猪卵透明带-3α蛋白在大肠杆菌中表达的研究
作者：徐万祥 邱德义 贾小明 申庆祥 顾少华 倪晓华 刘建平 牟忠明 谢毅
单位：徐万祥(上海市计划生育科学研究所，上海 200032)；邱德义(上海市计划生育科学研究所，上海 200032)；贾小明(浙江大学华家池校区生物系， 杭州 310029)；申庆祥(上海市计划生育科学研究所，上海 200032)
关键词：猪ZP3αcDNA；大肠杆菌；基因表达
中国免疫学杂志000607 摘 要 目的：通过原核表达系统获得研制ZP疫苗的靶抗原。方法：用PCR方法删除猪卵透明带-3α(pZP3α)cDNA 5'端非编码区碱基顺序。在扩增的该基因5'端小片段与双酶切3'端大片段在ApaI 位点相连后，通过双酶切位点将读框完整的目的基因定向插入pBV221表达质粒PRPL启动子下游的多克隆区。结果： 此重组表达质粒转化宿主菌后经热诱导培养，可在SDS-PAGE胶上观察到61 kD的特异蛋白表达条带，而且它在Western blot 鉴定实验中能被抗pZP IgGs识别。结论：非糖基化天然pZP3α蛋白的可获得性将有助于研制和评价基于pZP3α蛋白的避孕疫苗。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392. 11
Study on the expression of porcine zona pellucida (ZP)-3α in a prokaryotic system
XU Wan-Xiang, QIU De-Yi, JIA Xiao-Ming et al
(Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032)
Abstract Objective:To provide the target antigen for the development of a ZP vaccine by using a prokaryotic expression system. Methods:To obtain non-fusion expression, the fragment (249 bp) from ATG to Apa Isite of pZP3α cDNA, which was deleted the 5'-terminus non-coding region, was amplified by PCR. The amplified sequenced EcoRI- Apa α fragment was ligased with the 3'-terminus Apa I -IαSal I fragment of pZP3α cDNA from pZ58 plasmid, and then the reconstructed pZP3α with a complete open reading frame was inserted in frame downstream of the PRPL promoter in a pBV221 vector. Results:After transformation of E.coli BL21 (DE3) and thermo-induction, the pZP3α protein with 61 kD was expressed at the level of more than 10% of the total cellular proteins and the specific protein band on SDS-PAGE gel could be recognized by anti-porcine ZP IgGs in Western blotting. Conclusion: The availability of native and non-glycosylated pZP3α protein will help in the development and evaluation of a contraceptive vaccine based on pZP3α protein.
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Key words Porcine ZP3α E.coli Gene expression
哺乳动物卵透明带(ZP)一直被看作抗受精避孕疫苗的潜在靶抗原，也是生殖生物学界研究精卵识别、结合和穿透等事件以及精子顶体反应的重要材料[1，2]。但由于一般不易分离纯化天然的ZP，特别是它的3种酸性糖蛋白组分，因而阻碍了ZP避孕疫苗研制的进程，包括对精卵受精机制相关细节的深入阐明。随着近年来各物种ZP组分的3个cDNA相继克隆，试图通过基因工程大量获得所需要的ZP蛋白组分也成了ZP研究的一个热点。先前我们已报道了pZP3α cDNA 以融合蛋白形式在大肠杆菌中表达的研究[3]。鉴于截短 β-半乳糖苷酶，故本研究改而采用非糖基化pZP3α融合蛋白的分子量(约102 kD)较大，表达量未达到所期待的水平，pZP3α蛋白的直接表达途径。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 质粒和菌株 pBluescript KS (pBS) 质粒为测序载体，E. coli BL21(DE3)为质粒转化受体菌。PRPL启动子表达载体pBV220为预防医学科学院病毒所张智清教授构建。PBV220的衍生质粒pBV221由中科院发育所孙方臻博士惠赠。含全长pZP3α cDNA 的pZ58质粒(pBS/pZP3α)由美国Zonagen Inc. Harris博士馈赠。
1.2 试剂和酶 EcoRI、ApaI和SalI限制性内切酶以及T4 DNA 连接酶购自Boeringer Mannheim公司，Taq DNA聚合酶购自上海复日公司，核酸和蛋白质分子量标准以及羊抗兔IgG/HRP购自华美生物工程公司。其它生化试剂均为国产分析纯。
1.3 兔抗猪ZP IgGs制备 见文献[3,4]。
1.4 PCR扩增 根据发表的pZP3α cDNA序列及PCR引物设计原则，设计一对PCR引物[5]。上游引物P1：5'-GGGAATTCATGTGGTTGCGGCCGTCC-3' (ATG前引入EcoRI位点)；下游引物P2：5'-CTCCCATGGAGCTGCCTGGG-3' (3'端后紧接ApaI位点)，以pZ58质粒为模板进行PCR扩增，反应参数如下：94℃，1 min;55 ℃, 40 s; 72 ℃, 30 s, 共25轮循环。
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1.5 PCR产物的DNA测序鉴定 PCR 产物(271 bp)经EcoRI和ApaI双酶切的片段(pZP3α', 249 bp)被定向插入pBS测序载体。依据蓝白斑筛选的重组克隆被扩增培养后用DNA纯化盒提取pBS/pZP3α'质粒, 在ABI373A型DNA测序仪上进行生物素荧光标记DNA序列自动分析。
1.6 删除5'端非编码区的pZP3α* cDNA 以及pBV220- pZP3α*和pBV221- pZP3α*重组表达质粒的构建 删除5'端非编码区的pZP3α' (EcoRI-ApaI)小片段与双酶切自pZ58质粒的pZP3α" (ApaI-SalI)大片段(1 445 bp, 含原cDNA 3'端EcoRI位点与pBS多克隆区SalI位点之间的27 bp)在ApaI位点相连，然后将此读框完整的新的pZP3α* cDNA(1 694 bp) 定向重组插入pBV表达质粒。酶切、片段回收、连接、转化、质粒提取和电泳鉴定等操作均参照文献[6]或相应试剂盒说明书进行。
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1.7 工程菌BL21/pBV221- pZP3α*的热诱导表达 经转化构建成BL21(DE3)/pBV221- pZP3α*工程菌后，挑其单菌落接种于加入氨苄青霉素(Ap)的3 ml LB培养液，于30C振荡培养过夜，翌日晨以1/50 (V/V)的比例转接入加Ap的50 ml LB 培养液，于30C继续培养2～3 h, 待菌液的A600吸光度达到0.7左右时升温至42 ℃ ，振荡培养4 h后收集菌体。
1.8 猪ZP3α蛋白表达产物的SDS-PAGE分析和蛋白印迹鉴定 见文献[3-6]。
2 结果
2.1 pZP3α cDNA 5'端非编码区的删除 通过原核生物直接表达目的蛋白，存在表达载体上的SD序列与目的基因ATG之间距离的限制。选用PCR方法删除pZP3α cDNA 5'端的非编码碱基(33 bp)。由于目的基因长1 700 bp[3,5], 所以为防止PCR过程中可能产生的碱基突变，仅扩增了该基因读框起始密码ATG到前部ApaI单一酶切位点的短片段(271 bp)，经双酶切后此EcoRI-ApaI片段(pZP3α', 249 bp)被定向插入pBS质粒进行DNA测序分析(图1)。酶切鉴定结果见图2。然后酶切纯化来自pBS-pZP3α'质粒的EcoRI-ApaI pZP3α' 短片段以及来自pZ58质粒中pZP3α cDNA 3'端的ApaI-SalI长片段(pZP3α", 1 445 bp)，通过DNA连接酶在ApaI位点使之相连接，最终构建成删除了原克隆基因5'端大部分非编码碱基的pZP3α* cDNA。
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图1 pZP3α基因5'端PCR片段的DNA测序图谱
Fig.1 Sequencing result for the PCR product of pZP3α cDNA
Note: "↑" and "↓", indicate the sequenced PCR fragment from EcoRI to ApaI site
图2 PCR片段的5%聚丙烯酰胺凝胶电泳
Fig.2 5% PAGE analysis of the PCR fragment
Note： 1. 100 bp ladder；2. The PCR fragment digested by EcoRI and ApaI；
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3. The PCR fragment from pBV221- pZP3α after digestion by EcoRI-ApaI；
4. The ψ x 174/Hae III marker
2.2 pBV220- pZP3α* 和pBV221-pZP3α*重组表达质粒的构建 经琼脂糖凝胶电泳回收的具有EcoRI和SalI粘性末端的pZP3α'-pZP3α连接片段 pZP3α*，在DNA连接酶的作用下，被定向重组插入pBV220和pBV221表达载体PRPL启动子下游多克隆区的EcoRI和SalI位点。连接反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后，在加入氨苄青霉素(Ap)的LB固体平板上挑选若干单菌落进行扩增培养，最后借助DNA纯化试剂盒抽提重组质粒进行酶切鉴定(图3)，从而确定BL21(DE3)/pBV220- pZP3α*和BL21(DE3)/pBV221- pZP3α*工程菌。
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图3 重组质粒pBV221- pZP3α的酶切鉴定
Fig.3 1.2% agarose gel analysis of restricted fragments from pBV221-pZP3α* recombinant plasmid
Note: 1.λ DNA /EcoRI+HidIII marker；2. pBV221-pZP3α* digested by EcoRI+ApaI；
3. pBV221-pZP3α*digested by EcoRI；4. pBV221-pZP3α digested by SalI；
5. pBV221 digested by EcoRI；6. PBS/ pZP3α (pZ58) digested by ApaI+SalI；
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7. The PCR fragment digested by EcoRI+ApaI
2.3 pZP3α蛋白在大肠杆菌中的直接表达 pBV221是pBV220的衍生表达质粒[7], 重组插入pBV221 PRPL启动子下游的目的基因直接表达受温度变化调控。收集的热诱导BL21(DE3)/pBV221- pZP3α*工程菌菌体经裂解液处理后，取样作12% SDS-PAGE分析，结果在61 kD处可发现有别于对照菌蛋白带谱的pZP3α蛋白特异表达带(图4)。薄层凝胶吸光度扫描结果显示此表达蛋白占菌体总蛋白的10%以上。
图4 pZP3α表达产物的SDS-PAGE分析和免疫印迹鉴定
Fig.4 SDS-PAGE analysis and immunoblot identification of pZP3α
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expression product in E.coli BL21(DE3)
Note: 1 and 8. E. coli BL21 harboring pBV221 induced at 42C；
2 and 7. E. coli BL21 induced at 42C；3 and 6. E. coli BL21 harboring
pBV221- pZP3α* cultured at 30℃；4 and 5. E. coli BL21 harboring
pBV221- pZP3α* induced at 42C；M.Standard molecular weight marker
2.4 pZP3α蛋白表达产物的免疫原性鉴定 为了证实SDS-PAGE凝胶上有别于对照的特异条带就是pZP3α蛋白表达产物，我们进行了Western blot鉴定。在将上样样品相同的另一半凝胶蛋白电泳条带转印到醋酸纤维素膜上后，用含pZP3α抗体的兔抗猪ZP IgGs 和羊抗兔IgGs/HRP分别进行一抗和二抗反应，结果在工程菌诱导表达印迹栏可清晰地看到与SDS-PAGE凝胶上特异条带平行一致的阳性反应显色带，而3种对照菌蛋白带谱印迹栏均无阳性反应信号(图4)，这表明pZP3α蛋白在BL21(DE3)/pBV221-pZP3α*工程菌中确实获得了表达。
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3 讨论
编码536个氨基酸残基的pZP3α cDNA全长1 700 bp，包括该基因5'端38 bp非编码区和3'端非编码区[3,5]。考虑到PCR扩增基因有一定的错误率[8]，且不能一次完成约1 600 bp扩增片段的DNA测序鉴定，所以我们在本研究中分两步完成删除5'端非编码33 bp的pZP3α* cDNA构建，即先PCR扩增该基因5'端从起始密码 (正向引物在它之前重新引入EcoRI位点)到ApaI位点(反向引物设计在紧靠着它的下游)的pZP3α'短片段，再与双酶切3'端ApaI-SalI pZP3α"长片段相连接。原pZP3α cDNA 3'端克隆位点也是EcoRI位点，因此为了防止pZP3α'和pZP3α"在EcoRI位点的自连以及便于连接片段pZP3α*定向插入pBV载体，我们选用了pZ58重组质粒中该基因3'端EcoRI位点后pBS克隆载体多克隆区EcoRI后的SalI位点(相距27 bps)。
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pBV220是国内应用广泛的热诱导表达质粒，表达量高时目的蛋白表达量可达菌体总蛋白的30%～70%。但在本研究中，尽管转化过多种大肠杆菌宿主菌，pBV220- pZP3α*重组表达质粒均未形成在SDS-PAGE中可辨别的特异蛋白表达。pZP3α*基因与它的衍生质粒pBV221重组后，在BL21(DE3)宿主菌中获得了高于10%的特异表达。虽然这一表达量并非理想，不过与先前约5%的融合蛋白(102 kD)表达水平相比[3]，去除融合蛋白内约占一半残基的截短 β-半乳糖苷酶，pZP3α目的蛋白表达还是提高了近4倍。至于目的蛋白表达相对较低，推测pZP3α蛋白本身分子量较大和其真核生物编码基因中含有相当数量大肠杆菌稀有密码子是影响翻译水平的可能因素。另外有报道说目的基因3'端序列长度也会形成表达水平差异[9]，因此pZP3α* cDNA 3'端非编码区包括EcoRI-SalI之间碱基数在内的76 bp非编码碱基是否也是一个原因，尚有待进一步探讨。
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在SDS-PAGE中pZP3α蛋白表达主带显示61 kD电泳分子量，这似乎与已报道的成熟去糖基化pZP3α蛋白分子量为37 kD有很大差异[10]，但考虑到本研究表达的目的蛋白含21个残基信号肽和C端74个残基跨膜区(成熟蛋白一般不存在这些肽段[11-13]), 这一分子量结果应该是真实的(该基因编码的全长pZP3α蛋白的理论分子量为59 kD)。本研究首次报道了ZP糖蛋白组分在原核生物中的直接表达。这一尝试为研究去糖基化ZP蛋白组分的抗生育疫苗奠定了基础。
国家计划生育药具重点实验室资助
作者简介：徐万祥，50岁，副研究员，主要从事生殖免疫学研究；
谢毅，35岁，教授，主要从事分子生物学研究
顾少华(复旦大学生命科学学院遗传研究所遗传工程国家重点实验室， 上海 200433)
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倪晓华(安徽皖南医学院， 芜湖 241001)
刘建平(复旦大学生命科学学院遗传研究所遗传工程国家重点实验室， 上海 200433)
牟忠明(复旦大学生命科学学院遗传研究所遗传工程国家重点实验室， 上海 200433)
谢毅(复旦大学生命科学学院遗传研究所遗传工程国家重点实验室， 上海 200433)
参考文献
1，Skinner S M, Ndolo T M, Dunber B S. Zona pellucida antigens: Targets for contraceptive vaccines. Am J Reprod Immunol, 1996; 35: 163
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3，徐万祥，谢 毅，王 健 et al. 猪卵透明带-3α基因在大肠杆菌中的融合表达和鉴定.中华微生物学和免疫学杂志， 1999；19(2)：137
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5，Yurewicz E C, Hibler D, Fontenot G K et al. Nucleotide sequence of cDNA encoding ZP3α, a sperm-binding glycoprotein from zona pellucida of pig oocyte. Biochim Biophys Acta, 1993; 1174: 211
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9，赵 东，卢柏松，陈 琳 et al. 重组人血小板生成素在大肠杆菌中表达的研究.中国生物化学与分子生物学报， 1999；15(1): 19
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12，Hosaka M, Nagahama M, Kim W et al. Arg-X-Lys/Arg-Arg motif as a signal for precursor cleavage-catalyzed by furin within the constitutive secretary pathway. J Biol Chem, 1991; 266: 12127
13，Kaul R, Afzalpurkar A, Gupta S K. Expression of bonnet monkey (Macaca radiata) zona pellucida-3 (ZP3) in a prokaryotic system and its immunogenicity. Mol Reprod Dev, 1997; 47: 140
收稿1999-09-16 修回2000-02-12, http://www.100md.com
单位：徐万祥(上海市计划生育科学研究所，上海 200032)；邱德义(上海市计划生育科学研究所，上海 200032)；贾小明(浙江大学华家池校区生物系， 杭州 310029)；申庆祥(上海市计划生育科学研究所，上海 200032)
关键词：猪ZP3αcDNA；大肠杆菌；基因表达
中国免疫学杂志000607 摘 要 目的：通过原核表达系统获得研制ZP疫苗的靶抗原。方法：用PCR方法删除猪卵透明带-3α(pZP3α)cDNA 5'端非编码区碱基顺序。在扩增的该基因5'端小片段与双酶切3'端大片段在ApaI 位点相连后，通过双酶切位点将读框完整的目的基因定向插入pBV221表达质粒PRPL启动子下游的多克隆区。结果： 此重组表达质粒转化宿主菌后经热诱导培养，可在SDS-PAGE胶上观察到61 kD的特异蛋白表达条带，而且它在Western blot 鉴定实验中能被抗pZP IgGs识别。结论：非糖基化天然pZP3α蛋白的可获得性将有助于研制和评价基于pZP3α蛋白的避孕疫苗。
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中国图书分类号 R392. 11
Study on the expression of porcine zona pellucida (ZP)-3α in a prokaryotic system
XU Wan-Xiang, QIU De-Yi, JIA Xiao-Ming et al
(Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032)
Abstract Objective:To provide the target antigen for the development of a ZP vaccine by using a prokaryotic expression system. Methods:To obtain non-fusion expression, the fragment (249 bp) from ATG to Apa Isite of pZP3α cDNA, which was deleted the 5'-terminus non-coding region, was amplified by PCR. The amplified sequenced EcoRI- Apa α fragment was ligased with the 3'-terminus Apa I -IαSal I fragment of pZP3α cDNA from pZ58 plasmid, and then the reconstructed pZP3α with a complete open reading frame was inserted in frame downstream of the PRPL promoter in a pBV221 vector. Results:After transformation of E.coli BL21 (DE3) and thermo-induction, the pZP3α protein with 61 kD was expressed at the level of more than 10% of the total cellular proteins and the specific protein band on SDS-PAGE gel could be recognized by anti-porcine ZP IgGs in Western blotting. Conclusion: The availability of native and non-glycosylated pZP3α protein will help in the development and evaluation of a contraceptive vaccine based on pZP3α protein.
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Key words Porcine ZP3α E.coli Gene expression
哺乳动物卵透明带(ZP)一直被看作抗受精避孕疫苗的潜在靶抗原，也是生殖生物学界研究精卵识别、结合和穿透等事件以及精子顶体反应的重要材料[1，2]。但由于一般不易分离纯化天然的ZP，特别是它的3种酸性糖蛋白组分，因而阻碍了ZP避孕疫苗研制的进程，包括对精卵受精机制相关细节的深入阐明。随着近年来各物种ZP组分的3个cDNA相继克隆，试图通过基因工程大量获得所需要的ZP蛋白组分也成了ZP研究的一个热点。先前我们已报道了pZP3α cDNA 以融合蛋白形式在大肠杆菌中表达的研究[3]。鉴于截短 β-半乳糖苷酶，故本研究改而采用非糖基化pZP3α融合蛋白的分子量(约102 kD)较大，表达量未达到所期待的水平，pZP3α蛋白的直接表达途径。
1 材料与方法
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1.2 试剂和酶 EcoRI、ApaI和SalI限制性内切酶以及T4 DNA 连接酶购自Boeringer Mannheim公司，Taq DNA聚合酶购自上海复日公司，核酸和蛋白质分子量标准以及羊抗兔IgG/HRP购自华美生物工程公司。其它生化试剂均为国产分析纯。
1.3 兔抗猪ZP IgGs制备 见文献[3,4]。
1.4 PCR扩增 根据发表的pZP3α cDNA序列及PCR引物设计原则，设计一对PCR引物[5]。上游引物P1：5'-GGGAATTCATGTGGTTGCGGCCGTCC-3' (ATG前引入EcoRI位点)；下游引物P2：5'-CTCCCATGGAGCTGCCTGGG-3' (3'端后紧接ApaI位点)，以pZ58质粒为模板进行PCR扩增，反应参数如下：94℃，1 min;55 ℃, 40 s; 72 ℃, 30 s, 共25轮循环。
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1.5 PCR产物的DNA测序鉴定 PCR 产物(271 bp)经EcoRI和ApaI双酶切的片段(pZP3α', 249 bp)被定向插入pBS测序载体。依据蓝白斑筛选的重组克隆被扩增培养后用DNA纯化盒提取pBS/pZP3α'质粒, 在ABI373A型DNA测序仪上进行生物素荧光标记DNA序列自动分析。
1.6 删除5'端非编码区的pZP3α* cDNA 以及pBV220- pZP3α*和pBV221- pZP3α*重组表达质粒的构建 删除5'端非编码区的pZP3α' (EcoRI-ApaI)小片段与双酶切自pZ58质粒的pZP3α" (ApaI-SalI)大片段(1 445 bp, 含原cDNA 3'端EcoRI位点与pBS多克隆区SalI位点之间的27 bp)在ApaI位点相连，然后将此读框完整的新的pZP3α* cDNA(1 694 bp) 定向重组插入pBV表达质粒。酶切、片段回收、连接、转化、质粒提取和电泳鉴定等操作均参照文献[6]或相应试剂盒说明书进行。
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1.7 工程菌BL21/pBV221- pZP3α*的热诱导表达 经转化构建成BL21(DE3)/pBV221- pZP3α*工程菌后，挑其单菌落接种于加入氨苄青霉素(Ap)的3 ml LB培养液，于30C振荡培养过夜，翌日晨以1/50 (V/V)的比例转接入加Ap的50 ml LB 培养液，于30C继续培养2～3 h, 待菌液的A600吸光度达到0.7左右时升温至42 ℃ ，振荡培养4 h后收集菌体。
1.8 猪ZP3α蛋白表达产物的SDS-PAGE分析和蛋白印迹鉴定 见文献[3-6]。
2 结果
2.1 pZP3α cDNA 5'端非编码区的删除 通过原核生物直接表达目的蛋白，存在表达载体上的SD序列与目的基因ATG之间距离的限制。选用PCR方法删除pZP3α cDNA 5'端的非编码碱基(33 bp)。由于目的基因长1 700 bp[3,5], 所以为防止PCR过程中可能产生的碱基突变，仅扩增了该基因读框起始密码ATG到前部ApaI单一酶切位点的短片段(271 bp)，经双酶切后此EcoRI-ApaI片段(pZP3α', 249 bp)被定向插入pBS质粒进行DNA测序分析(图1)。酶切鉴定结果见图2。然后酶切纯化来自pBS-pZP3α'质粒的EcoRI-ApaI pZP3α' 短片段以及来自pZ58质粒中pZP3α cDNA 3'端的ApaI-SalI长片段(pZP3α", 1 445 bp)，通过DNA连接酶在ApaI位点使之相连接，最终构建成删除了原克隆基因5'端大部分非编码碱基的pZP3α* cDNA。
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图1 pZP3α基因5'端PCR片段的DNA测序图谱
Fig.1 Sequencing result for the PCR product of pZP3α cDNA
Note: "↑" and "↓", indicate the sequenced PCR fragment from EcoRI to ApaI site
图2 PCR片段的5%聚丙烯酰胺凝胶电泳
Fig.2 5% PAGE analysis of the PCR fragment
Note： 1. 100 bp ladder；2. The PCR fragment digested by EcoRI and ApaI；
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3. The PCR fragment from pBV221- pZP3α after digestion by EcoRI-ApaI；
4. The ψ x 174/Hae III marker
2.2 pBV220- pZP3α* 和pBV221-pZP3α*重组表达质粒的构建 经琼脂糖凝胶电泳回收的具有EcoRI和SalI粘性末端的pZP3α'-pZP3α连接片段 pZP3α*，在DNA连接酶的作用下，被定向重组插入pBV220和pBV221表达载体PRPL启动子下游多克隆区的EcoRI和SalI位点。连接反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后，在加入氨苄青霉素(Ap)的LB固体平板上挑选若干单菌落进行扩增培养，最后借助DNA纯化试剂盒抽提重组质粒进行酶切鉴定(图3)，从而确定BL21(DE3)/pBV220- pZP3α*和BL21(DE3)/pBV221- pZP3α*工程菌。
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图3 重组质粒pBV221- pZP3α的酶切鉴定
Fig.3 1.2% agarose gel analysis of restricted fragments from pBV221-pZP3α* recombinant plasmid
Note: 1.λ DNA /EcoRI+HidIII marker；2. pBV221-pZP3α* digested by EcoRI+ApaI；
3. pBV221-pZP3α*digested by EcoRI；4. pBV221-pZP3α digested by SalI；
5. pBV221 digested by EcoRI；6. PBS/ pZP3α (pZ58) digested by ApaI+SalI；
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7. The PCR fragment digested by EcoRI+ApaI
2.3 pZP3α蛋白在大肠杆菌中的直接表达 pBV221是pBV220的衍生表达质粒[7], 重组插入pBV221 PRPL启动子下游的目的基因直接表达受温度变化调控。收集的热诱导BL21(DE3)/pBV221- pZP3α*工程菌菌体经裂解液处理后，取样作12% SDS-PAGE分析，结果在61 kD处可发现有别于对照菌蛋白带谱的pZP3α蛋白特异表达带(图4)。薄层凝胶吸光度扫描结果显示此表达蛋白占菌体总蛋白的10%以上。
图4 pZP3α表达产物的SDS-PAGE分析和免疫印迹鉴定
Fig.4 SDS-PAGE analysis and immunoblot identification of pZP3α
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expression product in E.coli BL21(DE3)
Note: 1 and 8. E. coli BL21 harboring pBV221 induced at 42C；
2 and 7. E. coli BL21 induced at 42C；3 and 6. E. coli BL21 harboring
pBV221- pZP3α* cultured at 30℃；4 and 5. E. coli BL21 harboring
pBV221- pZP3α* induced at 42C；M.Standard molecular weight marker
2.4 pZP3α蛋白表达产物的免疫原性鉴定 为了证实SDS-PAGE凝胶上有别于对照的特异条带就是pZP3α蛋白表达产物，我们进行了Western blot鉴定。在将上样样品相同的另一半凝胶蛋白电泳条带转印到醋酸纤维素膜上后，用含pZP3α抗体的兔抗猪ZP IgGs 和羊抗兔IgGs/HRP分别进行一抗和二抗反应，结果在工程菌诱导表达印迹栏可清晰地看到与SDS-PAGE凝胶上特异条带平行一致的阳性反应显色带，而3种对照菌蛋白带谱印迹栏均无阳性反应信号(图4)，这表明pZP3α蛋白在BL21(DE3)/pBV221-pZP3α*工程菌中确实获得了表达。
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3 讨论
编码536个氨基酸残基的pZP3α cDNA全长1 700 bp，包括该基因5'端38 bp非编码区和3'端非编码区[3,5]。考虑到PCR扩增基因有一定的错误率[8]，且不能一次完成约1 600 bp扩增片段的DNA测序鉴定，所以我们在本研究中分两步完成删除5'端非编码33 bp的pZP3α* cDNA构建，即先PCR扩增该基因5'端从起始密码 (正向引物在它之前重新引入EcoRI位点)到ApaI位点(反向引物设计在紧靠着它的下游)的pZP3α'短片段，再与双酶切3'端ApaI-SalI pZP3α"长片段相连接。原pZP3α cDNA 3'端克隆位点也是EcoRI位点，因此为了防止pZP3α'和pZP3α"在EcoRI位点的自连以及便于连接片段pZP3α*定向插入pBV载体，我们选用了pZ58重组质粒中该基因3'端EcoRI位点后pBS克隆载体多克隆区EcoRI后的SalI位点(相距27 bps)。
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pBV220是国内应用广泛的热诱导表达质粒，表达量高时目的蛋白表达量可达菌体总蛋白的30%～70%。但在本研究中，尽管转化过多种大肠杆菌宿主菌，pBV220- pZP3α*重组表达质粒均未形成在SDS-PAGE中可辨别的特异蛋白表达。pZP3α*基因与它的衍生质粒pBV221重组后，在BL21(DE3)宿主菌中获得了高于10%的特异表达。虽然这一表达量并非理想，不过与先前约5%的融合蛋白(102 kD)表达水平相比[3]，去除融合蛋白内约占一半残基的截短 β-半乳糖苷酶，pZP3α目的蛋白表达还是提高了近4倍。至于目的蛋白表达相对较低，推测pZP3α蛋白本身分子量较大和其真核生物编码基因中含有相当数量大肠杆菌稀有密码子是影响翻译水平的可能因素。另外有报道说目的基因3'端序列长度也会形成表达水平差异[9]，因此pZP3α* cDNA 3'端非编码区包括EcoRI-SalI之间碱基数在内的76 bp非编码碱基是否也是一个原因，尚有待进一步探讨。
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在SDS-PAGE中pZP3α蛋白表达主带显示61 kD电泳分子量，这似乎与已报道的成熟去糖基化pZP3α蛋白分子量为37 kD有很大差异[10]，但考虑到本研究表达的目的蛋白含21个残基信号肽和C端74个残基跨膜区(成熟蛋白一般不存在这些肽段[11-13]), 这一分子量结果应该是真实的(该基因编码的全长pZP3α蛋白的理论分子量为59 kD)。本研究首次报道了ZP糖蛋白组分在原核生物中的直接表达。这一尝试为研究去糖基化ZP蛋白组分的抗生育疫苗奠定了基础。
国家计划生育药具重点实验室资助
作者简介：徐万祥，50岁，副研究员，主要从事生殖免疫学研究；
谢毅，35岁，教授，主要从事分子生物学研究
顾少华(复旦大学生命科学学院遗传研究所遗传工程国家重点实验室， 上海 200433)
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倪晓华(安徽皖南医学院， 芜湖 241001)
刘建平(复旦大学生命科学学院遗传研究所遗传工程国家重点实验室， 上海 200433)
牟忠明(复旦大学生命科学学院遗传研究所遗传工程国家重点实验室， 上海 200433)
谢毅(复旦大学生命科学学院遗传研究所遗传工程国家重点实验室， 上海 200433)
参考文献
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收稿1999-09-16 修回2000-02-12, http://www.100md.com