红藻氨酸诱导癫痫发作大鼠海马结构中EAAC-1变化
作者：夏峰 李臻 黄远桂 张远强
单位：夏峰(第四军医大学 西京医院神经内科 陕西 西安 710033)；李臻(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室, 陕西 西安 710033)；黄远桂(第四军医大学 西京医院神经内科 陕西 西安 710033)；张远强(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室, 陕西 西安 710033)
关键词：癫痫；转运蛋白；谷氨酸；红藻氨酸
第四军医大学学报000644 摘要：目的 研究谷氨酸转运蛋白亚型(EAAC-1)在红藻氨酸(KA)诱导癫痫发作大鼠海马结构中的变化. 方法 用红藻氨酸诱导的复杂部分性癫痫模型，将20只SD大鼠随机分为3,6,12,48 h及对照5组. 用免疫蛋白印记法(Western blot)观察EAAC-1在海马结构上的变化. 结果 KA注射后3 h海马EAAC-1开始减少，6 h显著减少，12 h后EAAC-1逐渐恢复. 结论 EAAC-1表达的调控可能与KA诱导的癫痫发作、神经毒性作用以及在神经元的可塑性中起十分重要的作用.
, 百拇医药
中图号：Q959.837 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-S0107-03
Changes of EAAC-1 in rat hippocampus following kainate-induced seizure activity
XIA Feng ZHANG Yuan-Qiang
(Department of Neurology, Xijing Hospital)
LI Zhen HUANG Yuan-Gui
(Department of Histology and Embryology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
, 百拇医药
Abstract：AIM To study excitatory amino acid carrier-1(EAAC-1) in hippocampus of rats with seizure induced by kainate. METHODS A kainate-induced complex partial seizure model was used in present study. 20 SD rats were randomly grouped into KA 3, 6, 12, 48 h and control. Changes of EAAC-1 protein in the rat hippocampus were observed by Western blots. RESULTS EAAC-1 protein decreased after the injection of kainate for 3 h, and decreased more significantly after 6 h while EAAC-1 protein increased after 12 h. CONCLUSION Regulation of EAAC-1 may play a role in kainate-induced seizure, neurotoxicity and neuronal plasticity.
, 百拇医药
Keywords:seizure; transporter; glutamate; kainic acid
0 引言
癫痫是一种严重危害人类健康的常见病、多发病. 其发病机制复杂，不甚清楚. 而谷氨酸作为一种兴奋性神经递质在脑内广泛存在. 当谷氨酸浓度在细胞突触内浓度过高，可使大脑兴奋性增高，从而使癫痫易于发生. 许多事实已经证实谷氨酸是癫痫的发作因素之一[1]. 目前研究表明谷氨酸转运蛋白可将细胞突触内的谷氨酸快速转运，使细胞突触间保持较低的谷氨酸浓度，降低大脑兴奋性. 而目前对于谷氨酸转运蛋白对癫痫的易发性、药物、环境等是否有影响还所知甚少. 从1992年起谷氨酸转运蛋白已被克隆出五种亚型(GLT-1,GLAST,EAAC-1,EAAT-4,EAAT-5)[2,3]. EAAC-1特有地位于神经元的突触前膜，主要分布在中枢神经系统海马结构的CA1-CA4区的锥体细胞层、齿状回，小脑的颗粒细胞层及大脑皮质的Ⅱ～Ⅳ层[4]. EAAC-1具有主动转运细胞外谷氨酸的作用，从而避免神经系统过度兴奋，对于谷氨酸能神经传递及神经细胞的保护具有特别重要的意义. 本研究的目的旨在研究KA诱导的癫痫大鼠发作后EAAC-1在海马上的变化，以了解EAAC-1与复杂部分性发作之间的关系.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性SD大鼠(本校实验动物研究中心提供)体质量160～200 g 20只. 随机分为KA注射后3,6,12,48 h及对照组，每组4只.
1.2 方法 ①免疫蛋白印记: 用戊巴比妥钠(40 mg.kg-1,ip)麻醉大鼠后，迅速断头取出双侧海马组织；将湿重150～220 mg海马组织放于10倍体积的TBS液中匀浆；取100 μL 匀浆液转移到1.5 mL试管，同时加入等体积2×SDS凝胶加样缓冲液；置100℃加热5 min，离心5 min，等量上样；80 g.L-1 PAGE经SDS-PAGE电泳分离(250 mA,2 h)；电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上；用封闭液(B.M公司)封闭1 h；再加多克隆山羊抗EAAC-1血清(1∶5000，Chemicon)孵育过夜；用TBS液漂洗2×10 min；然后加生物素化的抗山羊IgG(1∶500,Sigma) 孵育1h；用TBS液漂洗2×10 min；最后加ABC液(1∶500,Sigma)孵育1 h；用TBS液漂洗2×10 min；DAB呈色. 对照组4只：生理盐水10 mL.kg-1 ip,按上述流程操作. ②图像分析： 硝酸纤维素膜呈色结果经GDS-8000凝胶成像系统(UVP公司，美国)摄像，灰度扫描.
, 百拇医药
2 结果
2.1 KA诱导癫痫发作表现 KA建模鼠全部出现癫痫发作. 主要表现为点头、肢体抽搐、湿犬样摇动(WS)、姿式失衡. 给药后60 min发作达到高峰，出现阵发性全身强直-阵挛性惊厥，表现全身强直、尾巴僵硬、四肢抽搐、肢端发绀伴呼吸急促、咬牙、口吐白沫. 持续时间最长6 min，最短8 s.
2.2 免疫蛋白印记结果 免疫蛋白印记结果显示，EAAC-1的抗体特异性地67K Da左右处有一条明显线状条带，这与国外学者用此种抗体的结果相符[5](Fig 1).
图 1 各时间点免疫蛋白印记
Fig 1 Western blots on different times
, 百拇医药
图 2 不同时间点海马结构EAAC-1的表达
Fig 2 Expression of EAAC-1 in hippocampus on different times
2.3 数据分析 用GDS-8000凝胶成像系统对各时间点反应带进行统计学分析,使用独立t检验方法(Fig 2). 由统计结果可看出，KA注射后3 h可见海马EAAC-1蛋白含量开始减少，6 h后减少更为显著(P<0.01)，12 h后逐渐恢复.
3 讨论
关于神经元上的谷氨酸转运蛋白EAAC-1在癫痫中的作用还有争议. Miller等[6]研究杏仁核-点燃鼠模型，发现癫痫发作后在海马、杏仁核EAAC-1的表达水平有所增高，由此认为EAAC-1的变化是由于癫痫发作后谷氨酸浓度的变化而引起的,与癫痫发作有密切的关系. Rothstein等[7]通过用慢性反义寡核苷酸的方法特异性地阻断EAAC-1的合成和功能后发现可导致癫痫的发作，但细胞外的谷氨酸并没有浓度升高，也没有发生神经变性. Akbar等[5]发现遗传性听源性癫痫大鼠脑内的EAAC-1 mRNA较正常大鼠有减少的趋势，而EAAC-1却无明显变化. 由此可见EAAC-1与癫痫具有一定关系，但具体是通过何种通路、是如何作用的还不清楚. 而Peghini等[8]研究基因敲除后缺乏EAAC-1的小鼠时并没有观察到有自发性的癫痫发作，也没有发现导致与神经变性有关的任何组织学或神经病学的变化. 这是否是因为EAAC-1在不同条件下表达不同，还是由于有其他亚型代偿或作用的结果，目前还不甚清楚. 而国外也有学者认为在胶质细胞上的谷氨酸转运蛋白GLT-1,GLAST在癫痫中起着更为重要的作用，如Tanaka等[9]观察基因敲除后缺乏GLT-1的鼠，发现这些鼠多在未成熟时就死于自发性的癫痫发作，而且海马也有神经元变性.
, 百拇医药
我们研究结果表明，KA注射后EAAC-1蛋白在海马的表达可以在相当长的时间内受到影响. 癫痫发作的数小时内即可发现EAAC-1蛋白在海马的表达就有减少. 这说明KA诱导癫痫发作后可快速降低海马神经元上EAAC-1的表达. 我们认为这是由于癫痫发作后脑内细胞外谷氨酸浓度增高，而神经元细胞内不含有特异的谷氨酸盐合成酶使谷氨酸“失活”，而在癫痫发作后短期内EAAC-1对谷氨酸的转运达到饱和所引起. 同时我们的研究还表明KA诱导癫痫发作后48 h EAAC-1在海马内的含量仍比发作前低，说明在癫痫发作后较长的时间内EAAC-1的表达还未完全恢复至正常水平，在海马的特定区域较长时间的EAAC-1的减少使神经细胞长时间处于较高浓度的谷氨酸环境下，从而导致损伤、变性和凋亡. 这与国外报道的在KA诱导癫痫发作后16～18 h海马锥体细胞有凋亡相符[10].
我们认为EAAC-1与癫痫有着密切的关系, EAAC-1可能通过某种途径参与了癫痫的发作. 癫痫发作后EAAC-1的表达和调控与神经元的非病理性变化可能有更复杂的关系，可能在控制边缘系统的兴奋水平中起十分重要的作用，这将在后续的研究中进一步证实.
, 百拇医药
作者简介：夏 峰(1973-), 男(汉族)，浙江省杭州市人. 硕士生(导师黄远桂). Tel.(029)3373155 Email.xffmmu@263.net
参考文献:
[1] Meldrum BS. The role of glutamate in epilepsy and other CNS disorders[J]. Neurology, 1994; 44(Suppl 8): 14.
[2] Shashidharan P, Huntley GW. Immunohistochemical localization of the neuron-specific glutamate transporter EAAC1 (EAAT3) in rat brain and spinal cord revealed by a novel monoclonal antibody[J]. Brain Res, 1997; 773(1-2): 139-148.
, 百拇医药
[3] Seals RP, Amara G. Excitatory amino acid transporter: A family in flux[J]. Ann Rev Pharmacol Toxocol, 1999; 39(2):431-448.
[4] Jeffery D, Rthstein JD, Lee M et al. Localization of neuronal and glial glutamate transporters[J]. Neuron, 1994; 13(2): 713-725.
[5] Akbar MT, Rattray M. Reduction of GABA and glutamate transporter messenger RNAs in the severe seizure genetically epilepsy-prone rat[J]. Neuroscience, 1998; 85(4): 1235-1251.
, 百拇医药
[6] Miler HP, Levey AL, Rothstein JD et al. Alterations in glutamate transporter protein levels in kindling-induced epilepsy[J]. J Neurochem, 1997; 68(4): 1564-1570.
[7] Rothstein JD, Dykes-Hberg M, Pardo CA et al. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate[J]. Neuron, 1996; 16(3): 675-686.
[8] Peghini P, Janzen J, Stoffel W. Glutamate transporter EAAC-1 deficient mice develop dicarboxylic aminoaciduria and behavioral abnormalities but no neurodegeneration[J]. EMBO J, 1997;16(13):3822-3832.
, http://www.100md.com
[9] Tanaka K, Watase K, Manabe T et al. Epilepsy and exacerbation of brain injury in mice lacking the glutamate transporter GLT-1[J]. Science, 1997; 276(5319): 1699-1702.
[10] Ben-Ari Y. Limbic seizure and brain damage produced by kainic acid:Mechanisms and relevance to human temporal lobe epilepsy[J]. Neuroscience, 1985;14:375-403.
收稿日期：1999-11-29
修回日期：2000-02-25, http://www.100md.com
单位：夏峰(第四军医大学 西京医院神经内科 陕西 西安 710033)；李臻(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室, 陕西 西安 710033)；黄远桂(第四军医大学 西京医院神经内科 陕西 西安 710033)；张远强(第四军医大学 组织学与胚胎学教研室, 陕西 西安 710033)
关键词：癫痫；转运蛋白；谷氨酸；红藻氨酸
第四军医大学学报000644 摘要：目的 研究谷氨酸转运蛋白亚型(EAAC-1)在红藻氨酸(KA)诱导癫痫发作大鼠海马结构中的变化. 方法 用红藻氨酸诱导的复杂部分性癫痫模型，将20只SD大鼠随机分为3,6,12,48 h及对照5组. 用免疫蛋白印记法(Western blot)观察EAAC-1在海马结构上的变化. 结果 KA注射后3 h海马EAAC-1开始减少，6 h显著减少，12 h后EAAC-1逐渐恢复. 结论 EAAC-1表达的调控可能与KA诱导的癫痫发作、神经毒性作用以及在神经元的可塑性中起十分重要的作用.
, 百拇医药
中图号：Q959.837 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-S0107-03
Changes of EAAC-1 in rat hippocampus following kainate-induced seizure activity
XIA Feng ZHANG Yuan-Qiang
(Department of Neurology, Xijing Hospital)
LI Zhen HUANG Yuan-Gui
(Department of Histology and Embryology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
, 百拇医药
Abstract：AIM To study excitatory amino acid carrier-1(EAAC-1) in hippocampus of rats with seizure induced by kainate. METHODS A kainate-induced complex partial seizure model was used in present study. 20 SD rats were randomly grouped into KA 3, 6, 12, 48 h and control. Changes of EAAC-1 protein in the rat hippocampus were observed by Western blots. RESULTS EAAC-1 protein decreased after the injection of kainate for 3 h, and decreased more significantly after 6 h while EAAC-1 protein increased after 12 h. CONCLUSION Regulation of EAAC-1 may play a role in kainate-induced seizure, neurotoxicity and neuronal plasticity.
, 百拇医药
Keywords:seizure; transporter; glutamate; kainic acid
0 引言
癫痫是一种严重危害人类健康的常见病、多发病. 其发病机制复杂，不甚清楚. 而谷氨酸作为一种兴奋性神经递质在脑内广泛存在. 当谷氨酸浓度在细胞突触内浓度过高，可使大脑兴奋性增高，从而使癫痫易于发生. 许多事实已经证实谷氨酸是癫痫的发作因素之一[1]. 目前研究表明谷氨酸转运蛋白可将细胞突触内的谷氨酸快速转运，使细胞突触间保持较低的谷氨酸浓度，降低大脑兴奋性. 而目前对于谷氨酸转运蛋白对癫痫的易发性、药物、环境等是否有影响还所知甚少. 从1992年起谷氨酸转运蛋白已被克隆出五种亚型(GLT-1,GLAST,EAAC-1,EAAT-4,EAAT-5)[2,3]. EAAC-1特有地位于神经元的突触前膜，主要分布在中枢神经系统海马结构的CA1-CA4区的锥体细胞层、齿状回，小脑的颗粒细胞层及大脑皮质的Ⅱ～Ⅳ层[4]. EAAC-1具有主动转运细胞外谷氨酸的作用，从而避免神经系统过度兴奋，对于谷氨酸能神经传递及神经细胞的保护具有特别重要的意义. 本研究的目的旨在研究KA诱导的癫痫大鼠发作后EAAC-1在海马上的变化，以了解EAAC-1与复杂部分性发作之间的关系.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性SD大鼠(本校实验动物研究中心提供)体质量160～200 g 20只. 随机分为KA注射后3,6,12,48 h及对照组，每组4只.
1.2 方法 ①免疫蛋白印记: 用戊巴比妥钠(40 mg.kg-1,ip)麻醉大鼠后，迅速断头取出双侧海马组织；将湿重150～220 mg海马组织放于10倍体积的TBS液中匀浆；取100 μL 匀浆液转移到1.5 mL试管，同时加入等体积2×SDS凝胶加样缓冲液；置100℃加热5 min，离心5 min，等量上样；80 g.L-1 PAGE经SDS-PAGE电泳分离(250 mA,2 h)；电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上；用封闭液(B.M公司)封闭1 h；再加多克隆山羊抗EAAC-1血清(1∶5000，Chemicon)孵育过夜；用TBS液漂洗2×10 min；然后加生物素化的抗山羊IgG(1∶500,Sigma) 孵育1h；用TBS液漂洗2×10 min；最后加ABC液(1∶500,Sigma)孵育1 h；用TBS液漂洗2×10 min；DAB呈色. 对照组4只：生理盐水10 mL.kg-1 ip,按上述流程操作. ②图像分析： 硝酸纤维素膜呈色结果经GDS-8000凝胶成像系统(UVP公司，美国)摄像，灰度扫描.
, 百拇医药
2 结果
2.1 KA诱导癫痫发作表现 KA建模鼠全部出现癫痫发作. 主要表现为点头、肢体抽搐、湿犬样摇动(WS)、姿式失衡. 给药后60 min发作达到高峰，出现阵发性全身强直-阵挛性惊厥，表现全身强直、尾巴僵硬、四肢抽搐、肢端发绀伴呼吸急促、咬牙、口吐白沫. 持续时间最长6 min，最短8 s.
2.2 免疫蛋白印记结果 免疫蛋白印记结果显示，EAAC-1的抗体特异性地67K Da左右处有一条明显线状条带，这与国外学者用此种抗体的结果相符[5](Fig 1).
图 1 各时间点免疫蛋白印记
Fig 1 Western blots on different times
, 百拇医药
图 2 不同时间点海马结构EAAC-1的表达
Fig 2 Expression of EAAC-1 in hippocampus on different times
2.3 数据分析 用GDS-8000凝胶成像系统对各时间点反应带进行统计学分析,使用独立t检验方法(Fig 2). 由统计结果可看出，KA注射后3 h可见海马EAAC-1蛋白含量开始减少，6 h后减少更为显著(P<0.01)，12 h后逐渐恢复.
3 讨论
关于神经元上的谷氨酸转运蛋白EAAC-1在癫痫中的作用还有争议. Miller等[6]研究杏仁核-点燃鼠模型，发现癫痫发作后在海马、杏仁核EAAC-1的表达水平有所增高，由此认为EAAC-1的变化是由于癫痫发作后谷氨酸浓度的变化而引起的,与癫痫发作有密切的关系. Rothstein等[7]通过用慢性反义寡核苷酸的方法特异性地阻断EAAC-1的合成和功能后发现可导致癫痫的发作，但细胞外的谷氨酸并没有浓度升高，也没有发生神经变性. Akbar等[5]发现遗传性听源性癫痫大鼠脑内的EAAC-1 mRNA较正常大鼠有减少的趋势，而EAAC-1却无明显变化. 由此可见EAAC-1与癫痫具有一定关系，但具体是通过何种通路、是如何作用的还不清楚. 而Peghini等[8]研究基因敲除后缺乏EAAC-1的小鼠时并没有观察到有自发性的癫痫发作，也没有发现导致与神经变性有关的任何组织学或神经病学的变化. 这是否是因为EAAC-1在不同条件下表达不同，还是由于有其他亚型代偿或作用的结果，目前还不甚清楚. 而国外也有学者认为在胶质细胞上的谷氨酸转运蛋白GLT-1,GLAST在癫痫中起着更为重要的作用，如Tanaka等[9]观察基因敲除后缺乏GLT-1的鼠，发现这些鼠多在未成熟时就死于自发性的癫痫发作，而且海马也有神经元变性.
, 百拇医药
我们研究结果表明，KA注射后EAAC-1蛋白在海马的表达可以在相当长的时间内受到影响. 癫痫发作的数小时内即可发现EAAC-1蛋白在海马的表达就有减少. 这说明KA诱导癫痫发作后可快速降低海马神经元上EAAC-1的表达. 我们认为这是由于癫痫发作后脑内细胞外谷氨酸浓度增高，而神经元细胞内不含有特异的谷氨酸盐合成酶使谷氨酸“失活”，而在癫痫发作后短期内EAAC-1对谷氨酸的转运达到饱和所引起. 同时我们的研究还表明KA诱导癫痫发作后48 h EAAC-1在海马内的含量仍比发作前低，说明在癫痫发作后较长的时间内EAAC-1的表达还未完全恢复至正常水平，在海马的特定区域较长时间的EAAC-1的减少使神经细胞长时间处于较高浓度的谷氨酸环境下，从而导致损伤、变性和凋亡. 这与国外报道的在KA诱导癫痫发作后16～18 h海马锥体细胞有凋亡相符[10].
我们认为EAAC-1与癫痫有着密切的关系, EAAC-1可能通过某种途径参与了癫痫的发作. 癫痫发作后EAAC-1的表达和调控与神经元的非病理性变化可能有更复杂的关系，可能在控制边缘系统的兴奋水平中起十分重要的作用，这将在后续的研究中进一步证实.
, 百拇医药
作者简介：夏 峰(1973-), 男(汉族)，浙江省杭州市人. 硕士生(导师黄远桂). Tel.(029)3373155 Email.xffmmu@263.net
参考文献:
[1] Meldrum BS. The role of glutamate in epilepsy and other CNS disorders[J]. Neurology, 1994; 44(Suppl 8): 14.
[2] Shashidharan P, Huntley GW. Immunohistochemical localization of the neuron-specific glutamate transporter EAAC1 (EAAT3) in rat brain and spinal cord revealed by a novel monoclonal antibody[J]. Brain Res, 1997; 773(1-2): 139-148.
, 百拇医药
[3] Seals RP, Amara G. Excitatory amino acid transporter: A family in flux[J]. Ann Rev Pharmacol Toxocol, 1999; 39(2):431-448.
[4] Jeffery D, Rthstein JD, Lee M et al. Localization of neuronal and glial glutamate transporters[J]. Neuron, 1994; 13(2): 713-725.
[5] Akbar MT, Rattray M. Reduction of GABA and glutamate transporter messenger RNAs in the severe seizure genetically epilepsy-prone rat[J]. Neuroscience, 1998; 85(4): 1235-1251.
, 百拇医药
[6] Miler HP, Levey AL, Rothstein JD et al. Alterations in glutamate transporter protein levels in kindling-induced epilepsy[J]. J Neurochem, 1997; 68(4): 1564-1570.
[7] Rothstein JD, Dykes-Hberg M, Pardo CA et al. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate[J]. Neuron, 1996; 16(3): 675-686.
[8] Peghini P, Janzen J, Stoffel W. Glutamate transporter EAAC-1 deficient mice develop dicarboxylic aminoaciduria and behavioral abnormalities but no neurodegeneration[J]. EMBO J, 1997;16(13):3822-3832.
, http://www.100md.com
[9] Tanaka K, Watase K, Manabe T et al. Epilepsy and exacerbation of brain injury in mice lacking the glutamate transporter GLT-1[J]. Science, 1997; 276(5319): 1699-1702.
[10] Ben-Ari Y. Limbic seizure and brain damage produced by kainic acid:Mechanisms and relevance to human temporal lobe epilepsy[J]. Neuroscience, 1985;14:375-403.
收稿日期：1999-11-29
修回日期：2000-02-25, http://www.100md.com