BPI23-Fcγ1重组融合蛋白在E.coli中的表达
作者：柯岩 安云庆 杨贵贞
单位：柯岩 安云庆(首都医科大学微生物学和免疫学教研室)；杨贵贞(白求恩医科大学免疫学教研室)
关键词：pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体；BPI23-Fcγ1重组蛋白；聚合酶链反应
中华微生物学和免疫学杂志000524 【 摘要 】 目的 构建pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体，转化E.coli DH5α诱导表达BPI23-Fcγ1抗菌重组蛋白。 方法 采用RT-PCR技术，从HL-60细胞和正常人白细胞mRNA中扩增编码BPI23和IgG1Fc(Fcγ1)的基因；通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体；转化感受态E.coli DH5α细胞，通过温控诱导表达BPI23-Fcγ1重组蛋白。 结果 (1) RT-PCR获得预期的扩增产物BPI600bp和Fcγ1700bp基因片段；(2) 成功构建pUC18-BPI180、pUC18-BPI420、pUC18-Fcγ1700重组克隆载体，DNA测序结果与文献报道一致；(3) 成功构建pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体，酶切图谱分析与预期结果相符；(4) 转化感受态E.coli DH5α细胞，通过温控诱导表达BPI23-Fcγ1重组蛋白，表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%；(5) 复性后重组蛋白具有抗菌活性和结合蛋白A的作用。 结论 pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体构建成功；在E.coli中得到表达，获得具有抗菌活性的BPI23-Fcγ1重组蛋白。
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Expression of recombinant BPI23-Fcγ1 fusion protein in E. coli
KE Yan, AN Yunqing, YANG Guizhen.
(Department of Microbiology and Immunology, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054, P. R. China)
【 Abstract 】 Objective To express BPI23-Fcγ1 anti-bacteria recombinant fusion protein. Methods BPI23 and Fcγ1 genes were isolated by RT-PCR from HL-60 and normal human leukocytes and inserted into expression vector pBV and the fusion protein expressed in E. coli DH5α in a temperature-induced manner. Results The expressed BPI23-Fcγ1 fusion protein constituted 20%～30% of total bacterial protein. The renatured BPI23-Fcγ1 recombinant protein showed biological activities of anti-bacteria and was able to form conjugate with protein A. Conclusion pBV-BPI600-Fcγ1700 recombinant expression vector was successfully constructed, and BPI23-Fcγ1 recombinant protein with anti-bacteria activities was expressed in E. coli.
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【 Subject words 】 pVB-BPI600-Fcγ1700 recombinant expression vector; BPI23-Fcγ1 recombinant protein; RT-PCR
革兰阴性细菌败血症(Gram-negative sepsis, GNS)及其休克有很高的死亡率〔1〕，传统抗菌素治疗〔2〕和采用抗脂多糖类脂A单克隆抗体或抗IL-1、TNF单克隆抗体进行免疫治疗均未获得令人满意的效果〔3〕。杀菌/渗透-增强蛋白(bactericidal / permeability increasing protein, BPI) 的研制成功为GNS及其休克的防治带来希望。BPI是微量存在于多形核白细胞颗粒中一种相对分子质量(Mr)为56×103的阳离子抗菌蛋白〔4〕。研究表明，rBPI56或其Mr为23×103的功能性氨基端片段(rBPI23)与天然BPI具有完全相同的生物学作用。它们对G-菌和细菌脂多糖有很高的亲和力，不仅能广谱杀伤G-菌并能有效中和细菌内毒素〔5〕。但药物动力学研究表明，rBPI56或rBPI23在体内的半衰期太短(<1h)〔6〕，因此影响其临床疗效。
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Ig样重组蛋白是采用基因工程技术制备的由某种功能性小分子多肽或蛋白与Ig Fc片段嵌合而成的一种重组蛋白。该种Ig样重组蛋白不仅具有多肽或蛋白所特有的生物学功能，而且兼备Ig固定补体和较长血清半衰期等特性〔7〕。据此，我们希望制备一种由BPI23与IgG Fc片段嵌合而成的重组蛋白，以期获得良好的临床治疗效果。本文主要工作如下：(1)采用RT-PCR技术，分别从HL-60细胞和正常人白细胞mRNA中扩增出编码BPI23和Fcγ1的基因片段(BPI600bp和Fcγ1700bp)；(2)构建pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体，转化E.coli DH5α诱导表达BPI23-Fcγ1重组蛋白；(3)重组蛋白复性和生物学活性的初步测定。
材料与方法
细胞、菌株和质粒载体：HL-60细胞为本实验室保存细胞株；白细胞获自正常人外周血。E.coli DH5α为本实验室保存菌株。克隆载体pUC18质粒购自北方同正生物工程公司；表达载体pBV220质粒〔8〕由中国预防医学科学院病毒所馈赠。
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主要试剂：限制性内切酶(EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ、SmaⅠ)及其它修饰酶购自Promega公司；HRP标记羊抗人IgG抗体购自北京中山生物技术有限公司；mRNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、质粒提取纯化试剂盒购自Promega公司；DNA回收纯化试剂盒购自原平皓生物制品公司；发光试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology公司；Sephadex G-100和Sepharose CL-4B protein A购自Pharmacia公司。
引物设计与合成：根据已知人BPI基因序列，设计合成第一对引物：P1 5′CAGAATTCATGGTCAACCCT
GGCGTCGTG3′；P2 5′GCAAGCTTCTATTTTGGTCATTAC
TGGCAG3′。5′端引物P1不含N端信号肽序列，含有EcoRⅠ酶切位点和起始密码子ATG；3′端引物P2含有HindⅢ酶切位点。该对引物所扩增的基因为编码BPI N端1～199个氨基酸的基因。根据已知人IgG基因序列，设计合成第二对引物：P3 5′GTAAGCTTCTACATGCCCACCGTGCCCAG3′；P4 5′TCGGATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGAG3′。5′端引物P3含有HindⅢ酶切位点，3′端引物P4含有BamHⅠ酶切位点和TAA终止密码子〔9〕。该对引物所扩增的基因为编码Fcγ1的基因。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。
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RT-PCR扩增获得目的基因：按mRNA提取试剂盒说明，从HL-60细胞和正常人白细胞中提取mRNA后进行RT-PCR。反应程序按RT-PCR一步法试剂盒说明进行，即48℃逆转录45min，94℃变性2min后进行40个PCR循环。循环参数：94℃变性30s，53.5℃复性40s，72℃延伸45s，末次循环后再延伸5min。
取扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳。根据相对分子质量marker标示，从琼脂糖凝胶上切下含目的基因片段的凝胶，按DNA快速纯化回收试剂盒操作步骤纯化回收扩增产物。
pUC18-BPI180、pUC18-BPI420、pUC18-Fcγ1700重组克隆载体的构建、筛选和鉴定：用EcoRⅠ和HindⅢ对BPI600bp进行双酶切获得BPI180bp和BPI420bp2个DNA片段，同时用EcoRⅠ和EcoRⅠ/ HindⅢ分别对pUC18质粒进行酶切反应，前者(EcoRⅠ酶切产物)经去磷酸化处理后，通过连接反应与BPI180bp结合构成pUC18-BPI180重组克隆载体；后者(EcoRⅠ/HindⅢ酶切产物)通过连接反应与BPI420bp结合构成pUC18-BPI420重组克隆载体。用HindⅢ / BamHⅠ分别对Fcγ1700bp和pUC18进行酶切反应后，通过连接反应获得pUC18-Fcγ1700重组克隆载体。上述重组克隆载体转化DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆菌。小提质粒后，分别用EcoRⅠ、EcoRⅠ/ HindⅢ、HindⅢ / BamHⅠ处理进行酶切分析；再用PstⅠ、EcoRⅠ/ PstⅠ、SmaⅠ处理进行酶谱鉴定。以上各步均参照文献〔10〕进行。
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DNA序列分析：从阳性克隆菌中小量提取质粒DNA，以M13 reverse primer为引物进行全自动测序(由北京赛百盛生物工程公司测定)。
pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体的构建：通过EcoRⅠ、EcoRⅠ/ HindⅢ、HindⅢ / BamHⅠ酶切反应，从pUC18-BPI180、pUC18-BPI420和pUC18-Fcγ1700重组克隆载体中酶切获得BPI180bp、BPI420bp、Fcγ1700bp的基因片段。同时用EcoRⅠ/ BamHⅠ酶切pBV220表达载体，然后通过连接反应，首先将BPI420bp和Fcγ1700bp基因片段连接到pBV220上构建成pBV-BPI420-Fcγ1700重组表达载体。该重组表达载体经EcoRⅠ单酶切和去磷酸化处理后再与BPI180bp基因片段进行连接反应，获得pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体，转化E.coli DH5α感受态细胞得到阳性克隆菌。
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BPI23-Fcγ1重组蛋白的诱导表达、提取和鉴定：将阳性克隆菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，30℃条件下振荡培养，当菌液吸光度值(A600)达到0.4～0.6时，立即转入42℃条件下诱导表达，6h后离心收集细菌，在冰浴中以间歇法超声破碎菌体，收集包涵体沉淀。用含4mol/L尿素的洗液反复洗涤包涵体后进行SDS-PAGE〔10〕，用Bio-Rad GS-700薄层扫描仪测定重组蛋白表达率。同时进行Western blot鉴定。
BPI23-Fcγ1重组蛋白的复性、纯化和抗菌活性的初步测定：将包涵体溶于含8mol/L尿素的裂解液中使蛋白变性后，通过Sephadex G-100凝胶层析获得粗制重组蛋白，将其置于pH 8.0复性液(含10mmol/L PBS、5mmol/L还原型谷胱甘肽、2mmol/L氧化型谷胱甘肽)中16℃过夜，透析后通过Sepharose CL-4B protein A亲和层析获得纯化BPI23-Fcγ1重组蛋白。将 100μl E.coli菌液(约104个)与100μl纯化重组蛋白(约0.2μg)混匀后37℃过夜，取一定量混合液涂布普通平板，37℃过夜后计数。同时设阴性对照。
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结果
1.RT-PCR扩增产物的鉴定：HL-60细胞和正常人白细胞mRNA在引物P1/P2和P3/P4指导下，通过RT-PCR反应获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，分别在600bp和700bp处呈现1条与预期产物大小相符的DNA条带(图1)。回收RT-PCR扩增产物(600bp基因片段)用EcoRⅠ/ HindⅢ双酶切后所获酶切产物经琼脂糖凝胶电泳显示，在180bp和420bp处呈现两条与原设计酶切产物相对分子质量大小相符的DNA条带(图略)。
图1 RT-PCR产物
Fig 1. Products from RT-PCR
Note: 1. pBR322 DNA/MspⅠmarker; 2. BPI600bp from RT-PCR; 3. Fcγ1700bp from RT-PCR
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2.pUC18-BPI180、pUC18-BPI420、pUC18-Fcγ1700重组克隆载体的筛选和鉴定：按材料方法中介绍的方法构建pUC18-BPI180、pUC18-BPI420、pUC18-Fcγ1700重组克隆载体，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆菌，小提质粒后经酶切和酶谱分析，发现各酶切片段与预期结果一致(图略)，证实BPI180bp、BPI420bp、Fcγ1700bp已分别整合插入到pUC18相应酶切位点之间。DNA测序结果表明，BPI180bp、BPI420bp和Fcγ1700bp基因片段的核苷酸序列与文献报道一致(图略)。
3.pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体的构建和鉴定：pUC18-BPI420和pUC18-Fcγ1700分别经EcoRⅠ/HindⅢ和HindⅢ / BamHⅠ酶切后，正向插入pBV220 EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间构成pBV-BPI420-Fcγ1700重组表达载体。该重组表达载体经EcoRⅠ/HindⅢ、EcoRⅠ/BamHⅠ、HindⅢ/BamHⅠ酶切后，获得420bp、1100bp、700bp片段与预期结果相符(图略)。
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pBV-BPI420-Fcγ1700重组表达载体经EcoRⅠ单酶切和去磷酸化处理后，与BPI180bp进行连接反应获得pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体，经PCR筛选鉴定(用P1/P4引物扩增BPI600-Fcγ1700片段)，在琼脂糖电泳凝胶中得到1条相对分子质量(Mr)约为1300bp的特异性条带，表明BPI600-Fcγ1700片段已正向插入pBV220 EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间(图略)。pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体构建如图2所示。
4.BPI23-Fcγ1重组蛋白在E.coli DH5α中的表达：含pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体的阳性克隆菌和仅含pBV220表达载体的细菌经温控诱导6h后，按材料方法中介绍的方法提取包涵体，分别取样经SDS-PAGE后，硝酸银染色显示，阳性克隆菌可表达一种Mr为48×103的重组蛋白，而仅含pBV220表达载体的细菌不表达此种重组蛋白(图3)，经薄层扫描凝胶分析表明，重组蛋白的含量约占菌体总蛋白的20%～30%。 6. pBV-BPI600-Fcγ1700(clone 75 expression 48 000)
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Western blot结果显示，Mr为48×103的特异蛋白表达条带可与HRP标记的羊抗人IgG抗体特异结合，因此，可以确认此条带蛋白为外源基因(BPI600-Fcγ1700)编码的产物，即BPI23-Fcγ1重组蛋白(图4)。
5.BPI23-Fcγ1重组蛋白的纯化：将含BPI23-Fcγ1重组蛋白的包涵体经8mol/L尿素变性后，通过Sephadex G-100凝胶层析获得粗制重组蛋白，经复性透析后通过Sepharose CL-4B protein A亲和层析获得纯化BPI23-Fcγ1重组蛋白。SDS-PAGE后硝酸银染色显示，纯化蛋白为一种Mr为48×103的重组蛋白(图5)。
6.复性后纯化BPI23-Fcγ1重组蛋白的抗菌活性：复性后纯化BPI23-Fcγ1重组蛋白与E.coli菌液混匀37℃过夜，涂布普通平板培养后无菌落生长，阴性对照组每块平板上菌落数超过200个，表明复性后纯化重组蛋白有明显的抗菌活性。
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图2 pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体构建
Fig 2. Construction of pBV-BPI600-Fcγ1700
图3 SDS-PAGE 显示BPI23-Fcγ1在E.coli中的表达
Fig 3. SDS-PAGE analysis of the expressed BPI23-Fcγ1 in E.coli
Note: 1. Lower MW protein marker; 2. 36 000 protein marker; 3. pBV220; 4. pBV-BPI600-Fcγ1700(clone 29 no expression); 5. pBV-BPI600-Fcγ1700(clone 74 expression 48 000);
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图4 Western blot显示BPI23-Fcγ1在E.coli中的表达
Fig 4. The expression of BPI23-Fcγ1 in E.coli by Western blot
Note: 1. The product of BPI23-Fcγ1 (clone 29) expression (no expression); 2. The product of BPI23-Fcγ1 (clone 74) expression (48 000); 3. The product of BPI23-Fcγ1 (clone 75) expression (48 000)
讨论
用基因工程技术制备BPI23-Fcγ1重组蛋白是非抗生素抗感染生物制剂研制的一个尝试。该种Ig样重组蛋白不仅具有BPI广谱杀伤G-菌和中和内毒素的作用，而且兼备Ig及其Fc段固定补体、调理作用和较长血清半衰期的特性〔7〕，因此,其抗菌和中和内毒素效应远优于rBPI56和rBPI23。该种抗感染重组蛋白的研制成功将为临床GNS及其休克的防治开拓一条新的途径。
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图5 SDS-PAGE显示纯化的BPI23-Fcγ1
Fig 5. SDS-PAGE analysis of purified BPI23-Fcγ1
Note: 1. pBV-BPI600-Fcγ1700 (purified by protein A, 48 000); 2. pBV-BPI600-Fcγ1700 (purified by protein A, 48 000); 3. Lower MW protein marker; 4. 36 000 protein marker; 5. pBV-BPI600-Fcγ1700 (purified by Sephadex G-100, 48 000)
根据GeneBank中人BPI和IgG Fc基因序列我们设计合成了两对与之相匹配的引物，并采用RT-PCR技术以HL-60细胞和正常人白细胞mRNA为模板，成功地扩增获得了BPI600bp和Fcγ1700bp两个目的基因片段。在实验中，由于选择具有纠错功能的Taq plusⅠ DNA聚合酶参加反应，因此保证了PCR反应的忠实性、特异性和成功率。经酶切、酶谱分析鉴定后，通过连接反应构建成功pUC18-BPI180、pUC18-BPI420和pUC18-Fcγ1700重组克隆载体，测序结果与文献报道相符。试验选择pBV220质粒为表达载体，经酶切和连接反应先后将BPI420bp、Fcγ1700bp基因片段和BPI180bp基因片段正向插入pBV220多克隆酶切位点之间，构建成pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体。E.coli DH5α为转化表达细胞，经温控诱导后能以包涵体形式表达出预期的重组蛋白。复性后经Sepharose CL-4B protein A亲和层析纯化的重组蛋白具有强大抗菌活性。该种重组蛋白能与HRP标记的羊抗人IgG抗体特异性结合(Western blot)，复性后能与protein A结合，表明该种重组蛋白具有Fcγ1结构和生物学功能。
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文献报道，rBPI56或其功能性氨基端片段通常在真核细胞中表达〔11-13〕，这将有助于获得具有生物学活性抗G-菌重组蛋白。但因该种表达方式存在成本高、表达量低等问题而影响其实际应用。用原核细胞表达BPI23-Fcγ1重组蛋白，目前国内外文献中尚未见到有关的报道。
虽然我们在E.coli DH5α细胞中高效表达出BPI23-Fcγ1重组蛋白，但由于复性过程中大量目的蛋白的沉淀丢失，影响了功能性重组蛋白的收获。因此，探寻最佳复性条件、高效获取功能性重组抗菌蛋白是本课题小组下一步研究的主要内容。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570666)
参考文献
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(收稿日期：1999-08-10), http://www.100md.com
单位：柯岩 安云庆(首都医科大学微生物学和免疫学教研室)；杨贵贞(白求恩医科大学免疫学教研室)
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中华微生物学和免疫学杂志000524 【 摘要 】 目的 构建pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体，转化E.coli DH5α诱导表达BPI23-Fcγ1抗菌重组蛋白。 方法 采用RT-PCR技术，从HL-60细胞和正常人白细胞mRNA中扩增编码BPI23和IgG1Fc(Fcγ1)的基因；通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体；转化感受态E.coli DH5α细胞，通过温控诱导表达BPI23-Fcγ1重组蛋白。 结果 (1) RT-PCR获得预期的扩增产物BPI600bp和Fcγ1700bp基因片段；(2) 成功构建pUC18-BPI180、pUC18-BPI420、pUC18-Fcγ1700重组克隆载体，DNA测序结果与文献报道一致；(3) 成功构建pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体，酶切图谱分析与预期结果相符；(4) 转化感受态E.coli DH5α细胞，通过温控诱导表达BPI23-Fcγ1重组蛋白，表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%；(5) 复性后重组蛋白具有抗菌活性和结合蛋白A的作用。 结论 pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体构建成功；在E.coli中得到表达，获得具有抗菌活性的BPI23-Fcγ1重组蛋白。
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革兰阴性细菌败血症(Gram-negative sepsis, GNS)及其休克有很高的死亡率〔1〕，传统抗菌素治疗〔2〕和采用抗脂多糖类脂A单克隆抗体或抗IL-1、TNF单克隆抗体进行免疫治疗均未获得令人满意的效果〔3〕。杀菌/渗透-增强蛋白(bactericidal / permeability increasing protein, BPI) 的研制成功为GNS及其休克的防治带来希望。BPI是微量存在于多形核白细胞颗粒中一种相对分子质量(Mr)为56×103的阳离子抗菌蛋白〔4〕。研究表明，rBPI56或其Mr为23×103的功能性氨基端片段(rBPI23)与天然BPI具有完全相同的生物学作用。它们对G-菌和细菌脂多糖有很高的亲和力，不仅能广谱杀伤G-菌并能有效中和细菌内毒素〔5〕。但药物动力学研究表明，rBPI56或rBPI23在体内的半衰期太短(<1h)〔6〕，因此影响其临床疗效。
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Ig样重组蛋白是采用基因工程技术制备的由某种功能性小分子多肽或蛋白与Ig Fc片段嵌合而成的一种重组蛋白。该种Ig样重组蛋白不仅具有多肽或蛋白所特有的生物学功能，而且兼备Ig固定补体和较长血清半衰期等特性〔7〕。据此，我们希望制备一种由BPI23与IgG Fc片段嵌合而成的重组蛋白，以期获得良好的临床治疗效果。本文主要工作如下：(1)采用RT-PCR技术，分别从HL-60细胞和正常人白细胞mRNA中扩增出编码BPI23和Fcγ1的基因片段(BPI600bp和Fcγ1700bp)；(2)构建pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体，转化E.coli DH5α诱导表达BPI23-Fcγ1重组蛋白；(3)重组蛋白复性和生物学活性的初步测定。
材料与方法
细胞、菌株和质粒载体：HL-60细胞为本实验室保存细胞株；白细胞获自正常人外周血。E.coli DH5α为本实验室保存菌株。克隆载体pUC18质粒购自北方同正生物工程公司；表达载体pBV220质粒〔8〕由中国预防医学科学院病毒所馈赠。
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主要试剂：限制性内切酶(EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ、SmaⅠ)及其它修饰酶购自Promega公司；HRP标记羊抗人IgG抗体购自北京中山生物技术有限公司；mRNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、质粒提取纯化试剂盒购自Promega公司；DNA回收纯化试剂盒购自原平皓生物制品公司；发光试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology公司；Sephadex G-100和Sepharose CL-4B protein A购自Pharmacia公司。
引物设计与合成：根据已知人BPI基因序列，设计合成第一对引物：P1 5′CAGAATTCATGGTCAACCCT
GGCGTCGTG3′；P2 5′GCAAGCTTCTATTTTGGTCATTAC
TGGCAG3′。5′端引物P1不含N端信号肽序列，含有EcoRⅠ酶切位点和起始密码子ATG；3′端引物P2含有HindⅢ酶切位点。该对引物所扩增的基因为编码BPI N端1～199个氨基酸的基因。根据已知人IgG基因序列，设计合成第二对引物：P3 5′GTAAGCTTCTACATGCCCACCGTGCCCAG3′；P4 5′TCGGATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGAG3′。5′端引物P3含有HindⅢ酶切位点，3′端引物P4含有BamHⅠ酶切位点和TAA终止密码子〔9〕。该对引物所扩增的基因为编码Fcγ1的基因。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。
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RT-PCR扩增获得目的基因：按mRNA提取试剂盒说明，从HL-60细胞和正常人白细胞中提取mRNA后进行RT-PCR。反应程序按RT-PCR一步法试剂盒说明进行，即48℃逆转录45min，94℃变性2min后进行40个PCR循环。循环参数：94℃变性30s，53.5℃复性40s，72℃延伸45s，末次循环后再延伸5min。
取扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳。根据相对分子质量marker标示，从琼脂糖凝胶上切下含目的基因片段的凝胶，按DNA快速纯化回收试剂盒操作步骤纯化回收扩增产物。
pUC18-BPI180、pUC18-BPI420、pUC18-Fcγ1700重组克隆载体的构建、筛选和鉴定：用EcoRⅠ和HindⅢ对BPI600bp进行双酶切获得BPI180bp和BPI420bp2个DNA片段，同时用EcoRⅠ和EcoRⅠ/ HindⅢ分别对pUC18质粒进行酶切反应，前者(EcoRⅠ酶切产物)经去磷酸化处理后，通过连接反应与BPI180bp结合构成pUC18-BPI180重组克隆载体；后者(EcoRⅠ/HindⅢ酶切产物)通过连接反应与BPI420bp结合构成pUC18-BPI420重组克隆载体。用HindⅢ / BamHⅠ分别对Fcγ1700bp和pUC18进行酶切反应后，通过连接反应获得pUC18-Fcγ1700重组克隆载体。上述重组克隆载体转化DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆菌。小提质粒后，分别用EcoRⅠ、EcoRⅠ/ HindⅢ、HindⅢ / BamHⅠ处理进行酶切分析；再用PstⅠ、EcoRⅠ/ PstⅠ、SmaⅠ处理进行酶谱鉴定。以上各步均参照文献〔10〕进行。
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DNA序列分析：从阳性克隆菌中小量提取质粒DNA，以M13 reverse primer为引物进行全自动测序(由北京赛百盛生物工程公司测定)。
pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体的构建：通过EcoRⅠ、EcoRⅠ/ HindⅢ、HindⅢ / BamHⅠ酶切反应，从pUC18-BPI180、pUC18-BPI420和pUC18-Fcγ1700重组克隆载体中酶切获得BPI180bp、BPI420bp、Fcγ1700bp的基因片段。同时用EcoRⅠ/ BamHⅠ酶切pBV220表达载体，然后通过连接反应，首先将BPI420bp和Fcγ1700bp基因片段连接到pBV220上构建成pBV-BPI420-Fcγ1700重组表达载体。该重组表达载体经EcoRⅠ单酶切和去磷酸化处理后再与BPI180bp基因片段进行连接反应，获得pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体，转化E.coli DH5α感受态细胞得到阳性克隆菌。
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BPI23-Fcγ1重组蛋白的诱导表达、提取和鉴定：将阳性克隆菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，30℃条件下振荡培养，当菌液吸光度值(A600)达到0.4～0.6时，立即转入42℃条件下诱导表达，6h后离心收集细菌，在冰浴中以间歇法超声破碎菌体，收集包涵体沉淀。用含4mol/L尿素的洗液反复洗涤包涵体后进行SDS-PAGE〔10〕，用Bio-Rad GS-700薄层扫描仪测定重组蛋白表达率。同时进行Western blot鉴定。
BPI23-Fcγ1重组蛋白的复性、纯化和抗菌活性的初步测定：将包涵体溶于含8mol/L尿素的裂解液中使蛋白变性后，通过Sephadex G-100凝胶层析获得粗制重组蛋白，将其置于pH 8.0复性液(含10mmol/L PBS、5mmol/L还原型谷胱甘肽、2mmol/L氧化型谷胱甘肽)中16℃过夜，透析后通过Sepharose CL-4B protein A亲和层析获得纯化BPI23-Fcγ1重组蛋白。将 100μl E.coli菌液(约104个)与100μl纯化重组蛋白(约0.2μg)混匀后37℃过夜，取一定量混合液涂布普通平板，37℃过夜后计数。同时设阴性对照。
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结果
1.RT-PCR扩增产物的鉴定：HL-60细胞和正常人白细胞mRNA在引物P1/P2和P3/P4指导下，通过RT-PCR反应获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，分别在600bp和700bp处呈现1条与预期产物大小相符的DNA条带(图1)。回收RT-PCR扩增产物(600bp基因片段)用EcoRⅠ/ HindⅢ双酶切后所获酶切产物经琼脂糖凝胶电泳显示，在180bp和420bp处呈现两条与原设计酶切产物相对分子质量大小相符的DNA条带(图略)。
图1 RT-PCR产物
Fig 1. Products from RT-PCR
Note: 1. pBR322 DNA/MspⅠmarker; 2. BPI600bp from RT-PCR; 3. Fcγ1700bp from RT-PCR
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2.pUC18-BPI180、pUC18-BPI420、pUC18-Fcγ1700重组克隆载体的筛选和鉴定：按材料方法中介绍的方法构建pUC18-BPI180、pUC18-BPI420、pUC18-Fcγ1700重组克隆载体，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆菌，小提质粒后经酶切和酶谱分析，发现各酶切片段与预期结果一致(图略)，证实BPI180bp、BPI420bp、Fcγ1700bp已分别整合插入到pUC18相应酶切位点之间。DNA测序结果表明，BPI180bp、BPI420bp和Fcγ1700bp基因片段的核苷酸序列与文献报道一致(图略)。
3.pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体的构建和鉴定：pUC18-BPI420和pUC18-Fcγ1700分别经EcoRⅠ/HindⅢ和HindⅢ / BamHⅠ酶切后，正向插入pBV220 EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间构成pBV-BPI420-Fcγ1700重组表达载体。该重组表达载体经EcoRⅠ/HindⅢ、EcoRⅠ/BamHⅠ、HindⅢ/BamHⅠ酶切后，获得420bp、1100bp、700bp片段与预期结果相符(图略)。
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pBV-BPI420-Fcγ1700重组表达载体经EcoRⅠ单酶切和去磷酸化处理后，与BPI180bp进行连接反应获得pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体，经PCR筛选鉴定(用P1/P4引物扩增BPI600-Fcγ1700片段)，在琼脂糖电泳凝胶中得到1条相对分子质量(Mr)约为1300bp的特异性条带，表明BPI600-Fcγ1700片段已正向插入pBV220 EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间(图略)。pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体构建如图2所示。
4.BPI23-Fcγ1重组蛋白在E.coli DH5α中的表达：含pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体的阳性克隆菌和仅含pBV220表达载体的细菌经温控诱导6h后，按材料方法中介绍的方法提取包涵体，分别取样经SDS-PAGE后，硝酸银染色显示，阳性克隆菌可表达一种Mr为48×103的重组蛋白，而仅含pBV220表达载体的细菌不表达此种重组蛋白(图3)，经薄层扫描凝胶分析表明，重组蛋白的含量约占菌体总蛋白的20%～30%。 6. pBV-BPI600-Fcγ1700(clone 75 expression 48 000)
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Western blot结果显示，Mr为48×103的特异蛋白表达条带可与HRP标记的羊抗人IgG抗体特异结合，因此，可以确认此条带蛋白为外源基因(BPI600-Fcγ1700)编码的产物，即BPI23-Fcγ1重组蛋白(图4)。
5.BPI23-Fcγ1重组蛋白的纯化：将含BPI23-Fcγ1重组蛋白的包涵体经8mol/L尿素变性后，通过Sephadex G-100凝胶层析获得粗制重组蛋白，经复性透析后通过Sepharose CL-4B protein A亲和层析获得纯化BPI23-Fcγ1重组蛋白。SDS-PAGE后硝酸银染色显示，纯化蛋白为一种Mr为48×103的重组蛋白(图5)。
6.复性后纯化BPI23-Fcγ1重组蛋白的抗菌活性：复性后纯化BPI23-Fcγ1重组蛋白与E.coli菌液混匀37℃过夜，涂布普通平板培养后无菌落生长，阴性对照组每块平板上菌落数超过200个，表明复性后纯化重组蛋白有明显的抗菌活性。
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图2 pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体构建
Fig 2. Construction of pBV-BPI600-Fcγ1700
图3 SDS-PAGE 显示BPI23-Fcγ1在E.coli中的表达
Fig 3. SDS-PAGE analysis of the expressed BPI23-Fcγ1 in E.coli
Note: 1. Lower MW protein marker; 2. 36 000 protein marker; 3. pBV220; 4. pBV-BPI600-Fcγ1700(clone 29 no expression); 5. pBV-BPI600-Fcγ1700(clone 74 expression 48 000);
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图4 Western blot显示BPI23-Fcγ1在E.coli中的表达
Fig 4. The expression of BPI23-Fcγ1 in E.coli by Western blot
Note: 1. The product of BPI23-Fcγ1 (clone 29) expression (no expression); 2. The product of BPI23-Fcγ1 (clone 74) expression (48 000); 3. The product of BPI23-Fcγ1 (clone 75) expression (48 000)
讨论
用基因工程技术制备BPI23-Fcγ1重组蛋白是非抗生素抗感染生物制剂研制的一个尝试。该种Ig样重组蛋白不仅具有BPI广谱杀伤G-菌和中和内毒素的作用，而且兼备Ig及其Fc段固定补体、调理作用和较长血清半衰期的特性〔7〕，因此,其抗菌和中和内毒素效应远优于rBPI56和rBPI23。该种抗感染重组蛋白的研制成功将为临床GNS及其休克的防治开拓一条新的途径。
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图5 SDS-PAGE显示纯化的BPI23-Fcγ1
Fig 5. SDS-PAGE analysis of purified BPI23-Fcγ1
Note: 1. pBV-BPI600-Fcγ1700 (purified by protein A, 48 000); 2. pBV-BPI600-Fcγ1700 (purified by protein A, 48 000); 3. Lower MW protein marker; 4. 36 000 protein marker; 5. pBV-BPI600-Fcγ1700 (purified by Sephadex G-100, 48 000)
根据GeneBank中人BPI和IgG Fc基因序列我们设计合成了两对与之相匹配的引物，并采用RT-PCR技术以HL-60细胞和正常人白细胞mRNA为模板，成功地扩增获得了BPI600bp和Fcγ1700bp两个目的基因片段。在实验中，由于选择具有纠错功能的Taq plusⅠ DNA聚合酶参加反应，因此保证了PCR反应的忠实性、特异性和成功率。经酶切、酶谱分析鉴定后，通过连接反应构建成功pUC18-BPI180、pUC18-BPI420和pUC18-Fcγ1700重组克隆载体，测序结果与文献报道相符。试验选择pBV220质粒为表达载体，经酶切和连接反应先后将BPI420bp、Fcγ1700bp基因片段和BPI180bp基因片段正向插入pBV220多克隆酶切位点之间，构建成pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体。E.coli DH5α为转化表达细胞，经温控诱导后能以包涵体形式表达出预期的重组蛋白。复性后经Sepharose CL-4B protein A亲和层析纯化的重组蛋白具有强大抗菌活性。该种重组蛋白能与HRP标记的羊抗人IgG抗体特异性结合(Western blot)，复性后能与protein A结合，表明该种重组蛋白具有Fcγ1结构和生物学功能。
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文献报道，rBPI56或其功能性氨基端片段通常在真核细胞中表达〔11-13〕，这将有助于获得具有生物学活性抗G-菌重组蛋白。但因该种表达方式存在成本高、表达量低等问题而影响其实际应用。用原核细胞表达BPI23-Fcγ1重组蛋白，目前国内外文献中尚未见到有关的报道。
虽然我们在E.coli DH5α细胞中高效表达出BPI23-Fcγ1重组蛋白，但由于复性过程中大量目的蛋白的沉淀丢失，影响了功能性重组蛋白的收获。因此，探寻最佳复性条件、高效获取功能性重组抗菌蛋白是本课题小组下一步研究的主要内容。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570666)
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(收稿日期：1999-08-10), http://www.100md.com