丙型肝炎患者外周血单个核细胞HCV和Fas抗原检测
作者：陈佩兰 李琳 田惠英 陈良标
单位：北京军区总医院解放军肝病研究所，北京 100700
关键词：丙型肝炎；外周血单个核细胞；丙型肝炎病毒抗原；Fas抗原
军医进修学院学报000318 [摘要]目的：探讨丙型肝炎(丙肝)患者外周血单个核细胞(PBMCs)内丙型肝炎病毒抗原(HCVAg)及Fas抗原(FasAg)表达状况及意义。方法：采用HCV核心区及NS3区单克隆抗体，对 28 例慢性丙肝患者PBMCs进行免疫组化检测，并同步检测FasAg。结果：HCVAg及FasAg阳性率分别为 85.7% (24/28) 和 82.2% (23/28)，经相关分析显示。两者表达呈显著正相关(r=0.546，P<0.01)。FasAg阳性PBMCs中的部分细胞有凋亡性改变。结论：HCV可感染PBMCs，并可激发FasAg表达。PBMCs中的HCV和Fas介导的细胞凋亡，会影响机体免疫功能，并可能成为病毒持续感染的原因之一。
, http://www.100md.com
中图号：R512.6 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)03-0215-03
Detection of hepatitis C virus and Fas antigen in pheripheral blood mononuclear cells in patients with chronic hepatitis C
CHEN Pei-lan, LI Lin, TIAN Hui-ying, CHEN Liang-biao
(Institute of liver disease, Beijing Army General Hospital, Beijing 100700, China)
Objective:To study hepatitis C virus antigen (HCVAg) and Fas antigen (FasAg) expression at the same time in pheripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with chronic hepatitis C. Methods:The anti-HCVcore and NS3 monoclonal antibodies with Immuno-histochmemistry technique was applied to detect HCVAg and FasAg in the PBMCs of 28 patients. Results:Positive expression of HCVAg and FasAg were 85.7% (24/28) and 82.2% (23/28) respectively. There was a obvious positive correlation between HCVAg and FasAg (r=0.546,P<0.01). The part of PBMCs with FasAg positive expression have changed in form of apoptosis. Conclusion:HCV could infect PBMCs and HCV could stimulate FasAg expression. HCV in PBMCs and apoptosis mediated through FasAg may lead to the persistent infection on patients.
, 百拇医药
Key words:hepatitis C; pheripheral blood mononuclear cell (PBMC); hepatitis C virus; Fas antigen
丙型肝炎病毒抗原(HCVAg)和Fas抗原(FasAg)在丙型肝炎(丙肝)患者肝组织内的表达已有报道[1，2]，但肝外组织，如外周血单个核细胞(PBMCs)内的存在状况资料甚少。PBMCs HCVAg免疫组化至今仅见外国 1 篇免疫荧光检测报告[3]。本研究采用免疫酶组化方法对 28 例慢性丙肝患者PBMCs进行了HCVAg和FasAg检查。
1 对象和方法
1.1 对象 本研究所门诊和住院慢性丙肝患者 28例，男 20 例，女 8 例，年龄 17～74 (41.6±15.5)岁。全部病例血清HCV RNA和抗-HCV均阳性，ALT(正常值<40 U/L)均异常，平均 (102.2±74.2) U/L， 28 例患者血清乙型肝炎病毒标志阴性。
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1.2 PBMCs分离 采静脉血 5 ml，肝素抗凝，用密度 1.079 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产品)分离PBMCs，参照文献[3]方法分别以胰蛋白酶和RNA酶处理，以排除血清中HCV对PBMCs的污染。经上述处理的细胞配成约 1.0×106/ml 浓度，以离心法甩片使细胞贴附于载玻片上，空气干燥后乙醇固定 10 min，-30 ℃ 保存备用。
1.3 试剂来源 抗HCVcore和NS3单克隆抗体分别由军事医学科学院基础所陆好英教授和中国预防医学科学院病毒研究所美云教授惠赠。兔抗人Fas多克隆抗体及SP通用型免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术公司(分别为美国Santa Cruz公司及EZymed Lab公司产品)。
1.4 HCVAg和PBMCs检测 HCVAg免疫组化染色按试剂盒说明书进行：依次用PBS湿片，3% H2O2-甲醇处理去内源酶，正常羊血清封闭，抗HCVcore和NS3单抗混合，工作浓度 1∶100，生物素化兔抗鼠IgG连接过氧化物酶标链霉卵白素反应后常规DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固。PBMCs检测，除一抗换用兔抗Fas抗体外，其余步骤同HCVAg检测。对照试验：阳性对照用预试验中HCVAg和FasAg阳性片。并分别用鼠血清、兔血清和PBS替代第一抗体作空白对照，以确定检测的特异性。 14 例健康献血者的PBMCs同时进行检测，作阴性对照。结果判断：细胞被染成棕色或棕黄色为阳性，未着色为阴性。计数 200 个细胞，计算阳性细胞百分数。阳性表达程度分三级，即阳性细胞少于 25%为弱表达(+)；26%～50% 为中度表达(
)；大于 50% 为强表达(
)。
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2 结 果
2.1 HCVAg和FasAg表达及特点 28 例患者PBMCs中HCVAg阳性 24 例(85.7%)，表达呈浆型、浆膜型和膜型三种(图 1)，以浆型为主。此外，部分病例单核细胞胞核亦呈阳性着色。FasAg阳性 23 例 (82.2%)，表达为多浆型，少数膜型，未见核阳性(图 2)。HCVAg和FasAg阳性细胞多数体积较大，浆/核比例升高，部分细胞有核固缩、核碎裂等凋亡改变(图 3 箭头示)。
图1 HCVAg免疫组化染色(HCVAg阳性细胞棕褐色 ×850)
图2 FasAg免疫组化染色(FasAg阳性细胞棕褐色 ×625)
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图3 HCVAg阳性患者BMCs瑞氏染色(↑示胞核固缩 ×850)
所设阳性对照与HCVAg和FasAg阳性病例结果一致。空白对照结果全部阴性。14 例献血员HCVAg均阴性，仅 3 例FasAg有少数细胞为弱表达。
2.2 HCVAg与FasAg表达关系 两者表达阳性率基本一致 (85.7%；82.2%)，且每一病例两种抗原表达状况和程度也基本相同(表 1，表 2)。HCVAg和FasAg阳性细胞数量经相关分析显示呈显著正相关(r=0.546, P<0.01)。
表1 28例患者PBMCs HCVAg与FasAg表达比较(1) 患者序号
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HCVAg
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表2 28例患者PBMCs HCVAg与FasAg表达比较(2) 患者序号
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14例献血者
HCVAg
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FasAg
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*仅3例PBMCs FasAg弱阳性，余阴性
由于HCV在血清中含量极微，很难检出，故目前主要采用PCR方法检测血清中HCV RNA和ELISA方法检测抗-HCV。前者因技术、条件等因素难以推广，且存在假阴性和/或假阳性结果。后者，检测抗-HCV只能作为感染者的免疫应答，是反应HCV感染的一种间接指标。近年，wellems等[4]用PCR方法初步证实HCV可感染PBMCs，并在其中复制，因此，直接进行PBMCs内HCVAg的检测，有可能对现有方法给予补充和加强。
3 讨 论
本研究以HCV核心区和NS3区单克隆抗体对 28 例慢性丙肝患者PBMCs进行检测，HCVAg阳性率 85.7% (24/28)、阳性产物主要沉着在胞浆，少数在胞核，与sansonno等研究结果基本一致[3]。此结果用免疫学方法也证实PBMCs可受HCV感染。同时显示FasAg阳性率 82.2% (23/28) 与HCVAg表达显著正相关。从 14 例献血员PBMCs的FasAg检测结果看，仅 3 例有少数细胞呈弱表达，而患者则不然，FasAg随HCVAg表达的增加而增加，表明HCVAg可激发Fas表达。已有报道，Fas广泛参与细胞凋亡[5]。当淋巴细胞受病毒感染或超抗原刺激后，既表达Fas也可表达Fas配体，并通过受体与配体结合，导致活化细胞一方凋亡或双方凋亡[6,7]。对患者PBMCs的瑞氏染色及免疫组化结果观察，发现部分细胞胞核固缩、核碎裂等凋亡性改变，这可能是病毒感染后Fas系统介导所致。提示HCV对PBMCs的感染可能会引起T、B和巨噬细胞等免疫细胞群体功能失调，使病毒感染呈慢性化，并对丙肝自然病程和治疗产生影响。
, 百拇医药
HCV能否感染PBMCs并在其中复制，目前仍有争议，本组 15 例HCVAg强阳性和较强阳性患者的PBMCs标本中，电镜下均发现了丙型肝炎病毒颗粒，并得到免疫电镜的证实[8]。这充分表明PBMCs可受HCVAg感染，并在其中复制。部分病例的少数PBMCs胞核HCVAg阳性，在电镜下可见到突入胞核核袋中的病毒颗粒。表明单核细胞胞核HCVAg阳性实为突入胞核的胞质内的病毒抗原引起，并非HCV在核内感染。
基金项目：军队医药卫生科研基金资助项目(95B013)；
作者简介：陈佩兰(1943-)，女，北京市人，1963年北京军区军医学校毕业，北京军区总医院解放军肝病研究所主任技师；发表论文23篇。电话：(010)66721183
[参考文献]
, 百拇医药
[1] Ruggieri A, Harada T, Matsuura Y, et al. Sensitization to Fas-mediated apoptosis by hepatitis C virus core protein [J]. Viroloty, 1997,229(1):68-76.
[2] 李 琳，陈乃玲，陈佩兰,等.丙型病毒性肝炎患者肝组织Fas抗原的表达与HAI积分关系的研究[J].军医进修学院学报，1999，20(1)：7-8.
[3] Sansonno D, Lacobelli AR, Cornacchiulo V.Detection of hepatitis C virus (HCV) protiens by immunofluorescence and HCV RNA genomic sequences by non-isotopic in situ hybridization in bone marow and peripheral blood mononuclear cells of chronicolly HCV-infected patients [J]. Clin Exp Immunol, 1996,103:414-421.
, http://www.100md.com
[4] Willems M,Peerlick k, Moshage H, et al. Hepatitis C viru-RNA in plasma and in pheripheral blood mononuclear cells of hemophilacs with chronic hepatitis C: evidence for viral replication in peripheral blood mononuclear cells [J]. J Med viral, 1994,42:272-275.
[5] 贾克明.加强Fas和Fas配体研究[J].中华内科杂志，1997，36：651-652.
[6] Katsikis PD, wunderlich ES, Smith CA, et al. Fas antigen stimulation induces marked apoptosis of T lymphocytes in humon immunodeficiency virus-infected individuals [J]. J EXP Med, 1995,181(6):2029-2036.
[7] 箫雪媛，杨贵贞，杨崇敬.淋巴细胞表面APO-Ⅰ受体的表达与其凋亡敏感性的相关性研究[J].中国实验临床免疫学杂志，1998，10(3)：35-38.
[8] 陈良标，陈佩兰，刘超英，等.慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞HCV感染电镜研究[J].中国医学影像学杂志，1999，7(2)：110-111.
收稿日期：2000-02-16； 修回日期：2000-03-03, http://www.100md.com
单位：北京军区总医院解放军肝病研究所，北京 100700
关键词：丙型肝炎；外周血单个核细胞；丙型肝炎病毒抗原；Fas抗原
军医进修学院学报000318 [摘要]目的：探讨丙型肝炎(丙肝)患者外周血单个核细胞(PBMCs)内丙型肝炎病毒抗原(HCVAg)及Fas抗原(FasAg)表达状况及意义。方法：采用HCV核心区及NS3区单克隆抗体，对 28 例慢性丙肝患者PBMCs进行免疫组化检测，并同步检测FasAg。结果：HCVAg及FasAg阳性率分别为 85.7% (24/28) 和 82.2% (23/28)，经相关分析显示。两者表达呈显著正相关(r=0.546，P<0.01)。FasAg阳性PBMCs中的部分细胞有凋亡性改变。结论：HCV可感染PBMCs，并可激发FasAg表达。PBMCs中的HCV和Fas介导的细胞凋亡，会影响机体免疫功能，并可能成为病毒持续感染的原因之一。
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中图号：R512.6 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)03-0215-03
Detection of hepatitis C virus and Fas antigen in pheripheral blood mononuclear cells in patients with chronic hepatitis C
CHEN Pei-lan, LI Lin, TIAN Hui-ying, CHEN Liang-biao
(Institute of liver disease, Beijing Army General Hospital, Beijing 100700, China)
Objective:To study hepatitis C virus antigen (HCVAg) and Fas antigen (FasAg) expression at the same time in pheripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with chronic hepatitis C. Methods:The anti-HCVcore and NS3 monoclonal antibodies with Immuno-histochmemistry technique was applied to detect HCVAg and FasAg in the PBMCs of 28 patients. Results:Positive expression of HCVAg and FasAg were 85.7% (24/28) and 82.2% (23/28) respectively. There was a obvious positive correlation between HCVAg and FasAg (r=0.546,P<0.01). The part of PBMCs with FasAg positive expression have changed in form of apoptosis. Conclusion:HCV could infect PBMCs and HCV could stimulate FasAg expression. HCV in PBMCs and apoptosis mediated through FasAg may lead to the persistent infection on patients.
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Key words:hepatitis C; pheripheral blood mononuclear cell (PBMC); hepatitis C virus; Fas antigen
丙型肝炎病毒抗原(HCVAg)和Fas抗原(FasAg)在丙型肝炎(丙肝)患者肝组织内的表达已有报道[1，2]，但肝外组织，如外周血单个核细胞(PBMCs)内的存在状况资料甚少。PBMCs HCVAg免疫组化至今仅见外国 1 篇免疫荧光检测报告[3]。本研究采用免疫酶组化方法对 28 例慢性丙肝患者PBMCs进行了HCVAg和FasAg检查。
1 对象和方法
1.1 对象 本研究所门诊和住院慢性丙肝患者 28例，男 20 例，女 8 例，年龄 17～74 (41.6±15.5)岁。全部病例血清HCV RNA和抗-HCV均阳性，ALT(正常值<40 U/L)均异常，平均 (102.2±74.2) U/L， 28 例患者血清乙型肝炎病毒标志阴性。
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1.2 PBMCs分离 采静脉血 5 ml，肝素抗凝，用密度 1.079 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产品)分离PBMCs，参照文献[3]方法分别以胰蛋白酶和RNA酶处理，以排除血清中HCV对PBMCs的污染。经上述处理的细胞配成约 1.0×106/ml 浓度，以离心法甩片使细胞贴附于载玻片上，空气干燥后乙醇固定 10 min，-30 ℃ 保存备用。
1.3 试剂来源 抗HCVcore和NS3单克隆抗体分别由军事医学科学院基础所陆好英教授和中国预防医学科学院病毒研究所美云教授惠赠。兔抗人Fas多克隆抗体及SP通用型免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术公司(分别为美国Santa Cruz公司及EZymed Lab公司产品)。
1.4 HCVAg和PBMCs检测 HCVAg免疫组化染色按试剂盒说明书进行：依次用PBS湿片，3% H2O2-甲醇处理去内源酶，正常羊血清封闭，抗HCVcore和NS3单抗混合，工作浓度 1∶100，生物素化兔抗鼠IgG连接过氧化物酶标链霉卵白素反应后常规DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固。PBMCs检测，除一抗换用兔抗Fas抗体外，其余步骤同HCVAg检测。对照试验：阳性对照用预试验中HCVAg和FasAg阳性片。并分别用鼠血清、兔血清和PBS替代第一抗体作空白对照，以确定检测的特异性。 14 例健康献血者的PBMCs同时进行检测，作阴性对照。结果判断：细胞被染成棕色或棕黄色为阳性，未着色为阴性。计数 200 个细胞，计算阳性细胞百分数。阳性表达程度分三级，即阳性细胞少于 25%为弱表达(+)；26%～50% 为中度表达(
)；大于 50% 为强表达()。, 百拇医药
2 结 果
2.1 HCVAg和FasAg表达及特点 28 例患者PBMCs中HCVAg阳性 24 例(85.7%)，表达呈浆型、浆膜型和膜型三种(图 1)，以浆型为主。此外，部分病例单核细胞胞核亦呈阳性着色。FasAg阳性 23 例 (82.2%)，表达为多浆型，少数膜型，未见核阳性(图 2)。HCVAg和FasAg阳性细胞多数体积较大，浆/核比例升高，部分细胞有核固缩、核碎裂等凋亡改变(图 3 箭头示)。
图1 HCVAg免疫组化染色(HCVAg阳性细胞棕褐色 ×850)
图2 FasAg免疫组化染色(FasAg阳性细胞棕褐色 ×625)
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图3 HCVAg阳性患者BMCs瑞氏染色(↑示胞核固缩 ×850)
所设阳性对照与HCVAg和FasAg阳性病例结果一致。空白对照结果全部阴性。14 例献血员HCVAg均阴性，仅 3 例FasAg有少数细胞为弱表达。
2.2 HCVAg与FasAg表达关系 两者表达阳性率基本一致 (85.7%；82.2%)，且每一病例两种抗原表达状况和程度也基本相同(表 1，表 2)。HCVAg和FasAg阳性细胞数量经相关分析显示呈显著正相关(r=0.546, P<0.01)。
表1 28例患者PBMCs HCVAg与FasAg表达比较(1) 患者序号
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由于HCV在血清中含量极微，很难检出，故目前主要采用PCR方法检测血清中HCV RNA和ELISA方法检测抗-HCV。前者因技术、条件等因素难以推广，且存在假阴性和/或假阳性结果。后者，检测抗-HCV只能作为感染者的免疫应答，是反应HCV感染的一种间接指标。近年，wellems等[4]用PCR方法初步证实HCV可感染PBMCs，并在其中复制，因此，直接进行PBMCs内HCVAg的检测，有可能对现有方法给予补充和加强。
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本研究以HCV核心区和NS3区单克隆抗体对 28 例慢性丙肝患者PBMCs进行检测，HCVAg阳性率 85.7% (24/28)、阳性产物主要沉着在胞浆，少数在胞核，与sansonno等研究结果基本一致[3]。此结果用免疫学方法也证实PBMCs可受HCV感染。同时显示FasAg阳性率 82.2% (23/28) 与HCVAg表达显著正相关。从 14 例献血员PBMCs的FasAg检测结果看，仅 3 例有少数细胞呈弱表达，而患者则不然，FasAg随HCVAg表达的增加而增加，表明HCVAg可激发Fas表达。已有报道，Fas广泛参与细胞凋亡[5]。当淋巴细胞受病毒感染或超抗原刺激后，既表达Fas也可表达Fas配体，并通过受体与配体结合，导致活化细胞一方凋亡或双方凋亡[6,7]。对患者PBMCs的瑞氏染色及免疫组化结果观察，发现部分细胞胞核固缩、核碎裂等凋亡性改变，这可能是病毒感染后Fas系统介导所致。提示HCV对PBMCs的感染可能会引起T、B和巨噬细胞等免疫细胞群体功能失调，使病毒感染呈慢性化，并对丙肝自然病程和治疗产生影响。
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HCV能否感染PBMCs并在其中复制，目前仍有争议，本组 15 例HCVAg强阳性和较强阳性患者的PBMCs标本中，电镜下均发现了丙型肝炎病毒颗粒，并得到免疫电镜的证实[8]。这充分表明PBMCs可受HCVAg感染，并在其中复制。部分病例的少数PBMCs胞核HCVAg阳性，在电镜下可见到突入胞核核袋中的病毒颗粒。表明单核细胞胞核HCVAg阳性实为突入胞核的胞质内的病毒抗原引起，并非HCV在核内感染。
基金项目：军队医药卫生科研基金资助项目(95B013)；
作者简介：陈佩兰(1943-)，女，北京市人，1963年北京军区军医学校毕业，北京军区总医院解放军肝病研究所主任技师；发表论文23篇。电话：(010)66721183
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[1] Ruggieri A, Harada T, Matsuura Y, et al. Sensitization to Fas-mediated apoptosis by hepatitis C virus core protein [J]. Viroloty, 1997,229(1):68-76.
[2] 李 琳，陈乃玲，陈佩兰,等.丙型病毒性肝炎患者肝组织Fas抗原的表达与HAI积分关系的研究[J].军医进修学院学报，1999，20(1)：7-8.
[3] Sansonno D, Lacobelli AR, Cornacchiulo V.Detection of hepatitis C virus (HCV) protiens by immunofluorescence and HCV RNA genomic sequences by non-isotopic in situ hybridization in bone marow and peripheral blood mononuclear cells of chronicolly HCV-infected patients [J]. Clin Exp Immunol, 1996,103:414-421.
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[4] Willems M,Peerlick k, Moshage H, et al. Hepatitis C viru-RNA in plasma and in pheripheral blood mononuclear cells of hemophilacs with chronic hepatitis C: evidence for viral replication in peripheral blood mononuclear cells [J]. J Med viral, 1994,42:272-275.
[5] 贾克明.加强Fas和Fas配体研究[J].中华内科杂志，1997，36：651-652.
[6] Katsikis PD, wunderlich ES, Smith CA, et al. Fas antigen stimulation induces marked apoptosis of T lymphocytes in humon immunodeficiency virus-infected individuals [J]. J EXP Med, 1995,181(6):2029-2036.
[7] 箫雪媛，杨贵贞，杨崇敬.淋巴细胞表面APO-Ⅰ受体的表达与其凋亡敏感性的相关性研究[J].中国实验临床免疫学杂志，1998，10(3)：35-38.
[8] 陈良标，陈佩兰，刘超英，等.慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞HCV感染电镜研究[J].中国医学影像学杂志，1999，7(2)：110-111.
收稿日期：2000-02-16； 修回日期：2000-03-03, http://www.100md.com