蝎毒对癫痫大鼠海马内强啡肽原mRNA表达的影响
作者：姜春玲 张万琴
单位：大连医科大学生理教研室，大连 116027
关键词：东亚钳蝎粗毒；抗癫痫反复发作；红藻氨酸；海马；强啡；肽原mRNA
中国应用生理学杂志000119摘要 目的和方法：本工作用红藻氨酸癫痫模型，通过对癫痫大鼠蝎毒处理后海马内强 啡肽原mRNA(PDYN mRNA)表达的原位杂交观察，对国产东亚钳蝎粗毒抗癫痫反复发作 的细胞分子机制进行初步探讨。结果：原位杂交的实验显示，三周KA后，实 验对照组与空白对照组相比，腹侧海马尤其是海马门区PDYN mRNA阳性神经元数目明显减少( P<0.01)；实验给药组大鼠8例，其中有6例腹侧海马门区PDYN mRNA阳性神经元数目未 见减少且有明显增加，显著高于实验对照组(P<0.01)和空白对照组(P<0.01)； 各组大鼠背侧海马门区PDYN mRNA表达的变化与腹侧海马相似。结论：蝎毒 能选择性地增加癫痫敏感大鼠海马PDYN mRNA的表达。提示此效应很可能是蝎毒抗癫痫反复 发作的重要的细胞分子机制之一。
, 百拇医药
中图分类号： R338 文献标识码：A 文章编 号：1000-6834(2000)01-0072-03
EFFECT OF SCORPION VENOM ON THE EXPRESSION OF PDYN mRNA IN HIPPOCAMPUS OF EPILEPTIC RATS
JIANG Chun-ling, ZHANG Wan-qin
(Department of Physiology, Dalian Medical University, Dalian 116027)
ABSTRACT
Aim and Methods: In the present study, the effect of scorpion venom (SV) on the expression of PDYN mRNA in the ventral hippocampus of epileptic rats and its cellular and molecular mechanisms investigated, after SV or normal saline (NS) administrated for three weeks. Results: In situ hybridization showed that the number of PDYN mRNA positive neurons was markedly decreased in the ventral hippocampus, especially in hilus of KA+NS group as comp ared with NS+NS group. However, in SV treated group for three weeks the number o f PDYN mRNA positive neurons was significantly increased than that of KA+NS grou p and the NS+NS group. And the change of PDYN mRNA expression in the dorsal hipp ocampus of all the four groups was similar to the ventral part. Conclusio n:SV may selectively increase the expression of PDYN mRNA in the hippocamp us of epileptic susceptible rats. We postulate that this effect may be one of th e important antiepileptic susceptibility cellular and molecular mechanisms of S V.
, 百拇医药
KEY WORDS: scorpion venom; antiepileptic suscepti bility; kainic acid; hippocampus; PDYN mRNA
已报告癫痫大鼠强啡肽原(Prodynorphin,PDYN) mRNA长期持续低表达[1，2]， 提示癫痫发作的敏感性的形成可能与PDYN mRNA表达水平的长期持续性降低有关。我们新近 的工作证实蝎毒具有明显的抗癫痫反复发作的作用，能抑制一次急性癫痫发作后海马内星形 胶质细胞的增生，减轻神经元受损的程度[3]。但有关蝎毒抗癫痫反复发作的阿片 肽机制迄今尚未见报告。本工作用红藻氨酸(kainic acid，KA)癫痫模型报道东亚钳蝎(Buth us Martensii Karsch，BMK)粗毒增加癫痫大鼠海马内PDYN mRNA表达的原位杂交观察结果， 旨在分子水平上探讨蝎毒抗癫痫作用的可能的阿片肽机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验分组和脑片制备
选用健康雄性SD大鼠(体重180～220g)，自由进食饮水，自然昼夜。一次性颈部皮下注 射惊厥剂量的红藻氨酸(10 mg/kg)，诱发大鼠出现急性癫痫发作。癫痫发作行为的严重程度 按Racine所描述的1～5级标准进行观察记录。选用癫痫发作级别在4级以上的大鼠16只随机 均分成两组，即实验给药组(KA+SV)和实验对照组(KA+NS)。分别用2 ml BMK蝎毒(SV，0.04 %)和相同体积的生理盐水(NS)灌胃，每日一次，连续三周。另选用12只大鼠随机分成两组， 颈部皮下注射生理盐水(0.2 ml/100g)后，用相同剂量的蝎毒或生理盐水灌胃做为空白给 药组(NS+SV)和空白对照组(NS+NS)。三周后用4%水合氯醛(400 mg/kg，i.p)麻醉；依次用0 .01 mol/L PBS，4%多聚甲醛+1.25%戊二醛/0.01 mol/L PBS经心脏灌流；取脑； 4% 多聚甲醛后固定；再置入含15%蔗糖的磷酸盐缓冲液中。用XY-86型振动切片机切取20 μm 厚海马冠状脑片。
, 百拇医药
1.2 原位杂交实验
1.2.1 探针标记 用与大鼠强啡肽原有互补序列的33mer的寡核苷酸直接 与信号酶(碱性磷酸酶)相联接。
1.2.2 杂交 各组动物的海马脑片在杂交液(杂交缓冲液+探针，26 ng 探针/ml杂交缓冲液)42℃下孵育过夜，用2xSSC于42℃下漂洗15 min；用1xSSC室温下漂洗 脑片10 min x 2。
1.2.3 免疫检测 分别用缓冲液I(mol/L) Tris-HCl 0.1、NaCl 0.15、p H7.5)和缓冲液Ⅱ(mol/L)Tris-HCl 0.1、NaCl 0.1、MgCl20.25、pH 9.5)室温下振动 漂洗脑片2 min，用显色剂(NBT+X-磷酸盐)显色，甘油明胶封片，光镜下观察并摄片。
1.3 形态学的图像分析扫描
, 百拇医药
用LEICA Q500MC图像分析仪(德国)进行海马脑片细胞计数。选实验对照组、实验给药 组、空白对照组和空白给药组大鼠各6只，每个动物测3张脑片。脑片的选定部位按George P axinos ＆ Charles Watson的大鼠脑图谱确定[4]，前囟后5.80 mm即海马结构所 在部位。先在10×物镜下观察脑片，选取腹侧海马门部位；然后在荧光屏上画出测量框的轮 廓，测量框面积为61557 μm[2]，宽度(W)和高度(H)分别为213 μm、289 μm ，计算测量框内PDYN mRNA阳性神经元的个数。每个动物的3张脑片数值相加后取平均值。
1.4 统计学处理
实验数据用均数±标准误(
±S)表示，并输入计算机进行统 计学处理。四组先进行方差分析，求得F值，然后每两组之间再用q检验进行比较。
, 百拇医药
2 结果
2.1 海马部位原位杂交检测PDYN mRNA阳性神经元的变化
原位杂交的检测结果显示，空白对照组(NS+NS)大鼠的PDYN mRNA阳性神经元散在分布 于腹侧海马门区(图1，1C)。与NS+NS组相比，KA后三周实验对照组(KA+NS)大鼠的腹侧海 马门区PDYN mRNA阳性神经元数目明显减少，几乎完全消失(图1，1A)(表1，P<0.01 )。实验给药组(KA+SV)大鼠(图1，1B)，8例中有的6例腹侧海马门区PDYN mRNA阳性神经元 数目不仅未见减少而且明显增加，高于KA+NS组(表1，P<0.01)和NS+NS组(表1， P<0.01)，与NS+SV组相比无显著差异(表1，P<0.05)。
空白给药组(NS+SV)大鼠，与NS+NS组相比，腹侧海马齿状回PDYN mRNA阳性神经元数目 明显增加，以海马门区密度最高，呈均匀分布(图1，1D)(表1，P<0.01)。各组大鼠背 侧海马PDYN mRNA表达的变化与腹侧海马相似。
, 百拇医药
结果表明KA后三周，腹侧海马门部位表达PDYN mRNA的中间神经元明显脱失。BMK蝎毒能 选择性防止其脱失，并使PDYN mRNA的表达增加；同时也使空白给药组大鼠腹侧海马门部位PDYN mRNA的表达增加。
Fig.1 PDYN mRNA positive neuro ns in the ventral hippocampus of epileptic rats treated with scorpion venom for three weeks(A.B.C.D NBT staining,×50)
3 讨论
强啡肽(dynorphin，DYN)是中枢神经系统内的一个重要阿片肽，它在调节脑的兴奋性尤 其是癫痫相关脑区一海马结构的兴奋性方面起重要作用。己证实强啡肽在边缘系统各部分高 表达，尤其是在海马的齿状回[5]；强啡肽能激活kappa型阿片受体，通过多突触机 制抑制穿通通路和苔状纤维内兴奋性氨基酸的释放，具有明显的抗惊厥作用，是内源性阿片 肽[6，7]。
, 百拇医药
Tab.1 Quantitative analysis of PDYN mRNA pos itive neurons in the ventral hippocampus of epileptic rats treated with scorpion venom for three weeks (±s) Group
No. of animals
No. of cells
NS+NS
6
21.8±0.95
NS+SV
, 百拇医药 6
33.2±1.01* *
KA+NS
6
4.8+0.48* *
KA+SV
6
35.8±2.02* *##
* * P<0.01, vs NS+NS group; ## P<0.01, vs KA+NS group
己报告癫痫大鼠PDYN mRNA长期持续低表达[1，2]；我们新近的工作证实蝎毒 具有明显的抗癫痫反复发作(epileptic seizure)的作用[3]，但有关蝎毒对癫痫大 鼠海马内PDYN mRNA的表达的影响迄今尚未见报告。本工作发现KA后三周，癫痫大鼠腹侧海 马门区PDYN mRNA阳性神经元数目明显减少，表明癫痫发作后腹侧海马门区PDYN mRNA的表达 水平明显降低，这与前人的报告相一致。但我们还进一步观察到BMK蝎毒能选择性地增加正 常大鼠腹侧海马门区PDYN mRNA的表达，提示蝎毒能加强生理性抗癫痫作用；癫痫大鼠经BM K蝎毒处置后，腹侧海马门区PDYN mRNA阳性神经元数目明显增加，表明蝎毒能翻转(reverse )腹侧海马门区PDYN mRNA的表达水平，选择性地增强海马门区DYN能抑制性中间神经元的 功能。推测这很可能是其抗癫痫反复发作的重要的细胞分子机制之一。
, 百拇医药
有报告用反义核酸技术封阻癫痫大鼠c-fos mRNA，降低Fos的水平后，PDYN mRNA的 表达降低60%；进一步的研究表明Fos作用于PDYN基因的AP-1位点，调节海马内的PDYN mRNA的表达[1]。我们的实验也证实蝎毒能提高癫痫大鼠腹侧海马门区的Fos蛋白的 水平(待发表资料)。据此，我们推断BMK蝎毒增加腹侧海马门区PDYN mRNA的表达，可能是通 过提高Fos蛋白的水平来实现的。至于其详尽的作用途径还有待于进一步的研究。
作者简介：姜春玲(1963-)，女，大连市人，副教授，硕士学位， 博士研究生，从事蝎毒抗癫痫作用的细胞分子机制研究
参考文献
[1] Ziolkowska B，Przewlocka B，MikaJ，et al.Evidence for Fos invo lvement in the regulation of proenkephalin and prodynorphin gene expression in the rat hippocampus[J].Mol Brain Res,1998，54：243-251.
, http://www.100md.com
[2] 张万琴，高 溪，李冬冬，等.海人酸诱发癫痫反复发作的分子机制[J].中国生理 学会第20届全国代表大会暨学术会议论文摘要汇编，1998(增刊1)，17(1)：69-70.
[3] 姜春玲，张 健，郎明非，等.蝎毒对癫痫敏感性和海马GFAP释放的影响[J].中 国应用生理学杂志，1999，15(3)：234-237.
[4] Paxions G.Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates[M].2nd ed .San Diego: Academic Press.1986.
[5] Simonato M，RomualdiP.Dynorphin and epilepsy[J].Prog Neurobiol，19 96，50：557-583.
[6] Simmons M L，CharkinC.Endogenous opioid regulation of hippocampal funct ion[J].Int Rev Neurobiol，1996，39：145-196.
[7] Hong J S，McGinty J F，Lee P H K，et al.Relationship between hippocam pal opioid peptides and seizures[J].Prog Neurobiol,1993,40:507-528.
收稿日期：1999年5月14日；修回日期：1999年 8月30日, http://www.100md.com
单位：大连医科大学生理教研室，大连 116027
关键词：东亚钳蝎粗毒；抗癫痫反复发作；红藻氨酸；海马；强啡；肽原mRNA
中国应用生理学杂志000119摘要 目的和方法：本工作用红藻氨酸癫痫模型，通过对癫痫大鼠蝎毒处理后海马内强 啡肽原mRNA(PDYN mRNA)表达的原位杂交观察，对国产东亚钳蝎粗毒抗癫痫反复发作 的细胞分子机制进行初步探讨。结果：原位杂交的实验显示，三周KA后，实 验对照组与空白对照组相比，腹侧海马尤其是海马门区PDYN mRNA阳性神经元数目明显减少( P<0.01)；实验给药组大鼠8例，其中有6例腹侧海马门区PDYN mRNA阳性神经元数目未 见减少且有明显增加，显著高于实验对照组(P<0.01)和空白对照组(P<0.01)； 各组大鼠背侧海马门区PDYN mRNA表达的变化与腹侧海马相似。结论：蝎毒 能选择性地增加癫痫敏感大鼠海马PDYN mRNA的表达。提示此效应很可能是蝎毒抗癫痫反复 发作的重要的细胞分子机制之一。
, 百拇医药
中图分类号： R338 文献标识码：A 文章编 号：1000-6834(2000)01-0072-03
EFFECT OF SCORPION VENOM ON THE EXPRESSION OF PDYN mRNA IN HIPPOCAMPUS OF EPILEPTIC RATS
JIANG Chun-ling, ZHANG Wan-qin
(Department of Physiology, Dalian Medical University, Dalian 116027)
ABSTRACT
Aim and Methods: In the present study, the effect of scorpion venom (SV) on the expression of PDYN mRNA in the ventral hippocampus of epileptic rats and its cellular and molecular mechanisms investigated, after SV or normal saline (NS) administrated for three weeks. Results: In situ hybridization showed that the number of PDYN mRNA positive neurons was markedly decreased in the ventral hippocampus, especially in hilus of KA+NS group as comp ared with NS+NS group. However, in SV treated group for three weeks the number o f PDYN mRNA positive neurons was significantly increased than that of KA+NS grou p and the NS+NS group. And the change of PDYN mRNA expression in the dorsal hipp ocampus of all the four groups was similar to the ventral part. Conclusio n:SV may selectively increase the expression of PDYN mRNA in the hippocamp us of epileptic susceptible rats. We postulate that this effect may be one of th e important antiepileptic susceptibility cellular and molecular mechanisms of S V.
, 百拇医药
KEY WORDS: scorpion venom; antiepileptic suscepti bility; kainic acid; hippocampus; PDYN mRNA
已报告癫痫大鼠强啡肽原(Prodynorphin,PDYN) mRNA长期持续低表达[1，2]， 提示癫痫发作的敏感性的形成可能与PDYN mRNA表达水平的长期持续性降低有关。我们新近 的工作证实蝎毒具有明显的抗癫痫反复发作的作用，能抑制一次急性癫痫发作后海马内星形 胶质细胞的增生，减轻神经元受损的程度[3]。但有关蝎毒抗癫痫反复发作的阿片 肽机制迄今尚未见报告。本工作用红藻氨酸(kainic acid，KA)癫痫模型报道东亚钳蝎(Buth us Martensii Karsch，BMK)粗毒增加癫痫大鼠海马内PDYN mRNA表达的原位杂交观察结果， 旨在分子水平上探讨蝎毒抗癫痫作用的可能的阿片肽机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验分组和脑片制备
选用健康雄性SD大鼠(体重180～220g)，自由进食饮水，自然昼夜。一次性颈部皮下注 射惊厥剂量的红藻氨酸(10 mg/kg)，诱发大鼠出现急性癫痫发作。癫痫发作行为的严重程度 按Racine所描述的1～5级标准进行观察记录。选用癫痫发作级别在4级以上的大鼠16只随机 均分成两组，即实验给药组(KA+SV)和实验对照组(KA+NS)。分别用2 ml BMK蝎毒(SV，0.04 %)和相同体积的生理盐水(NS)灌胃，每日一次，连续三周。另选用12只大鼠随机分成两组， 颈部皮下注射生理盐水(0.2 ml/100g)后，用相同剂量的蝎毒或生理盐水灌胃做为空白给 药组(NS+SV)和空白对照组(NS+NS)。三周后用4%水合氯醛(400 mg/kg，i.p)麻醉；依次用0 .01 mol/L PBS，4%多聚甲醛+1.25%戊二醛/0.01 mol/L PBS经心脏灌流；取脑； 4% 多聚甲醛后固定；再置入含15%蔗糖的磷酸盐缓冲液中。用XY-86型振动切片机切取20 μm 厚海马冠状脑片。
, 百拇医药
1.2 原位杂交实验
1.2.1 探针标记 用与大鼠强啡肽原有互补序列的33mer的寡核苷酸直接 与信号酶(碱性磷酸酶)相联接。
1.2.2 杂交 各组动物的海马脑片在杂交液(杂交缓冲液+探针，26 ng 探针/ml杂交缓冲液)42℃下孵育过夜，用2xSSC于42℃下漂洗15 min；用1xSSC室温下漂洗 脑片10 min x 2。
1.2.3 免疫检测 分别用缓冲液I(mol/L) Tris-HCl 0.1、NaCl 0.15、p H7.5)和缓冲液Ⅱ(mol/L)Tris-HCl 0.1、NaCl 0.1、MgCl20.25、pH 9.5)室温下振动 漂洗脑片2 min，用显色剂(NBT+X-磷酸盐)显色，甘油明胶封片，光镜下观察并摄片。
1.3 形态学的图像分析扫描
, 百拇医药
用LEICA Q500MC图像分析仪(德国)进行海马脑片细胞计数。选实验对照组、实验给药 组、空白对照组和空白给药组大鼠各6只，每个动物测3张脑片。脑片的选定部位按George P axinos ＆ Charles Watson的大鼠脑图谱确定[4]，前囟后5.80 mm即海马结构所 在部位。先在10×物镜下观察脑片，选取腹侧海马门部位；然后在荧光屏上画出测量框的轮 廓，测量框面积为61557 μm[2]，宽度(W)和高度(H)分别为213 μm、289 μm ，计算测量框内PDYN mRNA阳性神经元的个数。每个动物的3张脑片数值相加后取平均值。
1.4 统计学处理
实验数据用均数±标准误(
±S)表示，并输入计算机进行统 计学处理。四组先进行方差分析，求得F值，然后每两组之间再用q检验进行比较。, 百拇医药
2 结果
2.1 海马部位原位杂交检测PDYN mRNA阳性神经元的变化
原位杂交的检测结果显示，空白对照组(NS+NS)大鼠的PDYN mRNA阳性神经元散在分布 于腹侧海马门区(图1，1C)。与NS+NS组相比，KA后三周实验对照组(KA+NS)大鼠的腹侧海 马门区PDYN mRNA阳性神经元数目明显减少，几乎完全消失(图1，1A)(表1，P<0.01 )。实验给药组(KA+SV)大鼠(图1，1B)，8例中有的6例腹侧海马门区PDYN mRNA阳性神经元 数目不仅未见减少而且明显增加，高于KA+NS组(表1，P<0.01)和NS+NS组(表1， P<0.01)，与NS+SV组相比无显著差异(表1，P<0.05)。
空白给药组(NS+SV)大鼠，与NS+NS组相比，腹侧海马齿状回PDYN mRNA阳性神经元数目 明显增加，以海马门区密度最高，呈均匀分布(图1，1D)(表1，P<0.01)。各组大鼠背 侧海马PDYN mRNA表达的变化与腹侧海马相似。
, 百拇医药
结果表明KA后三周，腹侧海马门部位表达PDYN mRNA的中间神经元明显脱失。BMK蝎毒能 选择性防止其脱失，并使PDYN mRNA的表达增加；同时也使空白给药组大鼠腹侧海马门部位PDYN mRNA的表达增加。
Fig.1 PDYN mRNA positive neuro ns in the ventral hippocampus of epileptic rats treated with scorpion venom for three weeks(A.B.C.D NBT staining,×50)
3 讨论
强啡肽(dynorphin，DYN)是中枢神经系统内的一个重要阿片肽，它在调节脑的兴奋性尤 其是癫痫相关脑区一海马结构的兴奋性方面起重要作用。己证实强啡肽在边缘系统各部分高 表达，尤其是在海马的齿状回[5]；强啡肽能激活kappa型阿片受体，通过多突触机 制抑制穿通通路和苔状纤维内兴奋性氨基酸的释放，具有明显的抗惊厥作用，是内源性阿片 肽[6，7]。
, 百拇医药
Tab.1 Quantitative analysis of PDYN mRNA pos itive neurons in the ventral hippocampus of epileptic rats treated with scorpion venom for three weeks (
±s) GroupNo. of animals
No. of cells
NS+NS
6
21.8±0.95
NS+SV
, 百拇医药 6
33.2±1.01* *
KA+NS
6
4.8+0.48* *
KA+SV
6
35.8±2.02* *##
* * P<0.01, vs NS+NS group; ## P<0.01, vs KA+NS group
己报告癫痫大鼠PDYN mRNA长期持续低表达[1，2]；我们新近的工作证实蝎毒 具有明显的抗癫痫反复发作(epileptic seizure)的作用[3]，但有关蝎毒对癫痫大 鼠海马内PDYN mRNA的表达的影响迄今尚未见报告。本工作发现KA后三周，癫痫大鼠腹侧海 马门区PDYN mRNA阳性神经元数目明显减少，表明癫痫发作后腹侧海马门区PDYN mRNA的表达 水平明显降低，这与前人的报告相一致。但我们还进一步观察到BMK蝎毒能选择性地增加正 常大鼠腹侧海马门区PDYN mRNA的表达，提示蝎毒能加强生理性抗癫痫作用；癫痫大鼠经BM K蝎毒处置后，腹侧海马门区PDYN mRNA阳性神经元数目明显增加，表明蝎毒能翻转(reverse )腹侧海马门区PDYN mRNA的表达水平，选择性地增强海马门区DYN能抑制性中间神经元的 功能。推测这很可能是其抗癫痫反复发作的重要的细胞分子机制之一。
, 百拇医药
有报告用反义核酸技术封阻癫痫大鼠c-fos mRNA，降低Fos的水平后，PDYN mRNA的 表达降低60%；进一步的研究表明Fos作用于PDYN基因的AP-1位点，调节海马内的PDYN mRNA的表达[1]。我们的实验也证实蝎毒能提高癫痫大鼠腹侧海马门区的Fos蛋白的 水平(待发表资料)。据此，我们推断BMK蝎毒增加腹侧海马门区PDYN mRNA的表达，可能是通 过提高Fos蛋白的水平来实现的。至于其详尽的作用途径还有待于进一步的研究。
作者简介：姜春玲(1963-)，女，大连市人，副教授，硕士学位， 博士研究生，从事蝎毒抗癫痫作用的细胞分子机制研究
参考文献
[1] Ziolkowska B，Przewlocka B，MikaJ，et al.Evidence for Fos invo lvement in the regulation of proenkephalin and prodynorphin gene expression in the rat hippocampus[J].Mol Brain Res,1998，54：243-251.
, http://www.100md.com
[2] 张万琴，高 溪，李冬冬，等.海人酸诱发癫痫反复发作的分子机制[J].中国生理 学会第20届全国代表大会暨学术会议论文摘要汇编，1998(增刊1)，17(1)：69-70.
[3] 姜春玲，张 健，郎明非，等.蝎毒对癫痫敏感性和海马GFAP释放的影响[J].中 国应用生理学杂志，1999，15(3)：234-237.
[4] Paxions G.Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates[M].2nd ed .San Diego: Academic Press.1986.
[5] Simonato M，RomualdiP.Dynorphin and epilepsy[J].Prog Neurobiol，19 96，50：557-583.
[6] Simmons M L，CharkinC.Endogenous opioid regulation of hippocampal funct ion[J].Int Rev Neurobiol，1996，39：145-196.
[7] Hong J S，McGinty J F，Lee P H K，et al.Relationship between hippocam pal opioid peptides and seizures[J].Prog Neurobiol,1993,40:507-528.
收稿日期：1999年5月14日；修回日期：1999年 8月30日, http://www.100md.com