用免疫学方法判断重组人红细胞生成素滥用的研究
作者：方子龙 杨树民 王小兵 王杉 秦旸曾凡星 谢敏豪 邓静 张长久 杨天乐
单位：方子龙(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；杨树民(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；王小兵(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；王杉(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；秦旸(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；谢敏豪(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；邓静(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；
关键词：红细胞生成素；兴奋剂检测；转铁蛋白可溶性受体；酶联免疫吸附法
用免疫学方法判断重组人红细胞生成素滥用的研究 摘 要：给6名健康青年男性受试者皮下注射重组人红细胞生成素(rhEPO)，剂量为30IU/kg体重，每周3次，注射持续4周。同时给4名对照受试者注射安慰剂。采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行指标测定。结果表明：注射rhEPO能提高血清EPO浓度和转铁蛋白可溶性受体(TfR)浓度；在停药后1个星期左右的时间内，TfR浓度仍保持在较高的水平；而血浆总纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(TDP)含量未发现规律性的变化。结果提示：血清EPO和TfR浓度有可能作为rhEPO滥用检测的指标。
, http://www.100md.com
Detection of Recombinant Human Erythropoietin Misuse by Immunoassay
Fang Zilong, Yang Shumin, Wang Xiaobing
(National Research Institute of Sports Medicine, Beijing 100029, China)
Abstract：Six healthy young male volunteers were subcutaneously administered by recom binant human erythropoietin (rhEPO) with a dosage of 30IU/kg bodyweight, three times a week for four weeks. Four volunteers as controls were administered by equal placebo. So me biochemical parameters were observed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in this st udy. EPO and transferrin soluble receptor (TfR) concentrations in serum were elevated by the administration of rhEPO. TfR concentration maintained higher level after the ad ministration of rhEPO within one week. Total of fibrinogen degradation products and fibrin degr adation products (TDP) concentrations in plasma changed irregularly. The results sugge sted that serum EPO and TfR concentration might be the validate parameters on the detectio n of rhEPO misuse.
, 百拇医药
Key words：erythropoietin, doping detection, transferrin soluble receptor, ELISA▲
应用常规检测兴奋剂的色谱学方法对重组人红细胞生成素(rhEPO)滥用进行检测非常困难，因为EPO是一种分子量很大(大约34KD)的肽类激素。采用免疫学方法对血中EPO和相关指标进行测定是目前普遍开展的研究工作，希望从中筛选出有效的指标，用于实际检测中。依赖于某些内源性指标，间接判定是否使用rhEPO，是目前检测rhEPO滥用的一个现实思路。已有研究证明，rhEPO能增加血清转铁蛋白可溶性受体(TfR)的浓度[1，2]，对凝血系统也会产生影响[2]。我们对普通青年男子注射rhEPO，采用免疫学方法对有关指标进行测定。
1 对象和方法
1.1 实验对象 普通男性志愿者(非运动员)10名，年龄19-23岁，随机 分为两组：对照组(n=4)和实验组(n=6)。经临床体检，所有受试者身体健康，实验期间 从事适量的锻炼和体力劳动。
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1.2 rhEPO注射 (1)实验组：皮下注射rhEPO-β注射剂(Recormon 200 0，德国Boehringer公司)，剂量为30IU/kg体重，每周3次，共注射4周。(2)对照组：与 实验组同时注射等体积的注射用水。所有受试者每天同时口服富马酸铁(200mg，t.i.d. )和叶酸(5mg，t.i.d.)。
1.3 样品收集 于早晨8:00-10:00，采集安静时静脉血，一部分血分离血 清，用于测定EPO和TfR；另一部分加肝素抗凝，分离血浆，用于测定总纤维蛋白和纤维蛋白 原降解产物(TDP)。取血时间为注射前1天、注射后3天、9天、11天，15天、17天、19天、 21天、23天、25天、27天、29天、34天和40天。
1.4 指标测试 血清EPO和TfR浓度用美国R&D Systems公司的酶联免疫吸 附 法(ELISA)检测试剂盒进行测定，血浆TDP含量用美国Microelisa System公司的ELISA法检 测试剂盒进行测定。操作方法按试剂盒说明书进行，测定仪器为美国Bio-Tek 公司的EL-311 型自动微板读数仪。
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1.5 统计处理 数据用平均值±标准差表示，采用SPSS统计软件包进行 单因 素方差分析(ANOVA)，对两组受试者的结果分别进行注射前、后差异的比较；当ANOVA显示 有显著性差异时(p<0.05)，用LSD两两比较法将注射后各点的均值分别与注射前均数进行 比较，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。两组注射前数据用成组T检验法比较。
2 结果
注射前，实验组和对照组的血清EPO浓度分别为4.91±3.86mIU/mL和5.21±1.47mIU/mL ，二者之间无明显差异。由于血清EPO的半衰期很短，我们仅对给药期间的EPO浓度进行测定 。注射后，实验组的EPO浓度升高，在第3天、11天、17天、21天、23天、25天和27天均明显 高于注射前。对照组的EPO浓度变化不明显(图1)。
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图1 rhEPO对血清EPO浓度的影响
Figure 1 Effect of rhEPO on serum EPO leve l
与注射前相比，*p<0.05，**p<0.01
注射前，实验组和对照组的TfR浓度分别为3.27±0.48μg/mL和 3.22±0.20μg/mL， 二者之间 无明显差异。注射后，实验组的TfR浓度升高，在给药期间的第9天、11天，15天、19天、23 天、25天、27天均明显高于注射前；在停药后2天(第29天)和7天(第34天)仍维持在较高 的水平，到13天(第40天)才降低到注射前的水平。对照组的TfR浓度变化不明显(图2)。
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图2 rhEPO对血清TfR浓度的影响
Figure 2 Effect of rhEPO on serum TfR leve l
与注射前相比*p<0.05，**p<0.01
血浆TDP含量的个体间差异很大，个体内也存在很大的变异；未发现注射rhEPO引起TDP发生 有规律性的变化(图3)。
图3 rhEPO对血浆TDP含量的影响
Figure 3 Effect of rhEPO on plasma TDP lev el
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3 讨论
内源性EPO是一种含有166个氨基酸的单链酸性糖蛋白，分子量约为34KD。根据其含糖量的不 同，可分为EPOα(含31%的糖)和EPOβ(含24%的糖)。采用DNA 重组技术生产的EPO也有E POα和EPOβ两种形式。EPOα和EPOβ具有相似的生物活性和抗原属性[3] 。
注射rhEPO最直接的变化就是血清EPO浓度的升高，但是单独测定血清EPO的浓度难以判定是 否使用了外源性rhEPO。因为正常人的血清EPO浓度的变化范围可以很大，可超过10倍，尽管 他们的红细胞(RBC)计数可能近似。EPO的分泌还表现出一定的昼夜节律，在半夜时血清EP O浓度最高。一般情况下，血清EPO浓度变化范围不超过其平均值的20%[4] 。EPO在血中的半衰期很短，因注射方式不同而有所差别。静脉注射和皮下注射rhE PO后，其平均半衰期分别为4.5小时和25小时，且依剂量不同而变化[5] 。多次给药，半衰期会缩短。以治疗剂量(80IU/kg体重)静脉注射，血清EPO浓度可 在24小时之内表现异常；以皮下注射，血清EPO峰值在5-24小时内出现，4天后回到正常水 平。EPO发挥作用的时间较晚(大约3天作用)，如果是为了提高运动能力而使用rhEPO，当血氧分压达到使运动员满意的时候，注射的rhEPO可能已经被机体代谢清除了 [2]。
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在我们的实验中，注射rhEPO后3天即表现出血清EPO浓度的异常升高，且在4周的注射过程中 ，EPO浓度一直保持相当的高水平，这可能与我们采用皮下注射的方式和血样收集的时间点 有关。Breidbach发现运动对血清EPO浓度无明显影响[6]。结合这 种结果，我们认为，在注射rhEPO期间，检测出血清EPO浓度异常升高的可能性很大；如果未 发现血清EPO浓度的升高，也不能轻易判断其未曾使用rhEPO，需要结合其它指标来判断。
转铁蛋白受体是一个双链糖蛋白膜受体，包含2个95KD的亚单位，存在于所有细胞的表面， 其主要功能是调节细胞外的铁向细胞内的摄入。转铁蛋白受体的表达是通过铁来调节的。当 细胞需要更多的铁时，转铁蛋白受体合成就增加，用以摄取铁；反之，铁的过度伴随着转铁 蛋白受体表达的抑制。铁的主要用处是合成血红蛋白，在成年人中，约有80-90%的转铁蛋白 受体存在于骨髓成红细胞中。在EPO的刺激下，成红细胞将转化为成熟的RBC。前体细胞表面 的转铁蛋白受体，把转铁蛋白携带的铁转运到细胞内的卟啉核去合成血红蛋白。随着RBC的 成熟，一旦血红蛋白分子被合成，细胞就不再需要这些表面受体，其碎片就释放到血液循环 中，这就是转铁蛋白可溶性受体(TfR)。血清中的TfR浓度，间接反映了EPO在RBC生成过程 中的作用[2]。
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对EPO反应的结果是TfR浓度增加。Gareau报道，给血液透析的患者注射50-100IU的rhEPO， 每周3次，可以使血清TfR浓度明显增加[2]。Conconi给正常人注 射30IU/kg体重(约2000IU)的rhEPO，也发现血清TfR浓度明显增加。他认为，给病人使用 较小剂量的rhEPO即可增加血清TfR浓度，那么给运动员使用大剂量的rhEPO将更能引起血清TfR浓度的增加，血清TfR可以作为间接检测rhEPO滥用的指标[1]。
我们的结果表明，注射rhEPO的前3天，血清TfR浓度变化不明显，从第9天开始明显升高。血 清TfR浓度的升高与EPO浓度的升高相比，表现出一定时间的滞后。经过4周的使用rhEPO，停 药后血清TfR浓度在1个星期左右的时间内仍能保持高水平，直到2个星期左右才回复到注射 前的水平。有研究发现，TfR进入血循环落后于网织红细胞[7]。可以假设，如果运动员使用rhEPO，当其参加比赛时，即使血液EPO浓度和网织红细胞计数已 经回到正常水平，TfR浓度仍可能保持在高水平。
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出于兴奋剂检测的实际需要，检测指标应该不被运动所影响，因为样品采集可能会在运动( 比赛)之后进行。Gareau对运动员(包括自行车、冰球和排球等项目)运动前、后的血清Tf R浓度进行测定，结果表明，运动对TfR浓度无明显影响[2]。
分泌EPO的作用是增加循环中的RBC。一方面是刺激骨髓合成RBC，使其数量增加；另一方面 是阻止RBC从血管中泄漏出去，这种作用是靠对凝血系统的调节来实现的。使用EPO能引发纤 维蛋白溶解和/或纤维蛋白原溶解加速，增加TDP的产生。Gareau对尿TDP的测定结果表明： 剧烈运动不影响尿TDP的排泄量；注射rhEPO能增加尿TDP的排泄量，这种变化与肾功能的好 坏无关。在10名被怀疑使用rhEPO的耐力项目运动员比赛后用于兴奋剂检测的尿中发现，他 们的TDP水平明显地高于相同项目的其它运动员，而在随后进行的对其中5名运动员的赛外检 查(没有预先通知)的尿样中发现，他们的TDP水平明显降低[2] 。与Gareau的测定有所不同，我们对血浆TDP含量进行了测定，在rhEPO滥用检测方法研究的 文献中，尚未见类似报道。我们发现，血浆TDP的个体间差异很大，个体内也存在很大的变 异；也并未发现注射rhEPO引起的变化规律。这些结果还需要进行更大样本的深入研究来验 证。
, 百拇医药
免疫学方法(包括放射免疫法、酶标免疫法和时间分辨荧光免疫法等)具有特异性好、灵敏 度高等优点，而且方法简单、省时、方便，适用于对大量样品的检测。特别是对于一些免疫 活性很高的大分子的生物活性物质的检测，更具有其独特的优势。在目前开展的对肽类激素 (包括EPO、GH、hCG和IGF-I等)的检测方法研究中，免疫学方法的运用是非常广泛的。采 用免疫学方法结合传统的兴奋剂检测方法，将把包括rhEPO在内的肽类激素滥用的检测向实 用阶段推进一大步。
4 小结
经过4周的rhEPO皮下注射(30IU/kg体重)，受试者血清EPO和TfR浓度明显升高，而且TfR浓 度在停药后1个星期左右的时间内仍保持在较高的水平。结果提示：血清EPO和TfR有可能作 为rhEPO滥用检测的指标。■
基金项目：本课题为国家体育总局重点项目的部分工作
, 百拇医药
作者简介：方子龙，男，34岁，副研究员
作者单位：张长久(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)
杨天乐(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)
曾凡星(北京体育大学)
参考文献：
[1]Conconi F, et al. Detection of erythropoietin administration in sports.Blood samples in doping control-Second international symposium on drugs in sports, Hemmersbach P & Birkeland KI (eds.),1993,pp133
, http://www.100md.com
[2]Gareau R, et al. A possible approach to erythropoietin doping detection. Blood samples in doping control-Second international symposium on drugs in sports, Hemmersbach P & Birkeland KI (eds.), 1993,pp141
[3]Kicman AT and Cowan DA. Peptide hormone and sports: misuse and detection. Bri Med Bull, 1992,48 (3): 513
[4]Erslev AJ. Erythropoietin. New Eng J Med,1991，324:1339
[5]Salmonson T, et al. The pharmokinetics of recombinant human erythropoietin after intravenous and subcutaneous administration to healthy subjects. Br J Clin Pharmacol, 1990，29:709
, 百拇医药
[6]Breidbach A and Schanzer W. Fast and accurate determination of urinary human erythropoietin with Nichols Institute Diagnostics chemiluminescence immunoa ssay for erythropoietin after gelfiltration. Recent advances in doping analysis (5), Schanzer W (eds.), 1997，pp209
[7]Beguin Y. The soluble transferrin receptor: biological aspects and clin ic usefulness as quantitative measure of erythropoiesis. Haematologia,1993，77: 1
收稿日期：1999-04-02, 百拇医药
单位：方子龙(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；杨树民(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；王小兵(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；王杉(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；秦旸(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；谢敏豪(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；邓静(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)；
关键词：红细胞生成素；兴奋剂检测；转铁蛋白可溶性受体；酶联免疫吸附法
用免疫学方法判断重组人红细胞生成素滥用的研究 摘 要：给6名健康青年男性受试者皮下注射重组人红细胞生成素(rhEPO)，剂量为30IU/kg体重，每周3次，注射持续4周。同时给4名对照受试者注射安慰剂。采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行指标测定。结果表明：注射rhEPO能提高血清EPO浓度和转铁蛋白可溶性受体(TfR)浓度；在停药后1个星期左右的时间内，TfR浓度仍保持在较高的水平；而血浆总纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(TDP)含量未发现规律性的变化。结果提示：血清EPO和TfR浓度有可能作为rhEPO滥用检测的指标。
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Detection of Recombinant Human Erythropoietin Misuse by Immunoassay
Fang Zilong, Yang Shumin, Wang Xiaobing
(National Research Institute of Sports Medicine, Beijing 100029, China)
Abstract：Six healthy young male volunteers were subcutaneously administered by recom binant human erythropoietin (rhEPO) with a dosage of 30IU/kg bodyweight, three times a week for four weeks. Four volunteers as controls were administered by equal placebo. So me biochemical parameters were observed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in this st udy. EPO and transferrin soluble receptor (TfR) concentrations in serum were elevated by the administration of rhEPO. TfR concentration maintained higher level after the ad ministration of rhEPO within one week. Total of fibrinogen degradation products and fibrin degr adation products (TDP) concentrations in plasma changed irregularly. The results sugge sted that serum EPO and TfR concentration might be the validate parameters on the detectio n of rhEPO misuse.
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Key words：erythropoietin, doping detection, transferrin soluble receptor, ELISA▲
应用常规检测兴奋剂的色谱学方法对重组人红细胞生成素(rhEPO)滥用进行检测非常困难，因为EPO是一种分子量很大(大约34KD)的肽类激素。采用免疫学方法对血中EPO和相关指标进行测定是目前普遍开展的研究工作，希望从中筛选出有效的指标，用于实际检测中。依赖于某些内源性指标，间接判定是否使用rhEPO，是目前检测rhEPO滥用的一个现实思路。已有研究证明，rhEPO能增加血清转铁蛋白可溶性受体(TfR)的浓度[1，2]，对凝血系统也会产生影响[2]。我们对普通青年男子注射rhEPO，采用免疫学方法对有关指标进行测定。
1 对象和方法
1.1 实验对象 普通男性志愿者(非运动员)10名，年龄19-23岁，随机 分为两组：对照组(n=4)和实验组(n=6)。经临床体检，所有受试者身体健康，实验期间 从事适量的锻炼和体力劳动。
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1.2 rhEPO注射 (1)实验组：皮下注射rhEPO-β注射剂(Recormon 200 0，德国Boehringer公司)，剂量为30IU/kg体重，每周3次，共注射4周。(2)对照组：与 实验组同时注射等体积的注射用水。所有受试者每天同时口服富马酸铁(200mg，t.i.d. )和叶酸(5mg，t.i.d.)。
1.3 样品收集 于早晨8:00-10:00，采集安静时静脉血，一部分血分离血 清，用于测定EPO和TfR；另一部分加肝素抗凝，分离血浆，用于测定总纤维蛋白和纤维蛋白 原降解产物(TDP)。取血时间为注射前1天、注射后3天、9天、11天，15天、17天、19天、 21天、23天、25天、27天、29天、34天和40天。
1.4 指标测试 血清EPO和TfR浓度用美国R&D Systems公司的酶联免疫吸 附 法(ELISA)检测试剂盒进行测定，血浆TDP含量用美国Microelisa System公司的ELISA法检 测试剂盒进行测定。操作方法按试剂盒说明书进行，测定仪器为美国Bio-Tek 公司的EL-311 型自动微板读数仪。
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1.5 统计处理 数据用平均值±标准差表示，采用SPSS统计软件包进行 单因 素方差分析(ANOVA)，对两组受试者的结果分别进行注射前、后差异的比较；当ANOVA显示 有显著性差异时(p<0.05)，用LSD两两比较法将注射后各点的均值分别与注射前均数进行 比较，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。两组注射前数据用成组T检验法比较。
2 结果
注射前，实验组和对照组的血清EPO浓度分别为4.91±3.86mIU/mL和5.21±1.47mIU/mL ，二者之间无明显差异。由于血清EPO的半衰期很短，我们仅对给药期间的EPO浓度进行测定 。注射后，实验组的EPO浓度升高，在第3天、11天、17天、21天、23天、25天和27天均明显 高于注射前。对照组的EPO浓度变化不明显(图1)。
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图1 rhEPO对血清EPO浓度的影响
Figure 1 Effect of rhEPO on serum EPO leve l
与注射前相比，*p<0.05，**p<0.01
注射前，实验组和对照组的TfR浓度分别为3.27±0.48μg/mL和 3.22±0.20μg/mL， 二者之间 无明显差异。注射后，实验组的TfR浓度升高，在给药期间的第9天、11天，15天、19天、23 天、25天、27天均明显高于注射前；在停药后2天(第29天)和7天(第34天)仍维持在较高 的水平，到13天(第40天)才降低到注射前的水平。对照组的TfR浓度变化不明显(图2)。
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图2 rhEPO对血清TfR浓度的影响
Figure 2 Effect of rhEPO on serum TfR leve l
与注射前相比*p<0.05，**p<0.01
血浆TDP含量的个体间差异很大，个体内也存在很大的变异；未发现注射rhEPO引起TDP发生 有规律性的变化(图3)。
图3 rhEPO对血浆TDP含量的影响
Figure 3 Effect of rhEPO on plasma TDP lev el
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3 讨论
内源性EPO是一种含有166个氨基酸的单链酸性糖蛋白，分子量约为34KD。根据其含糖量的不 同，可分为EPOα(含31%的糖)和EPOβ(含24%的糖)。采用DNA 重组技术生产的EPO也有E POα和EPOβ两种形式。EPOα和EPOβ具有相似的生物活性和抗原属性[3] 。
注射rhEPO最直接的变化就是血清EPO浓度的升高，但是单独测定血清EPO的浓度难以判定是 否使用了外源性rhEPO。因为正常人的血清EPO浓度的变化范围可以很大，可超过10倍，尽管 他们的红细胞(RBC)计数可能近似。EPO的分泌还表现出一定的昼夜节律，在半夜时血清EP O浓度最高。一般情况下，血清EPO浓度变化范围不超过其平均值的20%[4] 。EPO在血中的半衰期很短，因注射方式不同而有所差别。静脉注射和皮下注射rhE PO后，其平均半衰期分别为4.5小时和25小时，且依剂量不同而变化[5] 。多次给药，半衰期会缩短。以治疗剂量(80IU/kg体重)静脉注射，血清EPO浓度可 在24小时之内表现异常；以皮下注射，血清EPO峰值在5-24小时内出现，4天后回到正常水 平。EPO发挥作用的时间较晚(大约3天作用)，如果是为了提高运动能力而使用rhEPO，当血氧分压达到使运动员满意的时候，注射的rhEPO可能已经被机体代谢清除了 [2]。
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在我们的实验中，注射rhEPO后3天即表现出血清EPO浓度的异常升高，且在4周的注射过程中 ，EPO浓度一直保持相当的高水平，这可能与我们采用皮下注射的方式和血样收集的时间点 有关。Breidbach发现运动对血清EPO浓度无明显影响[6]。结合这 种结果，我们认为，在注射rhEPO期间，检测出血清EPO浓度异常升高的可能性很大；如果未 发现血清EPO浓度的升高，也不能轻易判断其未曾使用rhEPO，需要结合其它指标来判断。
转铁蛋白受体是一个双链糖蛋白膜受体，包含2个95KD的亚单位，存在于所有细胞的表面， 其主要功能是调节细胞外的铁向细胞内的摄入。转铁蛋白受体的表达是通过铁来调节的。当 细胞需要更多的铁时，转铁蛋白受体合成就增加，用以摄取铁；反之，铁的过度伴随着转铁 蛋白受体表达的抑制。铁的主要用处是合成血红蛋白，在成年人中，约有80-90%的转铁蛋白 受体存在于骨髓成红细胞中。在EPO的刺激下，成红细胞将转化为成熟的RBC。前体细胞表面 的转铁蛋白受体，把转铁蛋白携带的铁转运到细胞内的卟啉核去合成血红蛋白。随着RBC的 成熟，一旦血红蛋白分子被合成，细胞就不再需要这些表面受体，其碎片就释放到血液循环 中，这就是转铁蛋白可溶性受体(TfR)。血清中的TfR浓度，间接反映了EPO在RBC生成过程 中的作用[2]。
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对EPO反应的结果是TfR浓度增加。Gareau报道，给血液透析的患者注射50-100IU的rhEPO， 每周3次，可以使血清TfR浓度明显增加[2]。Conconi给正常人注 射30IU/kg体重(约2000IU)的rhEPO，也发现血清TfR浓度明显增加。他认为，给病人使用 较小剂量的rhEPO即可增加血清TfR浓度，那么给运动员使用大剂量的rhEPO将更能引起血清TfR浓度的增加，血清TfR可以作为间接检测rhEPO滥用的指标[1]。
我们的结果表明，注射rhEPO的前3天，血清TfR浓度变化不明显，从第9天开始明显升高。血 清TfR浓度的升高与EPO浓度的升高相比，表现出一定时间的滞后。经过4周的使用rhEPO，停 药后血清TfR浓度在1个星期左右的时间内仍能保持高水平，直到2个星期左右才回复到注射 前的水平。有研究发现，TfR进入血循环落后于网织红细胞[7]。可以假设，如果运动员使用rhEPO，当其参加比赛时，即使血液EPO浓度和网织红细胞计数已 经回到正常水平，TfR浓度仍可能保持在高水平。
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出于兴奋剂检测的实际需要，检测指标应该不被运动所影响，因为样品采集可能会在运动( 比赛)之后进行。Gareau对运动员(包括自行车、冰球和排球等项目)运动前、后的血清Tf R浓度进行测定，结果表明，运动对TfR浓度无明显影响[2]。
分泌EPO的作用是增加循环中的RBC。一方面是刺激骨髓合成RBC，使其数量增加；另一方面 是阻止RBC从血管中泄漏出去，这种作用是靠对凝血系统的调节来实现的。使用EPO能引发纤 维蛋白溶解和/或纤维蛋白原溶解加速，增加TDP的产生。Gareau对尿TDP的测定结果表明： 剧烈运动不影响尿TDP的排泄量；注射rhEPO能增加尿TDP的排泄量，这种变化与肾功能的好 坏无关。在10名被怀疑使用rhEPO的耐力项目运动员比赛后用于兴奋剂检测的尿中发现，他 们的TDP水平明显地高于相同项目的其它运动员，而在随后进行的对其中5名运动员的赛外检 查(没有预先通知)的尿样中发现，他们的TDP水平明显降低[2] 。与Gareau的测定有所不同，我们对血浆TDP含量进行了测定，在rhEPO滥用检测方法研究的 文献中，尚未见类似报道。我们发现，血浆TDP的个体间差异很大，个体内也存在很大的变 异；也并未发现注射rhEPO引起的变化规律。这些结果还需要进行更大样本的深入研究来验 证。
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免疫学方法(包括放射免疫法、酶标免疫法和时间分辨荧光免疫法等)具有特异性好、灵敏 度高等优点，而且方法简单、省时、方便，适用于对大量样品的检测。特别是对于一些免疫 活性很高的大分子的生物活性物质的检测，更具有其独特的优势。在目前开展的对肽类激素 (包括EPO、GH、hCG和IGF-I等)的检测方法研究中，免疫学方法的运用是非常广泛的。采 用免疫学方法结合传统的兴奋剂检测方法，将把包括rhEPO在内的肽类激素滥用的检测向实 用阶段推进一大步。
4 小结
经过4周的rhEPO皮下注射(30IU/kg体重)，受试者血清EPO和TfR浓度明显升高，而且TfR浓 度在停药后1个星期左右的时间内仍保持在较高的水平。结果提示：血清EPO和TfR有可能作 为rhEPO滥用检测的指标。■
基金项目：本课题为国家体育总局重点项目的部分工作
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作者简介：方子龙，男，34岁，副研究员
作者单位：张长久(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)
杨天乐(国家体育总局运动医学研究所 北京 100029)
曾凡星(北京体育大学)
参考文献：
[1]Conconi F, et al. Detection of erythropoietin administration in sports.Blood samples in doping control-Second international symposium on drugs in sports, Hemmersbach P & Birkeland KI (eds.),1993,pp133
, http://www.100md.com
[2]Gareau R, et al. A possible approach to erythropoietin doping detection. Blood samples in doping control-Second international symposium on drugs in sports, Hemmersbach P & Birkeland KI (eds.), 1993,pp141
[3]Kicman AT and Cowan DA. Peptide hormone and sports: misuse and detection. Bri Med Bull, 1992,48 (3): 513
[4]Erslev AJ. Erythropoietin. New Eng J Med,1991，324:1339
[5]Salmonson T, et al. The pharmokinetics of recombinant human erythropoietin after intravenous and subcutaneous administration to healthy subjects. Br J Clin Pharmacol, 1990，29:709
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收稿日期：1999-04-02, 百拇医药