RP－HPLC法测定血清中羟基喜树碱
http://www.100md.com
法医学杂志 2000年第1期第16卷 论著
作者：谢兴夫 徐文卿 陈臻
单位：谢兴夫(浙江省人民检察院技术处,浙江杭州 310012)；徐文卿 陈臻(江山市人民医院,浙江 324100)
关键词：RP-HPLC法；羟基喜树碱；血清
法医学杂志000110
[摘要]建立了用RP-HPLC法测定血清中羟基喜树碱含量的方法。文中采用ODS不锈钢柱(10cm×4.6mm,5μm)，流动相为甲醇:0.625mol/L磷酸缓冲溶液(pH6.4)35:65，流速为0.5ml/min，检测波长为385nm，羟基喜树碱的保留时间为4.4min。回收率为62.0%，RSD=3.6%(n=5)。在0～400ng/ml浓度范围内有较好的相关性，r=0.9946，血清中最低检出限为5ng/m1。
[中图分类号]DF795.4 [文献标识码]A
, 百拇医药
[文章编号]1004-5619(2000)01-0024-02
羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine)系喜树碱类抗肿瘤药物[1]，此类药物对消化道、泌尿系统有毒性,还影响造血功能[2]。
目前未见有体内测定羟基喜树碱方法的报道[3,4]。本研究建立了用RP-HPLC法测定人体血清中羟基喜树碱含量的方法。
1 实验方法
1.1 仪器
HP1090SerialⅡ高效液相色谱仪，配置DAD紫外检测器。
1.2 标准品与试剂
羟基喜树碱(98%)(国家医药工业研究院提供),甲醇为色谱纯；水为双蒸水；其它试剂均为分析纯。
, 百拇医药
1.3 标准溶液配制
标准储备液：精密称取羟基喜树碱标样5.0mg于250ml容量瓶中，加0.1mol/LKOH溶液溶解定容，4℃下避光保存。
标准工作液：精密量取储备液1ml至10ml棕色容量瓶中，加0.1mol/LKOH溶液定容稀释为2ng/μl，4℃下避光保存。0.0625mol/L磷酸缓冲溶液(pH6.4)：称取磷酸二氢钾1.7g于500ml容量瓶中，加水450ml溶解，用0.1mol/LKOH溶液调节pH至6.4，加水至刻度，5号沙芯漏斗抽滤后备用。
1.4 样品预处理
取血清样品1.0ml置于5ml具塞离心管中，逐滴加入乙腈3ml，沉淀蛋白，超声提取5min，3000r/min离心5min，吸取上清液至另一5ml离心管中，抽真空干燥后，用0.1mol/LKOH溶液50μl溶解残留物，取20μl进HPLC测定。
, http://www.100md.com
1.5 色谱条件
色谱柱：HPHypersilODS柱(10cm×4.6mm，5μm);流动相：甲醇：0.0625mol/L磷酸缓冲溶液(pH6.4)35:65,流速：0.5ml/min;柱温：40℃;紫外检测波长：385nm。
2 实验结果
2.1 色谱图
用本法所得空白血清和血清加标样色谱图见图1，从图1中我们可以看到，血清中的内源性杂质不干扰羟基喜树碱的测定。
图1 色谱图
A.血清加标样B.空白血清;1.羟基喜树碱tR=4.4min
, http://www.100md.com
2.2 标准曲线及最低检出限
取空白血清1.0ml若干份，分别加入羟基喜树碱标样20、40、100、200、400ng，制成血清加标准品样品系列，依1.4所述方法处理后进行HPLC分析，以峰面积(A)对标样量(X)作图，得标准工作曲线，血清中的羟基喜树碱在0～400ng范围内有良好的线性关系，回归方程为：
A=401893X+113.43，r=0.9946
血清中羟基喜树碱的最低检出限为5ng/m1。
2.3 提取回收率及稳定性
取空白血清1.0ml若干份，分别加入羟基喜树碱标样40、200ng，依1.4所述方法处理后进行HPLC分析，测得提取回收率为62%～65%，RSD=3.1%(n=5)。
, http://www.100md.com
3 讨论
3.1 预处理条件的选择
羟基喜树碱性质不稳定，受热见光易变性，难溶于水及一般有机溶剂，不易用有机溶剂萃取法提取。羟基喜树碱在碱性条件下结构发生变化，内酯环开环成盐，易溶于水。在碱性条件下，可以得到良好的效果,用乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进行HPLC分析，但碱性条件下，乙腈沉淀蛋白的能力下降，内源性干扰杂质增多对色谱图有干扰。因此将血清调节成不同的pH后进行分析，表明无需调节血清成碱性，直接用乙腈沉淀蛋白后，即能满足羟基喜树碱的分析测定。
由于羟基喜树碱的用药量极小，血清中药浓很低，为提高检出限，将上清液抽真空干燥后，用0.1mol/LKOH溶液50μl溶解残留物，取20μl进行HPLC分析，最低检出限可达5ng/ml。抽真空干燥能减少预处理过程中羟基喜树碱的变性。
3.2 色谱条件的选择
, 百拇医药
3.2.1 流动相
流动相中甲醇组份增大，羟基喜树碱出峰时间减少，为了消除血清中内源性杂质的干扰，优化峰形，并加快分析速度，最后选用甲醇：磷酸缓冲液为35：65，此时羟基喜树碱tR为4.4min。
3.2.2 检测波长
图2 羟基喜树碱羧化物光谱图
图3 不同检测波长的色谱图
A.385nm B.265nm
用HP 1090 DAD紫外检测器对羟基喜树碱羧化物进行全扫描，见图2。标样在220nm、265nm和385nm处有峰值吸收，峰高比为1.5：1:1。但在低波长检测时，血清中杂质干扰较多，同时考虑提高灵敏度，故选用385nm波长检测，得到良好的效果(见图3)。
, 百拇医药
参考文献:
[1]肯彬.抗肿瘤药物羟基喜树碱[J].医药工业，1985，16(12)：22-27.
[2]沈克温,王诸明,韩永平主编.实用药物分离鉴定手册[M].第1版.北京:人民军医出版社,1986.
[3]姚培惶.HPLC测定喜树碱的含量[J].中国药学杂志.1994，29(3)：165-166.
[4] Scott DO. Plasma Pharmacokinetics of the Lactone and Carboxylate Forms of 20(s)- Camptothecine in Anesthetized Rats[J]. Pharmaceutical Research. 1993， 10(10)： 1993.
(收稿日期：1999-03-03), http://www.100md.com
单位：谢兴夫(浙江省人民检察院技术处,浙江杭州 310012)；徐文卿 陈臻(江山市人民医院,浙江 324100)
关键词：RP-HPLC法；羟基喜树碱；血清
法医学杂志000110
[摘要]建立了用RP-HPLC法测定血清中羟基喜树碱含量的方法。文中采用ODS不锈钢柱(10cm×4.6mm,5μm)，流动相为甲醇:0.625mol/L磷酸缓冲溶液(pH6.4)35:65，流速为0.5ml/min，检测波长为385nm，羟基喜树碱的保留时间为4.4min。回收率为62.0%，RSD=3.6%(n=5)。在0～400ng/ml浓度范围内有较好的相关性，r=0.9946，血清中最低检出限为5ng/m1。
[中图分类号]DF795.4 [文献标识码]A
, 百拇医药
[文章编号]1004-5619(2000)01-0024-02
羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine)系喜树碱类抗肿瘤药物[1]，此类药物对消化道、泌尿系统有毒性,还影响造血功能[2]。
目前未见有体内测定羟基喜树碱方法的报道[3,4]。本研究建立了用RP-HPLC法测定人体血清中羟基喜树碱含量的方法。
1 实验方法
1.1 仪器
HP1090SerialⅡ高效液相色谱仪，配置DAD紫外检测器。
1.2 标准品与试剂
羟基喜树碱(98%)(国家医药工业研究院提供),甲醇为色谱纯；水为双蒸水；其它试剂均为分析纯。
, 百拇医药
1.3 标准溶液配制
标准储备液：精密称取羟基喜树碱标样5.0mg于250ml容量瓶中，加0.1mol/LKOH溶液溶解定容，4℃下避光保存。
标准工作液：精密量取储备液1ml至10ml棕色容量瓶中，加0.1mol/LKOH溶液定容稀释为2ng/μl，4℃下避光保存。0.0625mol/L磷酸缓冲溶液(pH6.4)：称取磷酸二氢钾1.7g于500ml容量瓶中，加水450ml溶解，用0.1mol/LKOH溶液调节pH至6.4，加水至刻度，5号沙芯漏斗抽滤后备用。
1.4 样品预处理
取血清样品1.0ml置于5ml具塞离心管中，逐滴加入乙腈3ml，沉淀蛋白，超声提取5min，3000r/min离心5min，吸取上清液至另一5ml离心管中，抽真空干燥后，用0.1mol/LKOH溶液50μl溶解残留物，取20μl进HPLC测定。
, http://www.100md.com
1.5 色谱条件
色谱柱：HPHypersilODS柱(10cm×4.6mm，5μm);流动相：甲醇：0.0625mol/L磷酸缓冲溶液(pH6.4)35:65,流速：0.5ml/min;柱温：40℃;紫外检测波长：385nm。
2 实验结果
2.1 色谱图
用本法所得空白血清和血清加标样色谱图见图1，从图1中我们可以看到，血清中的内源性杂质不干扰羟基喜树碱的测定。
图1 色谱图
A.血清加标样B.空白血清;1.羟基喜树碱tR=4.4min
, http://www.100md.com
2.2 标准曲线及最低检出限
取空白血清1.0ml若干份，分别加入羟基喜树碱标样20、40、100、200、400ng，制成血清加标准品样品系列，依1.4所述方法处理后进行HPLC分析，以峰面积(A)对标样量(X)作图，得标准工作曲线，血清中的羟基喜树碱在0～400ng范围内有良好的线性关系，回归方程为：
A=401893X+113.43，r=0.9946
血清中羟基喜树碱的最低检出限为5ng/m1。
2.3 提取回收率及稳定性
取空白血清1.0ml若干份，分别加入羟基喜树碱标样40、200ng，依1.4所述方法处理后进行HPLC分析，测得提取回收率为62%～65%，RSD=3.1%(n=5)。
, http://www.100md.com
3 讨论
3.1 预处理条件的选择
羟基喜树碱性质不稳定，受热见光易变性，难溶于水及一般有机溶剂，不易用有机溶剂萃取法提取。羟基喜树碱在碱性条件下结构发生变化，内酯环开环成盐，易溶于水。在碱性条件下，可以得到良好的效果,用乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进行HPLC分析，但碱性条件下，乙腈沉淀蛋白的能力下降，内源性干扰杂质增多对色谱图有干扰。因此将血清调节成不同的pH后进行分析，表明无需调节血清成碱性，直接用乙腈沉淀蛋白后，即能满足羟基喜树碱的分析测定。
由于羟基喜树碱的用药量极小，血清中药浓很低，为提高检出限，将上清液抽真空干燥后，用0.1mol/LKOH溶液50μl溶解残留物，取20μl进行HPLC分析，最低检出限可达5ng/ml。抽真空干燥能减少预处理过程中羟基喜树碱的变性。
3.2 色谱条件的选择
, 百拇医药
3.2.1 流动相
流动相中甲醇组份增大，羟基喜树碱出峰时间减少，为了消除血清中内源性杂质的干扰，优化峰形，并加快分析速度，最后选用甲醇：磷酸缓冲液为35：65，此时羟基喜树碱tR为4.4min。
3.2.2 检测波长
图2 羟基喜树碱羧化物光谱图
图3 不同检测波长的色谱图
A.385nm B.265nm
用HP 1090 DAD紫外检测器对羟基喜树碱羧化物进行全扫描，见图2。标样在220nm、265nm和385nm处有峰值吸收，峰高比为1.5：1:1。但在低波长检测时，血清中杂质干扰较多，同时考虑提高灵敏度，故选用385nm波长检测，得到良好的效果(见图3)。
, 百拇医药
参考文献:
[1]肯彬.抗肿瘤药物羟基喜树碱[J].医药工业，1985，16(12)：22-27.
[2]沈克温,王诸明,韩永平主编.实用药物分离鉴定手册[M].第1版.北京:人民军医出版社,1986.
[3]姚培惶.HPLC测定喜树碱的含量[J].中国药学杂志.1994，29(3)：165-166.
[4] Scott DO. Plasma Pharmacokinetics of the Lactone and Carboxylate Forms of 20(s)- Camptothecine in Anesthetized Rats[J]. Pharmaceutical Research. 1993， 10(10)： 1993.
(收稿日期：1999-03-03), http://www.100md.com