免疫法制备抗人Flt3ligand单克隆抗体及其鉴定
作者：孙建民 毛宁 刘荷中 唐佩弦
单位：孙建民(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850)；毛宁(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850)；刘荷中(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850)；唐佩弦(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850)
关键词：DNA免疫；Flt3ligand；单克隆抗体
细胞与分子免疫学杂志000331
中国号：R39233 文献标识码：B 文章编号：1007-8738(2000)03-DNA▲
Flt3ligand(FL)是近几年新发现的一种相对分子质量(Mr)为30000的糖蛋白，其中有Mr为12000的糖类〔1，2〕，主要参与体内的造血调控。在体外培养体系中，Flt3-ligand可与IL3，IL-6，SCF及GM-CSF等细胞因子协同，刺激造血干/祖细胞增殖，并能协同诱导造血干/祖细胞分化为树突状细胞等，因而在造血干/祖细胞的体外培养中获得广泛应用〔1，3〕。
, 百拇医药
DNA免疫法是一种新的制备单克隆抗体(mAb)的免疫方法，它不需要制备大量抗原，只需将编码抗原的cDNA克隆到真核表达载体上，用重组质粒对动物进行免疫，免疫动物即可产生针对该抗原的抗体。因此，通过该方法可以在没有大量抗原的情况下制备mAb〔4〕。
1 材料和方法
1.1重组质粒的构建与免疫利用限制性内切酶将人FL基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen公司)的多克隆位点，构建重组质粒pcDNA3.1FL。用试剂盒(Promega公司)大量提取质粒pcDNA3.1FL，溶于9g/L的NaCl溶液中，并调整其浓度为2g/L。于免疫后0，19，27和65d，分别给每只Balb/c小鼠的大腿肌肉内注射100μg重组质粒，于82d尾静脉取血，用ELISA检测小鼠血清中抗体的产生。
1.2抗FLmAb的制备及鉴定免疫后111d杀死小鼠，细胞融合、筛选、克隆化及腹水制备，均为常规方法。mAb的特性鉴定：①Ig亚类及效价：分别采用免疫双扩散法和间接ELISA法。②特异性：(a)交叉反应试验：应用人FL，SCF，GMCSF，IL-及IL-6分别包被酶连板，做间接ELISA测定A450nm值。(b)Westernblot分析：将人Flt3-ligand进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，在含39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris碱，0.37g/LSDS及200mL/L的甲醇的转移缓冲液中，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。室温封闭2h后，加入小鼠抗人FLmAb室温反应1h，洗涤3次，再加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG，同上反应、洗涤后，加底物显色10min和1mol/LH2SO4终止反应，并观察结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1FL真核表达质粒的构建及酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1FL构建的结果见图1。重组质粒经酶切电泳鉴定表明，获得正确的重组FL表达质粒pcDNA3.1FL(图2)。将其经试剂盒提取后免疫小鼠。
图1重组表达质粒pcDNA3.1FL的构建
2.2杂交瘤细胞株的建立及mAb的特性鉴定融合后仅得到1株能分泌抗FLmAb的杂交瘤细胞株F5B6，将其在体外连续培养半年以及冻存后复苏后仍保持抗体分泌能力。mAb的特性鉴定：双向免疫扩散法测定mAbF5B6为IgG1，间接ELISA效价为1×106。特异性鉴定：ELISA检测表明，mAbF5B6仅与FL有反应，与SCF，GMCSF，IL3以及IL6均无交叉反应。Westernblot检测结
, http://www.100md.com
果显示，在Mr为17000处出现1条特异性条带(图3)。
图2重组表达质粒pcDNA3.1FL的酶切鉴定
M：DNAmarker；1：pcDNA3.1FL/EcoRI，BamHI双酶切；
2：pcDNA3.1FL/EcoRI单酶切.
图3人FL的Westernblot分析
M：Marker(Mr×103)；1：FL特异性条带.
3 讨论
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传统制备mAb的方法需用大量抗原进行免疫，因而需预先纯化该抗原。人FL是近几年新发现的一种造血生长因子，正常人体内水平很低，因此欲获得足够的FL用于免疫动物，必须进行体外表达。我们应用表达IL的重组真核表达质粒DNA免疫小鼠后，小鼠细胞能够摄取质粒并表达该抗原，诱导机体产生抗体，达到了免疫的效果。小鼠属于高等哺乳动物，在进化上与人类有较近的亲源关系，其细胞能表达人的蛋白，特别是具有较多糖基化的蛋白，因此，采用DNA免疫法可取得很好的效果。在本文中，我们应用DNA免疫法制备抗人FLmAb，避免了蛋白表达纯化的繁杂过程，不仅节约了时间，而且获得的mAb特异性很好。■
作者简介：孙建民，男，27岁，博士生北京市太平路27号，Tel.(010)66931320
参考文献：
〔1〕 Lyman SD, James L, Vanden Bos T, et al. Molecular cloning of a ligand for the flt3/flk 2 tyrosine kinase receptor: a proliferative factor for primitive hematopoietic cells〔J〕 . Cell， 1993； 75(6)： 1157- 1167.
, http://www.100md.com
〔2〕 McClanahan T, Culpepper J, Campbell D, et al. Biochemical and genetic characterization of mu splice variants of the Flt3 ligand〔J〕 . Blood， 1996； 88(9)： 3371- 3382.
〔3〕 Jacobsen SE, Okkenhaug C, Myklebust J, et al. The FLT3 ligand potently and directly stimulates the growth and expansion of primitive murine bone marrow progenitor cells in vitro: synergistic interactions with interleukin (IL) 11, IL 12, and other hematopoietic growth factors〔J〕 . J Exp Med， 1995； 181(4)： 1357- 1363.
〔4〕 Ulivieri C, Burroni D, Telford JL, et al. Generation of a monoclonal antibody to a defined portion of the Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA immunization〔J〕 . J Biotechnol， 1996； 51(2)： 191- 194.
收稿日期：1999-09-06
修回日期：1999-12-06, 百拇医药
单位：孙建民(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850)；毛宁(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850)；刘荷中(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850)；唐佩弦(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850)
关键词：DNA免疫；Flt3ligand；单克隆抗体
细胞与分子免疫学杂志000331
中国号：R39233 文献标识码：B 文章编号：1007-8738(2000)03-DNA▲
Flt3ligand(FL)是近几年新发现的一种相对分子质量(Mr)为30000的糖蛋白，其中有Mr为12000的糖类〔1，2〕，主要参与体内的造血调控。在体外培养体系中，Flt3-ligand可与IL3，IL-6，SCF及GM-CSF等细胞因子协同，刺激造血干/祖细胞增殖，并能协同诱导造血干/祖细胞分化为树突状细胞等，因而在造血干/祖细胞的体外培养中获得广泛应用〔1，3〕。
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DNA免疫法是一种新的制备单克隆抗体(mAb)的免疫方法，它不需要制备大量抗原，只需将编码抗原的cDNA克隆到真核表达载体上，用重组质粒对动物进行免疫，免疫动物即可产生针对该抗原的抗体。因此，通过该方法可以在没有大量抗原的情况下制备mAb〔4〕。
1 材料和方法
1.1重组质粒的构建与免疫利用限制性内切酶将人FL基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen公司)的多克隆位点，构建重组质粒pcDNA3.1FL。用试剂盒(Promega公司)大量提取质粒pcDNA3.1FL，溶于9g/L的NaCl溶液中，并调整其浓度为2g/L。于免疫后0，19，27和65d，分别给每只Balb/c小鼠的大腿肌肉内注射100μg重组质粒，于82d尾静脉取血，用ELISA检测小鼠血清中抗体的产生。
1.2抗FLmAb的制备及鉴定免疫后111d杀死小鼠，细胞融合、筛选、克隆化及腹水制备，均为常规方法。mAb的特性鉴定：①Ig亚类及效价：分别采用免疫双扩散法和间接ELISA法。②特异性：(a)交叉反应试验：应用人FL，SCF，GMCSF，IL-及IL-6分别包被酶连板，做间接ELISA测定A450nm值。(b)Westernblot分析：将人Flt3-ligand进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，在含39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris碱，0.37g/LSDS及200mL/L的甲醇的转移缓冲液中，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。室温封闭2h后，加入小鼠抗人FLmAb室温反应1h，洗涤3次，再加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG，同上反应、洗涤后，加底物显色10min和1mol/LH2SO4终止反应，并观察结果。
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2 结果
2.1FL真核表达质粒的构建及酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1FL构建的结果见图1。重组质粒经酶切电泳鉴定表明，获得正确的重组FL表达质粒pcDNA3.1FL(图2)。将其经试剂盒提取后免疫小鼠。
图1重组表达质粒pcDNA3.1FL的构建
2.2杂交瘤细胞株的建立及mAb的特性鉴定融合后仅得到1株能分泌抗FLmAb的杂交瘤细胞株F5B6，将其在体外连续培养半年以及冻存后复苏后仍保持抗体分泌能力。mAb的特性鉴定：双向免疫扩散法测定mAbF5B6为IgG1，间接ELISA效价为1×106。特异性鉴定：ELISA检测表明，mAbF5B6仅与FL有反应，与SCF，GMCSF，IL3以及IL6均无交叉反应。Westernblot检测结
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果显示，在Mr为17000处出现1条特异性条带(图3)。
图2重组表达质粒pcDNA3.1FL的酶切鉴定
M：DNAmarker；1：pcDNA3.1FL/EcoRI，BamHI双酶切；
2：pcDNA3.1FL/EcoRI单酶切.
图3人FL的Westernblot分析
M：Marker(Mr×103)；1：FL特异性条带.
3 讨论
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传统制备mAb的方法需用大量抗原进行免疫，因而需预先纯化该抗原。人FL是近几年新发现的一种造血生长因子，正常人体内水平很低，因此欲获得足够的FL用于免疫动物，必须进行体外表达。我们应用表达IL的重组真核表达质粒DNA免疫小鼠后，小鼠细胞能够摄取质粒并表达该抗原，诱导机体产生抗体，达到了免疫的效果。小鼠属于高等哺乳动物，在进化上与人类有较近的亲源关系，其细胞能表达人的蛋白，特别是具有较多糖基化的蛋白，因此，采用DNA免疫法可取得很好的效果。在本文中，我们应用DNA免疫法制备抗人FLmAb，避免了蛋白表达纯化的繁杂过程，不仅节约了时间，而且获得的mAb特异性很好。■
作者简介：孙建民，男，27岁，博士生北京市太平路27号，Tel.(010)66931320
参考文献：
〔1〕 Lyman SD, James L, Vanden Bos T, et al. Molecular cloning of a ligand for the flt3/flk 2 tyrosine kinase receptor: a proliferative factor for primitive hematopoietic cells〔J〕 . Cell， 1993； 75(6)： 1157- 1167.
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〔2〕 McClanahan T, Culpepper J, Campbell D, et al. Biochemical and genetic characterization of mu splice variants of the Flt3 ligand〔J〕 . Blood， 1996； 88(9)： 3371- 3382.
〔3〕 Jacobsen SE, Okkenhaug C, Myklebust J, et al. The FLT3 ligand potently and directly stimulates the growth and expansion of primitive murine bone marrow progenitor cells in vitro: synergistic interactions with interleukin (IL) 11, IL 12, and other hematopoietic growth factors〔J〕 . J Exp Med， 1995； 181(4)： 1357- 1363.
〔4〕 Ulivieri C, Burroni D, Telford JL, et al. Generation of a monoclonal antibody to a defined portion of the Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA immunization〔J〕 . J Biotechnol， 1996； 51(2)： 191- 194.
收稿日期：1999-09-06
修回日期：1999-12-06, 百拇医药