鼠 海马的齿状回(DG)(前囟后3.5 mm、中缝旁2.0 mm、硬脑膜下3.5 mm)，刺激电极定位于 脑同侧的中穿行通路(medial perforant pathway， MPP)上(前囟后8.0mm、中缝旁4.0 mm 、硬脑膜下3.0 mm)。
实验开始时，先用中等刺激电压的单刺激(interval 30 sec，duration 100usec)诱发 齿状回产生群峰电位(population spike， PS)，记录至少30 min，使PS幅值达到稳定。调 节刺激电压，使PS幅值达最大值；再下调刺激电压，使PS保持在其最大峰值的50%，固定此刺激电压。用单刺激，记录每5 min内P S的平均值，共记录30 min。然后，用高频刺激(hig h frequency stimulation，HFS)：2sec内10次 internal=5 msec， duration=100 usec，t rains=5的复合串刺激，诱发LTP。 HFS之后，再用 HFS前的单刺激，记录每5 min内P S的平均值，共记录60 min。
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实验用生物电放大器及示波器： Dantec neuromatic 2 000 M。电刺激器： Nihonkohd en electronic stimulator sen-3201。
After
对 LTP实验，以 HFS前5 min内的 PS均值为100%,HFS前后各时间点记录的 PS均值与之 比较，以百分数(%)表示。
实验结果为同组各只动物实验数值的平均值，表示为：均数±标准差(
±s) 。实验组与对照组数据比较：t检验(Excel 97的统计学程序)， P<0.05为有显著差 异。
2 结果
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2.1 慢性应激对学习记忆能力的影响
经过21 d应激，反映动物空间学习记忆能力的Y迷宫测验成绩明显下降，表明慢性应激 对短期的学习记忆能力会产生明显的影响(图1)。应激组(n=5)的学习能力和记忆保持能 力均差于对照组(n=5)，差异显著(P<0.01)。
Fig.1 Effect of chronic stress on lear
ning and memory ability of rats
* P<0.01 compared with control
2.2 慢性应激对LTP的影响
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经过21 d的慢性应激，应激组动物海马齿状回 LTP的形成受到明显的抑制。 MPP在接受 象征学习信号的 HFS后，应激组动物海马齿状回群峰电位幅值增强(104.8±30.8%～117.3 ±39.6%， n=7)明显低于对照组(201.8±51.3%～242.2±84.3%，n=8 P<0 .01)。一般情况下， HFS后，与刺激前相比，PS增高在30%以上、并维持此高度较长时间(1 h以上)时，称为LTP。实验结果显示，给予MPP HFS后，应激组动物海马齿状回引出的PS增 高低于HFS前的30%，未能形成真正的LTP。表明本实验形式的长期慢性应激对大鼠海马齿状 回LTP的诱发有明显的抑制作用(图2)。
Fig.2 Effect of chronic stress on the formation
of LTP in hippocampal DG in rats
, 百拇医药
* P<0.01 compared with control
3 讨论
日常生活中及战争情况下应激事件经常发生，由于应激常导致学习记忆能力的下降，所以， 引起科学家们极大的兴趣而从事该方面的研究。在有关方面研究中采用的应激模型，多为单 一形式的应激模型，如束缚、强迫游泳等。为避免动物对一种应激原产生适应，防止单一应 激刺激的强度过大，使动物机体在短期内受到病理的伤害，本研究采用了一种多因素的慢性 应激模型，每天随机的将不同的应激刺激作用于动物体，使其不可预测，且不能产生适应。 从实验结果看，该模型达到了预期的目的。
应激反应时，体内应激激素分泌增高，其中主要是血浆糖皮质激素水平的升高。以往研 究表明，应激反应危害机体的主要原因之一，正是由体内过高浓度的糖皮质激素造成的 [2]。过高水平的糖皮质激素不但影响外周免疫系统和心血管系统的正常生理功能。而 且，血中游离的糖皮质激素还可以自由通过血脑屏障，进入脑组织，影响脑功能。研究发现 ，由于海马脑区神经元富含糖皮质激素受体(GR)，并且是中枢神经系统中 GR含量最高的部 位，所以，应激反应时，高水平的糖皮质激素会选择性的作用于海马，对其产生影响[ 4]。 Mc Ewen的研究发现，21天的慢性束缚应激会致大鼠海马CA3区神经细胞树突萎缩、 DG神经元生长受到抑制、神经突触塑性发生改变[5]。 Pavlides也曾报道，在长期 高浓度的糖皮质激素作用下，会使大鼠海马齿状回LTP的诱发受到抑制[6]。
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LTP反应了海马神经突触传递的增强。在高频电刺激后，即受到学习信号的刺激，正常 海马的神经突触联系会增强，以达到记忆和传递外来信息的效果。慢性应激使LTP的形成发 生抑制，表明应激使神经突触的形态结构基础即突触可塑性发生了某些改变，这些改变不利 于信息的获取和保存。
具体分析本研究结果，可能由于长期慢性的应激使动物神经内分泌功能失衡，导致神经 内分泌亢进，使体内糖皮质激素水平异常升高(本研究未测血浆皮质酮的含量)；海马由于长 期受到过量的糖皮质激素的作用，导致海马神经元在形态结构和功能及突触塑性上发生某些 不利的改变，抑制了海马LTP的形成，并一步影响到学习记忆的功能。
本研究有待在应激致海马神经细胞及突触形态变化的病理切片观察、应激水平糖皮质激 素对海马神经细胞损伤机制等方面进行深入的研究。
作者简介：马强(1964-)，男 ，河北省人，助研，博士，从事应激医 学研究。
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4 参考文献
[1] Quervain D J, Roozendaal B, McGaugh J L. Stress and glucocorticoids impair retrieval of long-term spatial memory[J]. Nature，1998,394(6695): 787-90.
[2] Jeansok J K, Kenneth S Y. Stress: metaplastic effects on the hippocampus[ J]. Trends in Neuroscience， 1998,21(12):505-509.
[3] Bliss T V P, Collingridge G L. A synaptic model of memory: long-term pote ntiation in the hippocampus[J]. Nature, 1993,361:31-39.
, 百拇医药
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[5] McEwen B S. Stress and hippocampal plasticity[J]. Annu Rev Neurosci ， 1999,22:105-122 .
[6] Pavlides C,Ogawa S.Role of adrenal steroid mineralocorticoid and glucoco rticoid receptors in long-term potentiation in the CA1 field of hippocampal sli ces[J]. Brain Res,1996,738(2):229-235.
收稿日期：1999-08-02
修回日期:2000-06-12, 百拇医药