大鼠癫痫持续状态中海马神经元bcl-2、bax、p53的表达
作者：孙康健 谭启富 吴波 孙克华 印红霞
单位：孙康健 谭启富 孙克华 印红霞(南京军区南京总医院，江苏南京 210002；神经外科)；吴波(南京军区南京总医院，江苏南京 210002；病理科)
关键词：癫痫持续状态；海马；bcl-2；bax；p53
医学研究生学报000313摘要：目的：采用贝美格腹腔注射制作大鼠急性癫持续状态(SE)模型，观察海马神经元中bcl-2、bax、p53的表达。 方法：通过将SD大鼠脑海马切片行bcl-2、bax、p53的免疫组化染色，观察肿瘤相关基因在大鼠SE模型海马中的作用。 结果：bcl-2在正常大鼠海马中不表达，发作高峰期在CA3区有弱表达；bax在正常大鼠海马中弱表达，在发作高峰期CA3区强表达；p53(突变型)在正常大鼠海马及SE模型中均不表达。 结论：急性癫
持续状态可造成海马神经元的凋亡，其部位主要位于CA3、CA1区，而且肿瘤相关基因bcl-2、bax在SE过程中发挥作用，而p53(突变型)不发挥作用。
, 百拇医药
中图分类号： R742.1 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)03-0176-03
Expression of bcl-2, bax, p53 in rat hippocampal neurons at status epilepticus
SUN Kang-jian, TAN Qi-fu, , SUN Ke-hua, YIN Hong-xia
(Department of Neurosurgery；Jinling Hospital,Nanjing 210002,Jiangsu,China)
WU Bo
(Department of Neurosurgery；Department of Pathology, 210002,Jiangsu,China)
, 百拇医药
Abstract： Objectives：Make the status epilepticus(SE)model in rat by celiac injection of Bemegride, observe the expression of bcl-2, bax and p53 in hippocampus. Methods：Immuno- histological method was used to show the expressions of tumor-related genes bcl-2, bax and p53 in hippocampus of SD rats. Results：bcl-2 did not express in normal rat hippocampus, slightly expressed in CA3 region during SE; bax slightly expressed in normal rat hippocampus, strongly expressed in CA3 region during SE; mutated p53 did not express in normal and SE rats. Conclusions：SE can cause apoptosis of hippocampal neurons, which mainly located in CA3 and CA1 regions. Tumor-related genes bcl-2 and bax take part in the process of SE, while mutated p53 does not.
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Key words:Status epilepticus； Hippocampus； bcl-2； bax； p53
0 引 言
细胞凋亡过程是多基因调节的细胞主动死亡过程，癌基因、抑癌基因和病毒基因等参与细胞凋亡过程的信息传导、基因表达及蛋白合成等环节，其中bcl-2、bax、p53与之关系密切[1～3]。目前，人们已经清楚bcl-2是抑制凋亡的基因，而bax是促凋亡的基因，二者的比值将决定细胞是否凋亡[4]；p53的作用则由其基因型决定，野生型p53可诱导细胞凋亡，突变型则抑制其发生。这些基因均与神经系统疾病有密切关系。急性癫持续状态SE)不仅造成多脏器损伤，严重时还可危及生命。既往的研究表明[5,6]，SE对脑部，尤其是海马的损伤较大，可以引起海马组织结构的改变，表现为神经元缺失、坏死等。但SE与细胞凋亡及凋亡相关基因的关系尚不清楚。本研究拟通过贝美格制造大鼠SE模型，对SE后不同时段的海马神经元进行bcl-2、bax和p53的免疫组化染色，以了解SE过程中海马神经元相关基因的表达。
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1 材料与方法
1.1 动物、试剂及仪器 ①实验用SD大鼠由南京军区动物实验中心(江苏省实验动物供应基地)提供，共48只，为成年大鼠，雌雄各半，体重200～240 g；②贝美格由第二军医大学朝晖制药厂提供，批号890101；③bcl-2单克隆抗体购自Dako公司，稀释比例为1∶200；④bax多克隆抗体购自Santa Cruza公司，稀释比例为1∶100；⑤p53单克隆抗体、链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶(S-P)免疫组化染色试剂盒及3,3-二氨基联苯二胺盐酸基(DAB)酶底物试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司；⑥ 日本东芝16道脑电图机。
1.2 动物模型的制备 ①将48只SD大鼠随机分为四组：对照组、SE 2 h组、SE 6 h组及SE 24 h组，每组12只。②每组各取2只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后，固定于立体定向仪上，剪去头顶部毛发，切开头皮暴露顶部颅骨，于冠状缝和矢状缝交点的前、后3～4 mm，矢状缝旁开2～3 mm处钻通颅骨，将皮质电极置于硬脑膜下，用牙托将电极固定于颅骨上，放回笼内饲养1周后再与其他大鼠一起注射药物。③大鼠的癫发作按Racine法[7]分为五级：Ⅰ级为口角和面部抽动；Ⅱ级为Ⅰ级+点头；Ⅲ级为Ⅱ级+前肢阵挛；Ⅳ级为Ⅲ级+后腿站立；Ⅴ级为Ⅳ级+跌倒。以大鼠出现Ⅳ～Ⅴ级发作，且持续20分钟为合乎标准。④SE组大鼠按20 mg/kg的剂量于腹腔内注射贝美格，对照组大鼠腹腔内注射等量等渗盐水，然后观察大鼠的行为表现。⑤SE组分别于发作达标准后2 h、6 h、24 h，对照组于注射等渗盐水后24 h，用普鲁卡因麻醉后处死，每组中取10只用4%多聚甲醛经心脏灌注固定，取脑置于10%福马林中保存24 h后，标本经常规脱水、浸蜡、包埋，切成4 μm薄片，用于免疫组化染色。
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1.3 bcl-2、bax、p53的免疫组化染色 采用S-P法，阴性对照片以PBS代替。bcl-2、bax主要在内质网膜和核膜上表达，p53主要在胞质表达。细胞内出现棕色即为阳性表现。根据显色的强弱，将结果分为五级：0为阴性；+为微弱阳性；2+为弱阳性；3+为中等阳性；4+为强阳性。
2 结 果
2.1 观察行为及皮质脑电图改变 ①对照组大鼠行为正常;SE组大鼠腹腔内注射贝美格3～5 min后，出现Ⅰ～Ⅱ级发作，持续数秒或数十秒钟不等，继而从头面部肌群抽搐开始，出现呼吸加速，并逐渐加剧，变为Ⅳ～Ⅴ级发作，持续约16～20 min不等，停止后约过1～3 min，继续出现Ⅳ级发作。发作停止后，大鼠表现呆滞，部分大鼠口角带血。②对照组大鼠脑电图表现为频率4～5 Hz的背景节律，波幅200～300 μV，无癫波;SE组注射贝美格后30～40 min，皮质脑电图表现为高波幅棘波、棘慢波、尖波等异常放电，波幅在700 μV以上;24 h后脑电图表现为电静息，出现单个棘波。
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2.2 免疫组化染色结果(表1) bcl-2：对照组海马神经元中未见表达；2 h及6 h组CA3区神经元呈微弱阳性。bax：对照组中呈微弱阳性；2 h及6 h组CA3区为中强阳性，CA1区为弱中阳性，CA2区为微弱阳性；24 h组CA3区为中弱阳性，CA1、CA2区为微弱阳性。p53：对照组及SE组均未见表达。
表1 免疫组化染色结果
Table 1 Results of Immunol-histological Staining Group
CA1
CA2
CA3
bax
bcl-2
, 百拇医药
p53
bax
bcl-2
p53
bax
bcl-2
p53
Control group
+
0
0
+
0
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0
+
0
0
2 h group
2+～3+
0
0
+
0
0
4+
+
0
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6 h group
2+
0
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+
0
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3+
+
0
24 h group
+
0
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+
0
0
2+
0
0
3 讨 论
动物模型是目前各种癫研究的基本手段，可以分为遗传动物模型和点燃动物模型两种。SE模型是点燃动物模型中的一种，可以通过马桑内酯、锂-毛果芸香碱等药物建立[8]。本研究采用贝美格腹腔注射的方法制作SE模型，大鼠在注射药物后，出现持续性全身抽搐、站立、翻滚、跌倒等强直-阵挛现象，在脑电图上出现发作期的高幅棘波、棘慢波和发作后的脑电抑制现象(电静息)，这些都与SE动物模型的特征一致[8]，说明贝美格腹腔注射也是一种简单有效的制作方法。
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在神经系统，细胞凋亡作为与坏死不同的机制[9]越来越受到关注。在正常生理条件下，细胞凋亡调节包括组织形态学变性、内分泌平衡、免疫反应等，维持正常的生理过程，使神经系统发育更加完善和精确；在病理状态下，异常调控的细胞凋亡则会使有益细胞过度死亡或使不正常细胞存活，而导致多系统疾病发生。其特征表现为染色质凝集、细胞核浓缩、核膜内陷、凋亡小体形成等，不引起周围组织的炎症反应。在缺血动物模型的研究中，人们发现缺血可以造成海马CA1区神经元的凋亡[10]；用马桑内酯诱导大鼠SE后，则可见到神经元DNA的断裂和凋亡现象[11]，说明损伤若不足以产生细胞坏死，就可以导致细胞凋亡。SE时的细胞凋亡可以由多种因素造成，如大量谷氨酰胺释放引起的Ca2+内流[12,13]、缺血、缺氧造成的脑血液灌注不足、能量代谢障碍等[14]。
bcl-2家族蛋白与p53在调节神经细胞凋亡中起重要作用，bcl-2是抑制细胞凋亡的基因，而bax为bcl-2的异源二聚体，其作用是抑制bcl-2，促进细胞凋亡[1,2]。p53基因的作用则因基因型不同而不同，野生型p53对细胞凋亡有促进作用，而突变型则抑制细胞凋亡[3]。此外，研究还表明，bcl-2与bax调节细胞凋亡过程，不仅取决于自身表达的高低，还与bax/ bcl-2值有关，当比值增大时，细胞趋于死亡[4]。本研究中发现，在正常大鼠海马中，bcl-2、p53(突变型)不表达，bax弱表达；在SE后，bax在细胞大量凋亡的CA3、CA1区表达明显，尤以SE后2～6 h最为显著；bcl-2仅在SE后2 h在CA3区弱表达；p53(突变型)则不表达。本研究虽采用半定量方法，无法得出精确的bax/ bcl-2值，但根据二者染色强弱的变化趋势，并结合TUNEL染色的结果，仍可看出，在SE后6 h海马CA3、CA1区的神经元凋亡达到高峰，bax的染色也最强，说明SE致海马组织损伤后，bax的表达对神经元死亡起着重要作用，而bcl-2的弱表达亦反映出bcl-2在SE中有保护神经元的作用。bax的表达增加导致神经元凋亡可能通过以下两种机制发生：一是bax与bcl-2形成异源二聚体，抑制bcl-2作用，还可能抑制bcl-2家族中如bcl-xL等其他抑制凋亡因子的作用[15]；另一方面是bax本身即具有促进细胞凋亡的作用[18]。
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野生型p53蛋白极易被水解，在正常或非转化细胞内半衰期只有15～30 min，其降解可能与依赖ATP的蛋白水解系统有关。当p53基因发生突变时，蛋白的构象改变，半衰期延长至2～24 h，改变后的蛋白在细胞核内沉积，浓度可达野生型的10～100倍，此时通过免疫组化方法即能检测出核内沉积的蛋白[16～18]。已有实验证实，野生型p53基因参与癫过程中神经元凋亡的调节[3]。本研究中突变型p53在对照组与SE组大鼠的海马中均不表达，说明对照组与SE组均无突变型p53，亦可能突变型p53不参与海马神经元的凋亡过程。
孙康健(1963-)，男，江苏兴化人，主治医师，医学硕士，从事神经外科专业。
参考文献：
[1] 李震中,白欣立,阮旭中.癫与神经元凋亡[J].国外医学(神经病学神经外科分册),1997,24:1.
, 百拇医药
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2000-04-26, http://www.100md.com
单位：孙康健 谭启富 孙克华 印红霞(南京军区南京总医院，江苏南京 210002；神经外科)；吴波(南京军区南京总医院，江苏南京 210002；病理科)
关键词：癫痫持续状态；海马；bcl-2；bax；p53
医学研究生学报000313摘要：目的：采用贝美格腹腔注射制作大鼠急性癫持续状态(SE)模型，观察海马神经元中bcl-2、bax、p53的表达。 方法：通过将SD大鼠脑海马切片行bcl-2、bax、p53的免疫组化染色，观察肿瘤相关基因在大鼠SE模型海马中的作用。 结果：bcl-2在正常大鼠海马中不表达，发作高峰期在CA3区有弱表达；bax在正常大鼠海马中弱表达，在发作高峰期CA3区强表达；p53(突变型)在正常大鼠海马及SE模型中均不表达。 结论：急性癫
持续状态可造成海马神经元的凋亡，其部位主要位于CA3、CA1区，而且肿瘤相关基因bcl-2、bax在SE过程中发挥作用，而p53(突变型)不发挥作用。, 百拇医药
中图分类号： R742.1 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)03-0176-03
Expression of bcl-2, bax, p53 in rat hippocampal neurons at status epilepticus
SUN Kang-jian, TAN Qi-fu, , SUN Ke-hua, YIN Hong-xia
(Department of Neurosurgery；Jinling Hospital,Nanjing 210002,Jiangsu,China)
WU Bo
(Department of Neurosurgery；Department of Pathology, 210002,Jiangsu,China)
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Abstract： Objectives：Make the status epilepticus(SE)model in rat by celiac injection of Bemegride, observe the expression of bcl-2, bax and p53 in hippocampus. Methods：Immuno- histological method was used to show the expressions of tumor-related genes bcl-2, bax and p53 in hippocampus of SD rats. Results：bcl-2 did not express in normal rat hippocampus, slightly expressed in CA3 region during SE; bax slightly expressed in normal rat hippocampus, strongly expressed in CA3 region during SE; mutated p53 did not express in normal and SE rats. Conclusions：SE can cause apoptosis of hippocampal neurons, which mainly located in CA3 and CA1 regions. Tumor-related genes bcl-2 and bax take part in the process of SE, while mutated p53 does not.
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Key words:Status epilepticus； Hippocampus； bcl-2； bax； p53
0 引 言
细胞凋亡过程是多基因调节的细胞主动死亡过程，癌基因、抑癌基因和病毒基因等参与细胞凋亡过程的信息传导、基因表达及蛋白合成等环节，其中bcl-2、bax、p53与之关系密切[1～3]。目前，人们已经清楚bcl-2是抑制凋亡的基因，而bax是促凋亡的基因，二者的比值将决定细胞是否凋亡[4]；p53的作用则由其基因型决定，野生型p53可诱导细胞凋亡，突变型则抑制其发生。这些基因均与神经系统疾病有密切关系。急性癫持续状态SE)不仅造成多脏器损伤，严重时还可危及生命。既往的研究表明[5,6]，SE对脑部，尤其是海马的损伤较大，可以引起海马组织结构的改变，表现为神经元缺失、坏死等。但SE与细胞凋亡及凋亡相关基因的关系尚不清楚。本研究拟通过贝美格制造大鼠SE模型，对SE后不同时段的海马神经元进行bcl-2、bax和p53的免疫组化染色，以了解SE过程中海马神经元相关基因的表达。
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1 材料与方法
1.1 动物、试剂及仪器 ①实验用SD大鼠由南京军区动物实验中心(江苏省实验动物供应基地)提供，共48只，为成年大鼠，雌雄各半，体重200～240 g；②贝美格由第二军医大学朝晖制药厂提供，批号890101；③bcl-2单克隆抗体购自Dako公司，稀释比例为1∶200；④bax多克隆抗体购自Santa Cruza公司，稀释比例为1∶100；⑤p53单克隆抗体、链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶(S-P)免疫组化染色试剂盒及3,3-二氨基联苯二胺盐酸基(DAB)酶底物试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司；⑥ 日本东芝16道脑电图机。
1.2 动物模型的制备 ①将48只SD大鼠随机分为四组：对照组、SE 2 h组、SE 6 h组及SE 24 h组，每组12只。②每组各取2只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后，固定于立体定向仪上，剪去头顶部毛发，切开头皮暴露顶部颅骨，于冠状缝和矢状缝交点的前、后3～4 mm，矢状缝旁开2～3 mm处钻通颅骨，将皮质电极置于硬脑膜下，用牙托将电极固定于颅骨上，放回笼内饲养1周后再与其他大鼠一起注射药物。③大鼠的癫发作按Racine法[7]分为五级：Ⅰ级为口角和面部抽动；Ⅱ级为Ⅰ级+点头；Ⅲ级为Ⅱ级+前肢阵挛；Ⅳ级为Ⅲ级+后腿站立；Ⅴ级为Ⅳ级+跌倒。以大鼠出现Ⅳ～Ⅴ级发作，且持续20分钟为合乎标准。④SE组大鼠按20 mg/kg的剂量于腹腔内注射贝美格，对照组大鼠腹腔内注射等量等渗盐水，然后观察大鼠的行为表现。⑤SE组分别于发作达标准后2 h、6 h、24 h，对照组于注射等渗盐水后24 h，用普鲁卡因麻醉后处死，每组中取10只用4%多聚甲醛经心脏灌注固定，取脑置于10%福马林中保存24 h后，标本经常规脱水、浸蜡、包埋，切成4 μm薄片，用于免疫组化染色。
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1.3 bcl-2、bax、p53的免疫组化染色 采用S-P法，阴性对照片以PBS代替。bcl-2、bax主要在内质网膜和核膜上表达，p53主要在胞质表达。细胞内出现棕色即为阳性表现。根据显色的强弱，将结果分为五级：0为阴性；+为微弱阳性；2+为弱阳性；3+为中等阳性；4+为强阳性。
2 结 果
2.1 观察行为及皮质脑电图改变 ①对照组大鼠行为正常;SE组大鼠腹腔内注射贝美格3～5 min后，出现Ⅰ～Ⅱ级发作，持续数秒或数十秒钟不等，继而从头面部肌群抽搐开始，出现呼吸加速，并逐渐加剧，变为Ⅳ～Ⅴ级发作，持续约16～20 min不等，停止后约过1～3 min，继续出现Ⅳ级发作。发作停止后，大鼠表现呆滞，部分大鼠口角带血。②对照组大鼠脑电图表现为频率4～5 Hz的背景节律，波幅200～300 μV，无癫波;SE组注射贝美格后30～40 min，皮质脑电图表现为高波幅棘波、棘慢波、尖波等异常放电，波幅在700 μV以上;24 h后脑电图表现为电静息，出现单个棘波。
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2.2 免疫组化染色结果(表1) bcl-2：对照组海马神经元中未见表达；2 h及6 h组CA3区神经元呈微弱阳性。bax：对照组中呈微弱阳性；2 h及6 h组CA3区为中强阳性，CA1区为弱中阳性，CA2区为微弱阳性；24 h组CA3区为中弱阳性，CA1、CA2区为微弱阳性。p53：对照组及SE组均未见表达。
表1 免疫组化染色结果
Table 1 Results of Immunol-histological Staining Group
CA1
CA2
CA3
bax
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p53
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bcl-2
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动物模型是目前各种癫
研究的基本手段，可以分为遗传动物模型和点燃动物模型两种。SE模型是点燃动物模型中的一种，可以通过马桑内酯、锂-毛果芸香碱等药物建立[8]。本研究采用贝美格腹腔注射的方法制作SE模型，大鼠在注射药物后，出现持续性全身抽搐、站立、翻滚、跌倒等强直-阵挛现象，在脑电图上出现发作期的高幅棘波、棘慢波和发作后的脑电抑制现象(电静息)，这些都与SE动物模型的特征一致[8]，说明贝美格腹腔注射也是一种简单有效的制作方法。, 百拇医药
在神经系统，细胞凋亡作为与坏死不同的机制[9]越来越受到关注。在正常生理条件下，细胞凋亡调节包括组织形态学变性、内分泌平衡、免疫反应等，维持正常的生理过程，使神经系统发育更加完善和精确；在病理状态下，异常调控的细胞凋亡则会使有益细胞过度死亡或使不正常细胞存活，而导致多系统疾病发生。其特征表现为染色质凝集、细胞核浓缩、核膜内陷、凋亡小体形成等，不引起周围组织的炎症反应。在缺血动物模型的研究中，人们发现缺血可以造成海马CA1区神经元的凋亡[10]；用马桑内酯诱导大鼠SE后，则可见到神经元DNA的断裂和凋亡现象[11]，说明损伤若不足以产生细胞坏死，就可以导致细胞凋亡。SE时的细胞凋亡可以由多种因素造成，如大量谷氨酰胺释放引起的Ca2+内流[12,13]、缺血、缺氧造成的脑血液灌注不足、能量代谢障碍等[14]。
bcl-2家族蛋白与p53在调节神经细胞凋亡中起重要作用，bcl-2是抑制细胞凋亡的基因，而bax为bcl-2的异源二聚体，其作用是抑制bcl-2，促进细胞凋亡[1,2]。p53基因的作用则因基因型不同而不同，野生型p53对细胞凋亡有促进作用，而突变型则抑制细胞凋亡[3]。此外，研究还表明，bcl-2与bax调节细胞凋亡过程，不仅取决于自身表达的高低，还与bax/ bcl-2值有关，当比值增大时，细胞趋于死亡[4]。本研究中发现，在正常大鼠海马中，bcl-2、p53(突变型)不表达，bax弱表达；在SE后，bax在细胞大量凋亡的CA3、CA1区表达明显，尤以SE后2～6 h最为显著；bcl-2仅在SE后2 h在CA3区弱表达；p53(突变型)则不表达。本研究虽采用半定量方法，无法得出精确的bax/ bcl-2值，但根据二者染色强弱的变化趋势，并结合TUNEL染色的结果，仍可看出，在SE后6 h海马CA3、CA1区的神经元凋亡达到高峰，bax的染色也最强，说明SE致海马组织损伤后，bax的表达对神经元死亡起着重要作用，而bcl-2的弱表达亦反映出bcl-2在SE中有保护神经元的作用。bax的表达增加导致神经元凋亡可能通过以下两种机制发生：一是bax与bcl-2形成异源二聚体，抑制bcl-2作用，还可能抑制bcl-2家族中如bcl-xL等其他抑制凋亡因子的作用[15]；另一方面是bax本身即具有促进细胞凋亡的作用[18]。
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野生型p53蛋白极易被水解，在正常或非转化细胞内半衰期只有15～30 min，其降解可能与依赖ATP的蛋白水解系统有关。当p53基因发生突变时，蛋白的构象改变，半衰期延长至2～24 h，改变后的蛋白在细胞核内沉积，浓度可达野生型的10～100倍，此时通过免疫组化方法即能检测出核内沉积的蛋白[16～18]。已有实验证实，野生型p53基因参与癫过程中神经元凋亡的调节[3]。本研究中突变型p53在对照组与SE组大鼠的海马中均不表达，说明对照组与SE组均无突变型p53，亦可能突变型p53不参与海马神经元的凋亡过程。
孙康健(1963-)，男，江苏兴化人，主治医师，医学硕士，从事神经外科专业。
参考文献：
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2000-04-26, http://www.100md.com