Smad1在人牙胚发育过程中的表达变化
作者：何文喜 牛忠英 陈健 包柳郁
单位：何文喜(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；牛忠英(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；陈健(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；包柳郁(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：Smad1；牙胚发育；免疫组织化学
牙体牙髓牙周病学杂志000209 【摘 要】 目的: 观察骨形成蛋白特异的细胞内信 号转导分子Smad1在人牙胚发育过程中的表达变化，探讨Smad1在牙齿发育过程中的 作用。方法：制备人牙胚发育各期标本，免疫组化方法观察Smad1在人牙 胚发 育过程中的表达情况。结果：Smad1在牙胚发育的不同时期均可 见不 同的时空表达模式。结论：观察到Smad1信号分子在人牙胚发 育过程中的表达，Smad1可能在牙胚各期的发育起一定的作用。
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【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)02-0078-03
The expression of Smad1 in human tooth germ development
HE Wen-xi，NIU Zhong-ying, CHEN Jian，et al
(School of Stomatology, The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
【Abstact】 AIM: To investigate the expression of Sma d1 rotein in tooth germ development, to explore the function of Smad1 dur ing too th germ development. METHODS: Using immunohistochemical st aining after preparing specimens of every stage of human developing tooth germ. RESULTS: Smad1 had its own specific temporal-spat ial pattern during tooth germ development. CONCLUSION:The expression of Smad1 gene in tooth germ development was detected. It suggest s that Smad1 may play a role in tooth germ development.
, 百拇医药
【Key words】 Smad1; tooth germ development; immunohis tochemistry
骨形成蛋白(BMPs)属于TGF-β超家族，在牙胚发育中发挥重要的 调控作用。文献[1～5]表明，BMPs在牙胚的发生、成牙本质细胞的分化、第三 期牙本质的形成均发挥重要的作用。Smad1是最近发现的BMPs细胞内信号转导分子 [6] ,BMPs受体在牙胚发育和成牙本质细胞分化的作用已有文献报道[7] 。但对于BMP 受体下游的信号分子在牙齿发育中的作用，文献报道甚少。本实验通过连续的人牙 胚切片，观察Smad1的表达变化，探讨Smad1在牙胚发育过程中的作用和意 义。
1 材料和方法
1.1 标本来源
取4例合法引产的约4～6月龄胎儿，截取上、下颌骨，40g/L 多聚甲醛液(pH7.3，?0.1mol/ L PBS )颈动脉灌注固定，4℃下100g/L EDTA脱钙1月，常规方法脱水，石蜡包埋，制备5μm厚的 连续石蜡切片，免疫组化染色。
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1.2 免疫组化主要试剂
Smad1多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.进口原装)。ABC试剂盒和DAB试剂 盒(武汉博士德公司)。
1.3 免疫组化染色
采用ABC法，切片脱蜡至水，3ml/L H2O2室温下10min以消除内源性过氧化物酶，1g/L胰 蛋白酶消化，正常羊血清孵育30min，滴加羊抗人Smad1抗体(1：200)，4℃湿盒过夜 ，3 7℃复温1h，滴加生物素化二抗,37℃孵育30min，滴加酶结合物,37℃孵育30min，DAB显微镜 下控制显色5～10min。上述各步之后均用0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min。用大鼠颌骨组 织切片作为阳性对照,用0.01mol/L PBS缓冲液代替一抗染色的切片作阴性对照, 苏木精复染 ，常规脱水,二甲苯透明,封片。
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2 结果
蕾状期：Smad1在牙板和成釉器为阳性表达(图1)。帽状期：Smad1在成釉器内 釉上皮 细胞呈强阳性表达，外釉上皮星网状层细胞阴性表达，牙囊、牙乳头弱阳性表达(图2)。 钟状早期：内釉上皮Smad1强阳性表达、中间层细胞阳性表达，牙乳头弱阳性表达(图3 )。钟状晚期：Smad1在成釉细胞、成牙本质细胞为强阳性表达，牙乳头细胞为阳性表 达，其它细胞呈阴性(图4)。
图1 蕾状期：Smad1阳性表达细胞主要位于牙板上皮和成釉器，邻近间充质细胞为弱阳 性表达 (40×)
图2 帽状期：成釉器内釉上皮细胞可见Smad1呈强阳性表达，牙囊、牙乳头为弱阳性表 达 (40×)
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图3 钟状早期：内釉上皮细胞Smad1可见强阳性表达，中间层细胞阳性表达， 牙乳头弱阳性表达 (40×)
图4 钟状晚期：成釉细胞、成牙本质细胞Smad1为强阳性表达，牙乳头细胞为阳性表达 (40×)
3 讨论
在牙胚发育过程中，上皮-间充质之间的相互作用调控其形态的发生和细胞的分化。文献 [1～5]表明，BMPs在牙胚发育过程中发挥重要的作用。Vainio 等[3]研究鼠 牙胚发育各期BMP2、BMP4的时空分布模式，认为BMP2、BMP4很可能是决定牙胚间充质细胞 发育方向的上皮-间充质相互作用中的信号诱导分子。Heikinheimo等[4]研究发现B MP6早期表达于牙上皮，以后主要表达在前期成牙本质细胞和成牙本质细胞，BMP5表达较晚 ，且仅出现于成釉细胞。Helder等[5]发现在帽状期和钟状早期内釉上皮可见大量 的BMP7表达，牙胚各期未见BMP3的表达，牙囊可见大量的BMP3表达。
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BMPs在牙胚发育和成牙本质细胞分化中的作用是BMPs和细胞表面的BMPs受体结合后，将信号 传导至核内，调节相应的基因表达，促进细胞的分化。与BMPs信号传导有关的受体是BMPs的 Ⅰ、Ⅱ型受体。BMPs同时与Ⅰ、Ⅱ型受体结合，在此过程中，Ⅱ型受体使Ⅰ型受体活化 ，活化的Ⅰ型受体再作用于下游分子，将信号传导至核内[7,8]。Hoodless等(1996 )[6]克隆成功Smad1，功能研究证实，Smad1是BMP受体下游的信号分子。 关 于Smad1在牙胚中的时空分布研究，国内外未见报道。本实验结果表明，蕾状期牙板和 成釉器上皮均 可见Smad1阳性表达，而邻近的间充质细胞则为弱阳性表达；帽状期和钟状早期Smad 1主要分 布于内釉上皮，牙乳头细胞分布较少；钟状晚期，即硬组织形成期，牙乳头细胞Smad1 表达 增加，特别是成牙本质细胞和成釉细胞Smad1表达显著增强。Smad1在牙胚各期的分 布表明： 在牙齿发育早期，Smad1可能参与早期的上皮-间充质相互作用的信号诱导，这与BMP2和 BMP 4的功能较相似；随着牙胚的发育，Smad1在牙乳头间充质表达逐渐增加，特别是成牙本 质细胞和成釉细胞，这与BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7的分布有相似之处。
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总之，本研究结果显示Smad1在牙胚各期的发育中呈一定的时空分布，表明Smad1可 能在牙齿发育中起一定的作用。
国家自然科学基金资助项目(39870789)
【参考文献】
[1] Ruch JV, Lesot H, Begue-kirn C. Odontoblast differentiation. Int J Dev Biol,1995,39:51
[2] Thesleff I, Vaahtokari A, Kettunen P, et al. Epithelial-mesen chymal signaling during tooth development. Connect Tissue Res, 1995,32:9
[3] Vainio S,Karavanova I,Jowett A, et al.Identification of BMP-4 as a signal mediating secondary induction between epithelial and mesenchymal ti ssues during tooth development.Cell,1993;75(1):45
, 百拇医药
[4] Heikinheimo K.Stage-specific expression of decapentaplegic-Vg-rel ated genes 2,4,and 6(bone morphogenetic proteins 2,4,and 6)during human tooth mo rph ogenesis.J Dent Res,1994,73(3):590
[5] Helder MN,Ozkaynak E,Sampath KT,et al.Expression pattern of o steogenic protein-1(bone morphogentic protein-7) in human and mouse development. J Histochem Cytochem,1995，43:1035
[6] Hoodless P,Haery T,Abdolloh S,et al.MADR1,A Mad-related prote in that functions in BMP signaling pathway.Cell,1996,85(3);489
, 百拇医药
[7] Kawabata M,Imamura T,Miyazono K,et al.Activin and bone morpho genetic protein(BMP) signaling during tooth development.Eur J Oral Sci,1998,106( suppl 1):167
[8] Heldin CH, Miyazono K, Dijke PT. TGF-β signaling from c ell membrane to nucleus through Smad proteins.Nature,1997,390(4):465
1999-11-19, 百拇医药
单位：何文喜(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；牛忠英(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；陈健(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；包柳郁(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：Smad1；牙胚发育；免疫组织化学
牙体牙髓牙周病学杂志000209 【摘 要】 目的: 观察骨形成蛋白特异的细胞内信 号转导分子Smad1在人牙胚发育过程中的表达变化，探讨Smad1在牙齿发育过程中的 作用。方法：制备人牙胚发育各期标本，免疫组化方法观察Smad1在人牙 胚发 育过程中的表达情况。结果：Smad1在牙胚发育的不同时期均可 见不 同的时空表达模式。结论：观察到Smad1信号分子在人牙胚发 育过程中的表达，Smad1可能在牙胚各期的发育起一定的作用。
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【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)02-0078-03
The expression of Smad1 in human tooth germ development
HE Wen-xi，NIU Zhong-ying, CHEN Jian，et al
(School of Stomatology, The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
【Abstact】 AIM: To investigate the expression of Sma d1 rotein in tooth germ development, to explore the function of Smad1 dur ing too th germ development. METHODS: Using immunohistochemical st aining after preparing specimens of every stage of human developing tooth germ. RESULTS: Smad1 had its own specific temporal-spat ial pattern during tooth germ development. CONCLUSION:The expression of Smad1 gene in tooth germ development was detected. It suggest s that Smad1 may play a role in tooth germ development.
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【Key words】 Smad1; tooth germ development; immunohis tochemistry
骨形成蛋白(BMPs)属于TGF-β超家族，在牙胚发育中发挥重要的 调控作用。文献[1～5]表明，BMPs在牙胚的发生、成牙本质细胞的分化、第三 期牙本质的形成均发挥重要的作用。Smad1是最近发现的BMPs细胞内信号转导分子 [6] ,BMPs受体在牙胚发育和成牙本质细胞分化的作用已有文献报道[7] 。但对于BMP 受体下游的信号分子在牙齿发育中的作用，文献报道甚少。本实验通过连续的人牙 胚切片，观察Smad1的表达变化，探讨Smad1在牙胚发育过程中的作用和意 义。
1 材料和方法
1.1 标本来源
取4例合法引产的约4～6月龄胎儿，截取上、下颌骨，40g/L 多聚甲醛液(pH7.3，?0.1mol/ L PBS )颈动脉灌注固定，4℃下100g/L EDTA脱钙1月，常规方法脱水，石蜡包埋，制备5μm厚的 连续石蜡切片，免疫组化染色。
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1.2 免疫组化主要试剂
Smad1多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.进口原装)。ABC试剂盒和DAB试剂 盒(武汉博士德公司)。
1.3 免疫组化染色
采用ABC法，切片脱蜡至水，3ml/L H2O2室温下10min以消除内源性过氧化物酶，1g/L胰 蛋白酶消化，正常羊血清孵育30min，滴加羊抗人Smad1抗体(1：200)，4℃湿盒过夜 ，3 7℃复温1h，滴加生物素化二抗,37℃孵育30min，滴加酶结合物,37℃孵育30min，DAB显微镜 下控制显色5～10min。上述各步之后均用0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min。用大鼠颌骨组 织切片作为阳性对照,用0.01mol/L PBS缓冲液代替一抗染色的切片作阴性对照, 苏木精复染 ，常规脱水,二甲苯透明,封片。
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2 结果
蕾状期：Smad1在牙板和成釉器为阳性表达(图1)。帽状期：Smad1在成釉器内 釉上皮 细胞呈强阳性表达，外釉上皮星网状层细胞阴性表达，牙囊、牙乳头弱阳性表达(图2)。 钟状早期：内釉上皮Smad1强阳性表达、中间层细胞阳性表达，牙乳头弱阳性表达(图3 )。钟状晚期：Smad1在成釉细胞、成牙本质细胞为强阳性表达，牙乳头细胞为阳性表 达，其它细胞呈阴性(图4)。
图1 蕾状期：Smad1阳性表达细胞主要位于牙板上皮和成釉器，邻近间充质细胞为弱阳 性表达 (40×)
图2 帽状期：成釉器内釉上皮细胞可见Smad1呈强阳性表达，牙囊、牙乳头为弱阳性表 达 (40×)
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图3 钟状早期：内釉上皮细胞Smad1可见强阳性表达，中间层细胞阳性表达， 牙乳头弱阳性表达 (40×)
图4 钟状晚期：成釉细胞、成牙本质细胞Smad1为强阳性表达，牙乳头细胞为阳性表达 (40×)
3 讨论
在牙胚发育过程中，上皮-间充质之间的相互作用调控其形态的发生和细胞的分化。文献 [1～5]表明，BMPs在牙胚发育过程中发挥重要的作用。Vainio 等[3]研究鼠 牙胚发育各期BMP2、BMP4的时空分布模式，认为BMP2、BMP4很可能是决定牙胚间充质细胞 发育方向的上皮-间充质相互作用中的信号诱导分子。Heikinheimo等[4]研究发现B MP6早期表达于牙上皮，以后主要表达在前期成牙本质细胞和成牙本质细胞，BMP5表达较晚 ，且仅出现于成釉细胞。Helder等[5]发现在帽状期和钟状早期内釉上皮可见大量 的BMP7表达，牙胚各期未见BMP3的表达，牙囊可见大量的BMP3表达。
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BMPs在牙胚发育和成牙本质细胞分化中的作用是BMPs和细胞表面的BMPs受体结合后，将信号 传导至核内，调节相应的基因表达，促进细胞的分化。与BMPs信号传导有关的受体是BMPs的 Ⅰ、Ⅱ型受体。BMPs同时与Ⅰ、Ⅱ型受体结合，在此过程中，Ⅱ型受体使Ⅰ型受体活化 ，活化的Ⅰ型受体再作用于下游分子，将信号传导至核内[7,8]。Hoodless等(1996 )[6]克隆成功Smad1，功能研究证实，Smad1是BMP受体下游的信号分子。 关 于Smad1在牙胚中的时空分布研究，国内外未见报道。本实验结果表明，蕾状期牙板和 成釉器上皮均 可见Smad1阳性表达，而邻近的间充质细胞则为弱阳性表达；帽状期和钟状早期Smad 1主要分 布于内釉上皮，牙乳头细胞分布较少；钟状晚期，即硬组织形成期，牙乳头细胞Smad1 表达 增加，特别是成牙本质细胞和成釉细胞Smad1表达显著增强。Smad1在牙胚各期的分 布表明： 在牙齿发育早期，Smad1可能参与早期的上皮-间充质相互作用的信号诱导，这与BMP2和 BMP 4的功能较相似；随着牙胚的发育，Smad1在牙乳头间充质表达逐渐增加，特别是成牙本 质细胞和成釉细胞，这与BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7的分布有相似之处。
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总之，本研究结果显示Smad1在牙胚各期的发育中呈一定的时空分布，表明Smad1可 能在牙齿发育中起一定的作用。
国家自然科学基金资助项目(39870789)
【参考文献】
[1] Ruch JV, Lesot H, Begue-kirn C. Odontoblast differentiation. Int J Dev Biol,1995,39:51
[2] Thesleff I, Vaahtokari A, Kettunen P, et al. Epithelial-mesen chymal signaling during tooth development. Connect Tissue Res, 1995,32:9
[3] Vainio S,Karavanova I,Jowett A, et al.Identification of BMP-4 as a signal mediating secondary induction between epithelial and mesenchymal ti ssues during tooth development.Cell,1993;75(1):45
, 百拇医药
[4] Heikinheimo K.Stage-specific expression of decapentaplegic-Vg-rel ated genes 2,4,and 6(bone morphogenetic proteins 2,4,and 6)during human tooth mo rph ogenesis.J Dent Res,1994,73(3):590
[5] Helder MN,Ozkaynak E,Sampath KT,et al.Expression pattern of o steogenic protein-1(bone morphogentic protein-7) in human and mouse development. J Histochem Cytochem,1995，43:1035
[6] Hoodless P,Haery T,Abdolloh S,et al.MADR1,A Mad-related prote in that functions in BMP signaling pathway.Cell,1996,85(3);489
, 百拇医药
[7] Kawabata M,Imamura T,Miyazono K,et al.Activin and bone morpho genetic protein(BMP) signaling during tooth development.Eur J Oral Sci,1998,106( suppl 1):167
[8] Heldin CH, Miyazono K, Dijke PT. TGF-β signaling from c ell membrane to nucleus through Smad proteins.Nature,1997,390(4):465
1999-11-19, 百拇医药