8-氯-腺苷抗肿瘤作用机制
作者：陆久怡 王蔼明 贺师鹏 张礼和
单位：陆久怡(中国医学科学院药理研究室)；王蔼明(中国人民解放军海军总医院)；贺师鹏(北京大学基础医学院生物物理学系，北京 100083)；张礼和(北京大学药学院)
关键词：环AMP；药理学；8-氯腺苷；肿瘤细胞；培养的；药物作用；细胞周期；癌；肝细胞
北京医科大学学报000626 [中图分类号]R979.1 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0569-01
cAMP对多种细胞的增殖和分化有重要的影响。长期以来人们寻找对癌细胞增殖和分化有作用的cAMP类似物。现有大量研究表明8-Cl-cAMP及其代谢产物8-氯腺苷(8-Cl-Ado)对肿瘤细胞有抑制作用[1～3],但它的抑癌作用机制尚不清楚。细胞周期的运行受诸如细胞周期蛋白、生长因子、癌基因蛋白等因子的调控。如一些癌基因蛋白(如P16、P21、P53等)的缺失或突变就会引起细胞的癌变。
, 百拇医药
本文以人肝癌细胞系Bel-7402为对象,研究在8-Cl-Ado作用下肝癌细胞周期变化与IGF-1及P21含量变化的关系，以探讨8-Cl-Ado的抗癌作用的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
8-Cl-Ado和Bel-7402肝癌细胞系:由北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室合成并提供，IGF-1 mRNA的cDAN由美国糖尿病消化病研究所惠赠,P21单克隆抗体购自上海市肿瘤研究所免疫室,亲和素-生物素免疫检测试剂盒购自华美生物工程公司, IGF-1购自美国Sigma公司,IGF-1mRNA试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。北京医用离心机厂制造LD5-2A型离心机。
1.2 方法
流式细胞分析：取状态良好的单层Bel-7402细胞,弃去培养液,加入无血清的DMEM,饥饿8 h后, 加入8-Cl-Ado使其终浓度为6 μmol.L-1,37 ℃培养24 h后，加0.25 g.L-1胰酶,37 ℃培养2 min,制成单细胞悬液，用70%(体积分数)乙醇4 ℃固定30 min,800 r.min-1离心5 min,弃上清 ，用PBS调节细胞为每毫升1.0×106, 加10 μl(10 g.L-1)RNase置37 ℃温育30 min,用300目尼龙筛网过滤于试管中，加碘化丙啶250 μl染色上机测试。
, 百拇医药
IGF-1放免测定：取状态良好的单层Bel-7402细胞，无血清DMEM饥饿8 h培养后，加入终浓度为6 μmol.L-1的8-Cl-Ado作用24 h后，收集细胞并计数(每瓶约3×107细胞)，蒸馏水破碎细胞，加酸化乙醇(总体积为1.5 ml)过夜，12 000 r.min-1离心10 min，取0.5 ml上清液加0.2 ml 0.855 mol.L-1 tris中和，中和液经稀释，取0.1 ml作IGF-1 RNA测定，方法见参考文献[4]。
IGF-1 mRNA原位杂交测定；cDNA探针的地高辛标记按试剂盒方法进行。将Bel-7402细胞接种于带有玻片的24孔培养板中，待细胞贴壁后，加入无血清的DMEM饥饿8 h后，加入8-Cl-Ado使其终浓度变为6 μmol.L-1，37 ℃培养24 h后，吸去培养液用PBS洗1次,用丙酮∶甲醇(体积比)=1∶1固定15 min，弃去固定液，再用PBS洗3次后,每片加20 μl(20 ng)蛋白酶K作用15 min，用PBS洗3次,用4 g.L-1多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次。原位杂交按地高辛检测试剂盒提供的方法酶联免疫显色。用LEICAQ 5501w图像分析仪对原位杂交显色作灰度扫描读取平均光密度值。
, http://www.100md.com
P21蛋白的免疫组化测定：Bel-7402细胞6 μmol.L-1 8-Cl-Ado作用24 h后，用丙酮固定5 min，弃去固定液，用PBS洗1次加1%(体积比)H2O2作用15 min后，用PBS洗3次用滤纸吸干。P21蛋白的免疫组化测定按ABC免疫法，DAB显色法，最后用LEICA Q 5501W图像分析仪对免疫组化显色进行灰度扫描读取平均光密度值。
2 结果
2.1 8-Cl-Ado对细胞周期的影响
流式细胞术分析指出:6 μmol.L-1的8-Cl-Ado作用Bel-7402细胞24 h后，使G1期的细胞数由(52.1±1.4)%增至(69.8±1.5)%，而S期细胞由(39.3±1.1)%降至(23.2±1.3)%，差异十分显著，说明8-Cl-Ado使肿瘤细胞阻止在G1期，肿瘤细胞增殖受到抑制。
, http://www.100md.com
2.2 8-Cl-Ado对Bel-7402细胞IGF-1mRNA表达及胞内IGF-1含量的影响
原位杂交和放免测定结果显示：8-Cl-Ado作用24 h后，使胞内IGF-1 mRNA的表达水平由0.188±0.026降至0.120±0.028(P<0.01)，胞内IGF-1含量由(254±105)降至(110±25) pg/106细胞(P<0.05)。说明肿瘤细胞内IGF-1 mRNA表达水平和IGF-1含量均明显下降。
2.3 8-Cl-Ado对Bel-7402细胞中P21蛋白表达的影响
组化分析结果显示：8-Cl-Ado使Bel-7402细胞中P21蛋白表达水平由(0.240±0.008)降至(0.192±0.019)(P<0.01)，作用十分显著。
3 讨论
, 百拇医药
本研究证明8-Cl-Ado能够抑制肿瘤增殖作用，并使肿瘤细胞被阻止在G1期，细胞内P21表达水平下降。此结果与参考文献[1,2]报道一致。G1期细胞向S期细胞转变受IGF-1的控制，IGF-1减少细胞就会被阻止在G1期。不仅如此，它还受细胞周期蛋白D、E、A及其依赖的蛋白激酶CDK4，CDK2的调控，P21蛋白既能与周期蛋白D-CDK4或周期蛋白E-CDK2结合，从而抑制CDK的活性，又能与增殖细胞核蛋白(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)结合，抑制DNA的复制，因此，在正常细胞的增殖过程中，P21作为细胞负调节因子起抑制细胞增殖作用，但是，在肿瘤细胞中，P21丢失与PCNA结合的功能，使DNA甲基转移酶的活性增强，从而削弱其抑癌基因的功能[5，6]。
本研究表明，在一定浓度(6 μmol.L-1)范围内8-Cl-Ado可以抑制癌细胞增殖，使癌细胞停滞在G1期，胞内P21蛋白水平IGF-1 mRNA以及IGF-1含量均下降，这些结果至少提示8-Cl-Ado使癌细胞停滞在G1期的部分原因可能是细胞分泌IGF-1减少，而导致生长因子受体信号通路中P21蛋白表达下降，从而抑制癌细胞生长。但是8-Cl-Ado抑癌作用的靶点需进一步研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Lang-Carter CA,Vuillequez JJ,Malkinson AM,et al.8-chloroadensine mediates 8-chloro-cyclicAMP-induced down-regulation of cyclicAMP-dependent protein kinase in normal and neoplastic mouse lung epithelial cell by a cyclic AMP-independent mechanism[J].Cancer Res,1993,53:393-400
2，Ally S,Clair T,Katsaros D,et al,Inhibition of growth and modulation of gene expression in human lung carcinoma in athymic mice by site-selective 8-Cl-cyclic adenosine[J].Cancer Res,1989,49:5650-5655
, http://www.100md.com
3，方家椿，石永进，张礼和，等.8-氯腺苷的抗肿瘤作用的研究[J].中华肿瘤杂志,1995,17:5-8
4，贺师鹏,黄天贵,邓鸿业,等.胰岛素样生长因子-1的放射免疫分析及其应用[J].中华核医学杂志,1996,16:127
5，Baylin St.Tying it all together:epigenetics,genetics,cell cyclic and cancer[J].Science,1997,277:1948-1949
6，徐耀先,解梦露,张锡元.从细胞周期蛋白与抑癌蛋白的调控看肿瘤发生的机制[J].肿瘤,1997,17:298-301
收稿日期；1999-02-26, http://www.100md.com
单位：陆久怡(中国医学科学院药理研究室)；王蔼明(中国人民解放军海军总医院)；贺师鹏(北京大学基础医学院生物物理学系，北京 100083)；张礼和(北京大学药学院)
关键词：环AMP；药理学；8-氯腺苷；肿瘤细胞；培养的；药物作用；细胞周期；癌；肝细胞
北京医科大学学报000626 [中图分类号]R979.1 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0569-01
cAMP对多种细胞的增殖和分化有重要的影响。长期以来人们寻找对癌细胞增殖和分化有作用的cAMP类似物。现有大量研究表明8-Cl-cAMP及其代谢产物8-氯腺苷(8-Cl-Ado)对肿瘤细胞有抑制作用[1～3],但它的抑癌作用机制尚不清楚。细胞周期的运行受诸如细胞周期蛋白、生长因子、癌基因蛋白等因子的调控。如一些癌基因蛋白(如P16、P21、P53等)的缺失或突变就会引起细胞的癌变。
, 百拇医药
本文以人肝癌细胞系Bel-7402为对象,研究在8-Cl-Ado作用下肝癌细胞周期变化与IGF-1及P21含量变化的关系，以探讨8-Cl-Ado的抗癌作用的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
8-Cl-Ado和Bel-7402肝癌细胞系:由北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室合成并提供，IGF-1 mRNA的cDAN由美国糖尿病消化病研究所惠赠,P21单克隆抗体购自上海市肿瘤研究所免疫室,亲和素-生物素免疫检测试剂盒购自华美生物工程公司, IGF-1购自美国Sigma公司,IGF-1mRNA试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。北京医用离心机厂制造LD5-2A型离心机。
1.2 方法
流式细胞分析：取状态良好的单层Bel-7402细胞,弃去培养液,加入无血清的DMEM,饥饿8 h后, 加入8-Cl-Ado使其终浓度为6 μmol.L-1,37 ℃培养24 h后，加0.25 g.L-1胰酶,37 ℃培养2 min,制成单细胞悬液，用70%(体积分数)乙醇4 ℃固定30 min,800 r.min-1离心5 min,弃上清 ，用PBS调节细胞为每毫升1.0×106, 加10 μl(10 g.L-1)RNase置37 ℃温育30 min,用300目尼龙筛网过滤于试管中，加碘化丙啶250 μl染色上机测试。
, 百拇医药
IGF-1放免测定：取状态良好的单层Bel-7402细胞，无血清DMEM饥饿8 h培养后，加入终浓度为6 μmol.L-1的8-Cl-Ado作用24 h后，收集细胞并计数(每瓶约3×107细胞)，蒸馏水破碎细胞，加酸化乙醇(总体积为1.5 ml)过夜，12 000 r.min-1离心10 min，取0.5 ml上清液加0.2 ml 0.855 mol.L-1 tris中和，中和液经稀释，取0.1 ml作IGF-1 RNA测定，方法见参考文献[4]。
IGF-1 mRNA原位杂交测定；cDNA探针的地高辛标记按试剂盒方法进行。将Bel-7402细胞接种于带有玻片的24孔培养板中，待细胞贴壁后，加入无血清的DMEM饥饿8 h后，加入8-Cl-Ado使其终浓度变为6 μmol.L-1，37 ℃培养24 h后，吸去培养液用PBS洗1次,用丙酮∶甲醇(体积比)=1∶1固定15 min，弃去固定液，再用PBS洗3次后,每片加20 μl(20 ng)蛋白酶K作用15 min，用PBS洗3次,用4 g.L-1多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次。原位杂交按地高辛检测试剂盒提供的方法酶联免疫显色。用LEICAQ 5501w图像分析仪对原位杂交显色作灰度扫描读取平均光密度值。
, http://www.100md.com
P21蛋白的免疫组化测定：Bel-7402细胞6 μmol.L-1 8-Cl-Ado作用24 h后，用丙酮固定5 min，弃去固定液，用PBS洗1次加1%(体积比)H2O2作用15 min后，用PBS洗3次用滤纸吸干。P21蛋白的免疫组化测定按ABC免疫法，DAB显色法，最后用LEICA Q 5501W图像分析仪对免疫组化显色进行灰度扫描读取平均光密度值。
2 结果
2.1 8-Cl-Ado对细胞周期的影响
流式细胞术分析指出:6 μmol.L-1的8-Cl-Ado作用Bel-7402细胞24 h后，使G1期的细胞数由(52.1±1.4)%增至(69.8±1.5)%，而S期细胞由(39.3±1.1)%降至(23.2±1.3)%，差异十分显著，说明8-Cl-Ado使肿瘤细胞阻止在G1期，肿瘤细胞增殖受到抑制。
, http://www.100md.com
2.2 8-Cl-Ado对Bel-7402细胞IGF-1mRNA表达及胞内IGF-1含量的影响
原位杂交和放免测定结果显示：8-Cl-Ado作用24 h后，使胞内IGF-1 mRNA的表达水平由0.188±0.026降至0.120±0.028(P<0.01)，胞内IGF-1含量由(254±105)降至(110±25) pg/106细胞(P<0.05)。说明肿瘤细胞内IGF-1 mRNA表达水平和IGF-1含量均明显下降。
2.3 8-Cl-Ado对Bel-7402细胞中P21蛋白表达的影响
组化分析结果显示：8-Cl-Ado使Bel-7402细胞中P21蛋白表达水平由(0.240±0.008)降至(0.192±0.019)(P<0.01)，作用十分显著。
3 讨论
, 百拇医药
本研究证明8-Cl-Ado能够抑制肿瘤增殖作用，并使肿瘤细胞被阻止在G1期，细胞内P21表达水平下降。此结果与参考文献[1,2]报道一致。G1期细胞向S期细胞转变受IGF-1的控制，IGF-1减少细胞就会被阻止在G1期。不仅如此，它还受细胞周期蛋白D、E、A及其依赖的蛋白激酶CDK4，CDK2的调控，P21蛋白既能与周期蛋白D-CDK4或周期蛋白E-CDK2结合，从而抑制CDK的活性，又能与增殖细胞核蛋白(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)结合，抑制DNA的复制，因此，在正常细胞的增殖过程中，P21作为细胞负调节因子起抑制细胞增殖作用，但是，在肿瘤细胞中，P21丢失与PCNA结合的功能，使DNA甲基转移酶的活性增强，从而削弱其抑癌基因的功能[5，6]。
本研究表明，在一定浓度(6 μmol.L-1)范围内8-Cl-Ado可以抑制癌细胞增殖，使癌细胞停滞在G1期，胞内P21蛋白水平IGF-1 mRNA以及IGF-1含量均下降，这些结果至少提示8-Cl-Ado使癌细胞停滞在G1期的部分原因可能是细胞分泌IGF-1减少，而导致生长因子受体信号通路中P21蛋白表达下降，从而抑制癌细胞生长。但是8-Cl-Ado抑癌作用的靶点需进一步研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Lang-Carter CA,Vuillequez JJ,Malkinson AM,et al.8-chloroadensine mediates 8-chloro-cyclicAMP-induced down-regulation of cyclicAMP-dependent protein kinase in normal and neoplastic mouse lung epithelial cell by a cyclic AMP-independent mechanism[J].Cancer Res,1993,53:393-400
2，Ally S,Clair T,Katsaros D,et al,Inhibition of growth and modulation of gene expression in human lung carcinoma in athymic mice by site-selective 8-Cl-cyclic adenosine[J].Cancer Res,1989,49:5650-5655
, http://www.100md.com
3，方家椿，石永进，张礼和，等.8-氯腺苷的抗肿瘤作用的研究[J].中华肿瘤杂志,1995,17:5-8
4，贺师鹏,黄天贵,邓鸿业,等.胰岛素样生长因子-1的放射免疫分析及其应用[J].中华核医学杂志,1996,16:127
5，Baylin St.Tying it all together:epigenetics,genetics,cell cyclic and cancer[J].Science,1997,277:1948-1949
6，徐耀先,解梦露,张锡元.从细胞周期蛋白与抑癌蛋白的调控看肿瘤发生的机制[J].肿瘤,1997,17:298-301
收稿日期；1999-02-26, http://www.100md.com