LPS和几种促炎细胞因子促进人血管平滑肌细胞iNOS mRNA的表达
作者：熊静波 康格非
单位：熊静波(重庆医大临床生化教研室，重庆400016)；康格非(重庆医大临床生化教研室，重庆400016)
关键词：脂多糖；细胞因子；一氧化氮；一氧化氮合酶；血管平滑肌
基础医学与临床000118
摘要：LPS、rhIL-1b、rhIL-6、rhTNF-a和rhIFN-g 单独或两两组合加于培养的人血管平滑肌细胞(hVSMC)，测定了hVSMC NOS活性，cGMP含量，iNOS mRNA表达丰度和培养液中NO2-浓度。LPS和细胞因子都能诱导hVSMC表达iNOS mRNA，升高hVSMC NOS活性、cGMP含量和培养液中NO2-浓度；TNF-a是受试细胞因子中唯一能与另外三种细胞因子分别组合都显示出协同效应的细胞因子；LPS 和其余三种细胞因子间的两两组合都没有显示出协同效应；本研究结果表明：LPS、rhTNF-a、rhIL-1b、rhIL-6、rhTNF-a、rhIFN-g都能诱导hVSMC合成NO；TNF-a可能是诱导hVSMC iNOS表达的致炎细胞因子中最为重要的。
, 百拇医药
中图分类号：Q954.66 文献标识码：A
文章编号：1001-6325(2000)01-0066-04
LPS and several proinflammatory cytokines induce iNOS
mRNA expression in hVSMC
XIONG Jing-bo，KANG Ge-fei
(Department clinical of Biochemistry，chong qing University of Medical Sciences，chong qing 400016，China)
Abstract:After human vascular smooth muscle cells (hVSMC)were incubated with LPS、rhIL-1b、rhIL-6、rhTNF-a and rhIFN-g alone or the combinations of any two of them respectively for 24h，iNOS mRNA ，NOS activity，cGMP in hVSMC and nitrite in the culture medium were determined.The stimulants could all induce the expression of iNOS mRNA.rhTNF-a could synergize with rhIL-1 b、rhIL-6 and rhIFN-g respectively to induce NOS activity and cGMP increase in hVSMC and nitrite accumulation in the culture medium.The other combinations showed no synergic effect.These results indicate that LPS and the cytokines mentioned above can induce iNOS mRNA expression，NOS activity and inducible nitric oxide synthesis in hVSMC .rhTNF-a is the most important regulator of iNOS expression among the factors studied.
, 百拇医药
Key words:Lipopolysaccharid； cytokines； nitric oxide； nitric oxide synthase； vascular smooth muscle
大鼠在LPS及IL-1b、TNF-a等细胞因子诱导下，有iNOS表达并合并NO，诱生性NO的合成与大鼠内毒素休克低血压及血管对去甲肾上腺素的低反应性相关。在内毒素血症及感染性休克病人，其血清硝酸盐及亚硝酸盐浓度也有升高，NO可能是人类休克时血液动力学变化的重要介质[1]。因脓血症时有LPS及促炎细胞因子IL-1b、TNF-a、IL-6、IFN-g升高，所以，研究它们对人血管平滑肌细胞(hVSMC)，iNOS表达的调控有重要意义。
iNOS 的表达有种属差异，鼠类巨噬细胞在TNF-a刺激下可有iNOS表达，但人单核巨噬细胞却难诱导iNOS活性，尽管鼠类血管平滑肌细胞iNOS 表达调控的研究已见诸报道，但人血管平滑肌细胞iNOS表达调控的研究却很少。本研究的目的就是研究LPS及IL-1b、TNF-a、IL-6、IFN-g是否可诱导hVSMC iNOS的表达，因为细胞因子对iNOS 的诱导常表现出协同效应，故在本研究中，还将观察上述因子间两联合对hVSMC iNOS诱导的效应。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂、药品及仪器设备
1.1.1 主要试剂、药品及其配制：LPS(Difico，美国)，rhIFN-a、rhIL-1b、rhIL-6及rhIFN-g(北京邦定生物医学公司)，IBMX(Sigma，美国)，cGMP放免测定试剂盒(上海中医学院同位素室)，iNOS cDNA 质粒(上海中医学院同位素室)，iNOS cDNA质粒(源于大鼠巨噬细胞，美国康耐尔大学赠)，RNA 酶A(Promega，美国)，随机引物标记试剂盒(Promega，美国)，脱氧胞苷5'-[a-32P] 三磷酸盐(北京亚辉生物医学工程公司)，含酚红DMEM(Sigma，美国)，无酚红DMEM(Sigma，美国)，DMEM cat NO.D5523 ，b-巯基乙醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、leupeptin、antipain、pepsptain、PMSM购于Sigma公司。
1.2.2 主要仪器设备：细胞培养有关仪器设备、恒温摇床(Thermolyne，美国)、高速冷冻离心纲(HITACHI，日本)、超声组织细胞破碎仪(江苏)、450型酶标仪(BIO-RAID，美国)、UV-300双波长分光光度计(岛津 ，日本)、SN-682放射免疫g-计数器(中科院上海原子核研究所日环仪器厂)。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养：从脐动脉用贴块法培养人血管平滑肌细胞[2]。
1.2.2 LPS和细胞因子与hVSMC孵育：测定培养上清NOS2-和hVSMC内cGMP时，细胞培养于24孔板，细胞接种密度为104 /cm2，使用的培养基为含酚红及20%新生牛血清(NBCS)的DMEM。待细胞融合成单层后，吸去含酚红DMEM，用Hank's 液洗细胞两次，加入含0.1% BSA无酚红、无血清DMEM静息细胞24h，吸去无血清DMEM，重新加入含0.1% BSA无酚红、无血清DMEM，加入LPS(10mg/mL)IL-1 b(10u/mL)，TNF-a(500u/mL)，IFN-g(100u/mL)，IL-6(200u/mL)，置CO2培养箱24h后收集样品测定NO2-、cGMP和 蛋白质。测定hVSMC NOS活性和提取细胞总RNA时，细培养于直径9cm玻璃平皿。细胞处理方法同上。
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1.2.3 细胞培养上清亚硝酸根(NO2-)的测定：用格氏试剂法
1.2.4 cGMP的测定：用放射免疫法[3]
1.2.5 蛋白质含量的测定：用微量Lowry法测定[4]
1.2.6 hVSMC NOS活性测定 NOS活性测定样品制备：培养于直径9cm平皿的hVSMC在和LPS及细胞因子孵育24h后，倒掉培养液，用PBS洗细胞两次，加入PBS，刮下细胞。四个平皿刮下的细胞合并一起，1 000r/min离心5min，倒掉上清，加入NOS测定细胞匀浆缓冲液[5] 0.6mL，在冰浴中超声匀浆细胞。匀浆时输出功率为300W，每次超声10s，共 超声3次。在超速冷冻离心机上于4℃以14 000 r/min 离心20min。上清保存于-70℃冰箱内用于NOS测定。
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NOS活性测定原理基于NO与氧合血红蛋白反应生成高铁血红蛋白[6]，用岛津UV-300 双波长分光光度计测定NOS活性。样品蛋白质含量用微量Lowry法测定，酶活性以nmol/(min·mg prot.)表示。
1.2.7 hVSMC总RNA的提取：硫氰胍一步法
1.2.8 iNOS cDNA质粒的提取、酶切鉴定、探针回收、标记与斑点杂交：质粒的提取用碱裂解法、用透析袋电洗脱法回收 iNOS cDNA质粒pst Ⅰ酶切670bp片段作探针，iNOS 探针用随机引物法标。记斑点杂交后NC膜放于有增感屏的暗盒，压上X光片，于-70℃冰箱显影3天。
1.2.9 统计：实验数据用OXSTAAT-Ⅱ数理统计程序进行统计，结果以
±s表示：对结果作方差分析。
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2 结果
2.1 LPS和细胞因子刺激hVSMC 产生NO与LPS和细胞因子呈剂量依赖关系
2.2 TNF-a 可分别与IL-6、IL-1b、IFN-g协同诱导hVSMC NOS活性，合成NO，升高hVSMC cGMP含量
表1 TNF-a 分别与IL-1b、IL-6、IFN-g协同诱导hVSMC NOS活性、cGMP含量和hVSMC
培养液中NO2-浓度升高
Table 1 TNF-a acts synergistically with IL-1b、IL-6、IFN-g respectively to induce the increase of NOS activity ，cGMP in hVSMC and of NO2-in the medium of cultured hVSMC(n=3) stimulants
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NO2-
(nmol/mg protein)
cGMP
(pmol/mg protein)
NOS activity
[nmol/(min。mg protein)]
control
6.3±3.2
5.3±3.1
1.9±0.4
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LPS
55.2±8.9++
1.1±5.3++
5.5±0.2++
IL-1b
70.4±14.9+
80.6±7.8++
7.1±0.4++
IL-6
60.5±7.9++
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70.5±5.3++
6.2±0.4++
TNF-a
80.5±15.2+
100.1±20.2++
8.9±0.8++
IFN-g
180.1±15.8++
180.2±11.7++
11.2±0.6++
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LPS+IL-1b
68.3±7.4
84.9±6.1
5.3±0.3
LPS+IL-6
62.4±5.3
65.3±8.2
6.0±0.5
LPS+TNF-a
85.6±8.1
95.1±14.7
8.2±1.2
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LPS+IFN-g
160.5±1.2
190.5±24.6
11.4±1.4
IL-1b+IL-6
72.3±8.2
83.2±6.3
6.8±1.0
IL-1b+TNF-a
249.9±19.4**
230.5±15.4**
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15.3±0.7**
IL-1b+TNF-g
190.6±18.3
180.6±10.1
11.0±0.3
IL-6+TNF-a
120.1±15.7△
140.1±7.8△
12.5±0.6△△
IL-6+IFN-g
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160.4±20.1
174.8±15.2
10.5±0.7
TNF-a+IFN-g
280.3±25.1#
256.5±25.7#
20.4±2.2#
VS control:+，P<0.05，++，P<0.01. VS the groups treated with IL-6 or TNF-a alone；△ ，P<0.05，△△，P<0.01. VS the group treated with IL-1 b or TNF-a alone:**，P<0.01，VS the group treated with IFN-g or TNF-a:#，P<0.05.
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3 讨论
NO容易氧化为NO2-和NO3- 因此培养液中的高低可反映NO合成的多少。NO又可激活VSMC 腺苷酸环化酶，升高VSMC内cGMP 含量，因此，VSMC内cGMP的多少也可以反映VSMC诱生性NO合成的多少。从hVSMC NOS 活性、cGMP含量hVSMC 培养液NO2-水平来看，TNF-a与IL-1b、IL-6、IFN-g分别组合后，其诱导效应比它们单独作用要强，表现出协同效应，而LPS与细胞因子间的两两组合以及IL-1b、IFN-g、IL-6 之间的两两组合，均未表现出协同效应，因此，TNF-a可能是诱导hVSMV iNOS表达的致炎细胞因子中最为重要的。LPS、IL-1b、IL-6、TNF-a、IFN-g都可诱导hVSMC iNOS mRNA表达。由于斑点杂交重复次数不够，TNF-a与其它因子分别联合后诱导hVSMC iNOS mRNA表达是否比TNF-a 单独诱导hVSMC iNOS mRNA表达要强，还有待进一步研究。
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LPS可诱导hVSMC iNOS mRNA表达，显示出NOS活性，合成NO，从而升高hVSMC cGMP，但是在VSMC并没有发现LPS的特异性受体，因此LPS究竟通过何种途径传递信号尚不清楚。不过，LPS可诱导VSMC产生IL-1和TNF-a，而TNF-a 和IL-1都可诱导VSMC iNOS mRNA 的表达，因此LPS诱导hVSMC iNOS 表达可能通过IL-1和TNF-a介导 。
IL-1b刺激大鼠胸主动脉环数小时后，可抑制动脉环的收缩反应，NOS抑制剂可改善动脉收缩反应，以后的试验证明，IL-1b可诱导鼠类VSMC表达iNOS mRNA[7]，这证明VSMC iNOS表达与脓毒血症持续低血压相关。本实验中，IL-1b可诱导hVSMC iNOS mRNA表达，合成NO，故人类感染性休克低血压的发生也与IL-1b诱导 hVSMC iNOS 表达有关。
IL-6 单抗能降低LPS和TNF-a引起的动物死亡率。人类脓毒血症患者血清IL-6 升高，提示IL-6 可能参与人类休克病理过程[8]。但也有实验表明IL-6在休克中起的作用很小[9]。本实验结果表明，IL-6 可诱导hVSMC iNOS表达，并与TNF-a有协同效用，支持IL-6在休克中起作用的观点。
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用抗体中和IFN-g的作用可降低内毒素休克的死亡率[10]。这说明，IFN-g是内毒素休克的重要介质。本实验结果证实IFN-g可诱导hVSMC 表达iNOS，提示IFN-g参与人类休克的病理过程。
图1 LPS和细胞因子升高hVSMC培养液NO2-浓度与LPS和细胞因子浓度呈剂量依赖关系
Fig 1 LPS and cytokines cause aconcentration-dpendent increase of NO2- in the medium of cultured hVVSMC
hVSMC were incubated for 24hr in control medium or medium containing various concentration or cytokines of LPS ；n=3 for each group.VS control：* ，P<0.05 ；** ，P<0.01
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图2 LPS和细胞因子诱导hVSMC iNOS mRNA表达(A)，每点点20mg总RNA
Fig 2 LPS and cytokines induce iNOS mRNA expression in hVSMC(A).20 mg total RNA was loaded for each dot.
Stimulants for dots in Fig A are indicated in Fig B according to the position of dots in Fig A
[1]Gomez-Jimenez J，Salgado A，Mourelle M，et al.L-arginine:nitric oxide pathway in endotoxemia and human septic shock[J].Cirt Care Med，1995，23:253-258.
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[2]熊静波，彭永正.康格非，等.人脐动脉血管平滑肌细胞贴块培养法[J].重庆医科大学学报，1996，21(4):311-313.
[3]Marczin N，Ryan US，catravas JD，et al.Effects of oxidant stress on endothelium-derived relasing factor-induced cGMP accumulation in vascular cells in culture[J].Cire Res，1992，43:109-142.
[4]李红兵，李宗让，王志玲，等.微量Lowry 法测定蛋白[J].生物化学与生物物理学进展，1993，20：402-404.
[5]Ryoyama K，Nomura T，Nakamura S，et al.Inhibition of macrophage nituic oxide production by arachidonate cascade inhibitors[J].Cancer Immunol Immunother，1993，37 ：385-391.
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[6]Knowles RG，salter M，brooks SL，et al.Antiinflammatory glucocorticoids inhibit the induction by endotoxin of nitric oxide synthase in the lung，liver and aorta of the rat[J].Biochem Biophys Res Commun，1990，172(3):1042-1048
[7]Nakayama I，Kawahara Y，Tsuda T，et al.Argiotensin inhibits cytokine-stimulated inducible nitric oxide synthase expression in vascular muscle cells[J].J Biol Chem ，1994，269:11628-11633.
[8]Hack CE，De Groot ER，Felt-Bersma JF，et al.Increased plasma levels of interleukin-6 in sepsis[J].Blood，1989，74:1704-1710.
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[9]Libert CA，Coulie VP,Brouckaert P，et al.Limited involvemeat of interleukin-6 in pathogenesis of lethal septic shock as revealed by the effect of monoclonal antibodlyies against interleukin-6 or its receptor in various murine model[J].Eur J Immunol，1992，22:2625-2630.
[10]Heinzel EP.The role of IFN-g in the pathology of experimental endotoxemia[J].J Immunol，1990，145:2920-2924.
收稿日期：1998-01-09；修订日期：1998-04-28, 百拇医药
单位：熊静波(重庆医大临床生化教研室，重庆400016)；康格非(重庆医大临床生化教研室，重庆400016)
关键词：脂多糖；细胞因子；一氧化氮；一氧化氮合酶；血管平滑肌
基础医学与临床000118
摘要：LPS、rhIL-1b、rhIL-6、rhTNF-a和rhIFN-g 单独或两两组合加于培养的人血管平滑肌细胞(hVSMC)，测定了hVSMC NOS活性，cGMP含量，iNOS mRNA表达丰度和培养液中NO2-浓度。LPS和细胞因子都能诱导hVSMC表达iNOS mRNA，升高hVSMC NOS活性、cGMP含量和培养液中NO2-浓度；TNF-a是受试细胞因子中唯一能与另外三种细胞因子分别组合都显示出协同效应的细胞因子；LPS 和其余三种细胞因子间的两两组合都没有显示出协同效应；本研究结果表明：LPS、rhTNF-a、rhIL-1b、rhIL-6、rhTNF-a、rhIFN-g都能诱导hVSMC合成NO；TNF-a可能是诱导hVSMC iNOS表达的致炎细胞因子中最为重要的。
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中图分类号：Q954.66 文献标识码：A
文章编号：1001-6325(2000)01-0066-04
LPS and several proinflammatory cytokines induce iNOS
mRNA expression in hVSMC
XIONG Jing-bo，KANG Ge-fei
(Department clinical of Biochemistry，chong qing University of Medical Sciences，chong qing 400016，China)
Abstract:After human vascular smooth muscle cells (hVSMC)were incubated with LPS、rhIL-1b、rhIL-6、rhTNF-a and rhIFN-g alone or the combinations of any two of them respectively for 24h，iNOS mRNA ，NOS activity，cGMP in hVSMC and nitrite in the culture medium were determined.The stimulants could all induce the expression of iNOS mRNA.rhTNF-a could synergize with rhIL-1 b、rhIL-6 and rhIFN-g respectively to induce NOS activity and cGMP increase in hVSMC and nitrite accumulation in the culture medium.The other combinations showed no synergic effect.These results indicate that LPS and the cytokines mentioned above can induce iNOS mRNA expression，NOS activity and inducible nitric oxide synthesis in hVSMC .rhTNF-a is the most important regulator of iNOS expression among the factors studied.
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Key words:Lipopolysaccharid； cytokines； nitric oxide； nitric oxide synthase； vascular smooth muscle
大鼠在LPS及IL-1b、TNF-a等细胞因子诱导下，有iNOS表达并合并NO，诱生性NO的合成与大鼠内毒素休克低血压及血管对去甲肾上腺素的低反应性相关。在内毒素血症及感染性休克病人，其血清硝酸盐及亚硝酸盐浓度也有升高，NO可能是人类休克时血液动力学变化的重要介质[1]。因脓血症时有LPS及促炎细胞因子IL-1b、TNF-a、IL-6、IFN-g升高，所以，研究它们对人血管平滑肌细胞(hVSMC)，iNOS表达的调控有重要意义。
iNOS 的表达有种属差异，鼠类巨噬细胞在TNF-a刺激下可有iNOS表达，但人单核巨噬细胞却难诱导iNOS活性，尽管鼠类血管平滑肌细胞iNOS 表达调控的研究已见诸报道，但人血管平滑肌细胞iNOS表达调控的研究却很少。本研究的目的就是研究LPS及IL-1b、TNF-a、IL-6、IFN-g是否可诱导hVSMC iNOS的表达，因为细胞因子对iNOS 的诱导常表现出协同效应，故在本研究中，还将观察上述因子间两联合对hVSMC iNOS诱导的效应。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂、药品及仪器设备
1.1.1 主要试剂、药品及其配制：LPS(Difico，美国)，rhIFN-a、rhIL-1b、rhIL-6及rhIFN-g(北京邦定生物医学公司)，IBMX(Sigma，美国)，cGMP放免测定试剂盒(上海中医学院同位素室)，iNOS cDNA 质粒(上海中医学院同位素室)，iNOS cDNA质粒(源于大鼠巨噬细胞，美国康耐尔大学赠)，RNA 酶A(Promega，美国)，随机引物标记试剂盒(Promega，美国)，脱氧胞苷5'-[a-32P] 三磷酸盐(北京亚辉生物医学工程公司)，含酚红DMEM(Sigma，美国)，无酚红DMEM(Sigma，美国)，DMEM cat NO.D5523 ，b-巯基乙醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、leupeptin、antipain、pepsptain、PMSM购于Sigma公司。
1.2.2 主要仪器设备：细胞培养有关仪器设备、恒温摇床(Thermolyne，美国)、高速冷冻离心纲(HITACHI，日本)、超声组织细胞破碎仪(江苏)、450型酶标仪(BIO-RAID，美国)、UV-300双波长分光光度计(岛津 ，日本)、SN-682放射免疫g-计数器(中科院上海原子核研究所日环仪器厂)。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养：从脐动脉用贴块法培养人血管平滑肌细胞[2]。
1.2.2 LPS和细胞因子与hVSMC孵育：测定培养上清NOS2-和hVSMC内cGMP时，细胞培养于24孔板，细胞接种密度为104 /cm2，使用的培养基为含酚红及20%新生牛血清(NBCS)的DMEM。待细胞融合成单层后，吸去含酚红DMEM，用Hank's 液洗细胞两次，加入含0.1% BSA无酚红、无血清DMEM静息细胞24h，吸去无血清DMEM，重新加入含0.1% BSA无酚红、无血清DMEM，加入LPS(10mg/mL)IL-1 b(10u/mL)，TNF-a(500u/mL)，IFN-g(100u/mL)，IL-6(200u/mL)，置CO2培养箱24h后收集样品测定NO2-、cGMP和 蛋白质。测定hVSMC NOS活性和提取细胞总RNA时，细培养于直径9cm玻璃平皿。细胞处理方法同上。
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1.2.3 细胞培养上清亚硝酸根(NO2-)的测定：用格氏试剂法
1.2.4 cGMP的测定：用放射免疫法[3]
1.2.5 蛋白质含量的测定：用微量Lowry法测定[4]
1.2.6 hVSMC NOS活性测定 NOS活性测定样品制备：培养于直径9cm平皿的hVSMC在和LPS及细胞因子孵育24h后，倒掉培养液，用PBS洗细胞两次，加入PBS，刮下细胞。四个平皿刮下的细胞合并一起，1 000r/min离心5min，倒掉上清，加入NOS测定细胞匀浆缓冲液[5] 0.6mL，在冰浴中超声匀浆细胞。匀浆时输出功率为300W，每次超声10s，共 超声3次。在超速冷冻离心机上于4℃以14 000 r/min 离心20min。上清保存于-70℃冰箱内用于NOS测定。
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NOS活性测定原理基于NO与氧合血红蛋白反应生成高铁血红蛋白[6]，用岛津UV-300 双波长分光光度计测定NOS活性。样品蛋白质含量用微量Lowry法测定，酶活性以nmol/(min·mg prot.)表示。
1.2.7 hVSMC总RNA的提取：硫氰胍一步法
1.2.8 iNOS cDNA质粒的提取、酶切鉴定、探针回收、标记与斑点杂交：质粒的提取用碱裂解法、用透析袋电洗脱法回收 iNOS cDNA质粒pst Ⅰ酶切670bp片段作探针，iNOS 探针用随机引物法标。记斑点杂交后NC膜放于有增感屏的暗盒，压上X光片，于-70℃冰箱显影3天。
1.2.9 统计：实验数据用OXSTAAT-Ⅱ数理统计程序进行统计，结果以
±s表示：对结果作方差分析。, 百拇医药
2 结果
2.1 LPS和细胞因子刺激hVSMC 产生NO与LPS和细胞因子呈剂量依赖关系
2.2 TNF-a 可分别与IL-6、IL-1b、IFN-g协同诱导hVSMC NOS活性，合成NO，升高hVSMC cGMP含量
表1 TNF-a 分别与IL-1b、IL-6、IFN-g协同诱导hVSMC NOS活性、cGMP含量和hVSMC
培养液中NO2-浓度升高
Table 1 TNF-a acts synergistically with IL-1b、IL-6、IFN-g respectively to induce the increase of NOS activity ，cGMP in hVSMC and of NO2-in the medium of cultured hVSMC(n=3) stimulants
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NO2-
(nmol/mg protein)
cGMP
(pmol/mg protein)
NOS activity
[nmol/(min。mg protein)]
control
6.3±3.2
5.3±3.1
1.9±0.4
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LPS
55.2±8.9++
1.1±5.3++
5.5±0.2++
IL-1b
70.4±14.9+
80.6±7.8++
7.1±0.4++
IL-6
60.5±7.9++
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70.5±5.3++
6.2±0.4++
TNF-a
80.5±15.2+
100.1±20.2++
8.9±0.8++
IFN-g
180.1±15.8++
180.2±11.7++
11.2±0.6++
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LPS+IL-1b
68.3±7.4
84.9±6.1
5.3±0.3
LPS+IL-6
62.4±5.3
65.3±8.2
6.0±0.5
LPS+TNF-a
85.6±8.1
95.1±14.7
8.2±1.2
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LPS+IFN-g
160.5±1.2
190.5±24.6
11.4±1.4
IL-1b+IL-6
72.3±8.2
83.2±6.3
6.8±1.0
IL-1b+TNF-a
249.9±19.4**
230.5±15.4**
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15.3±0.7**
IL-1b+TNF-g
190.6±18.3
180.6±10.1
11.0±0.3
IL-6+TNF-a
120.1±15.7△
140.1±7.8△
12.5±0.6△△
IL-6+IFN-g
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160.4±20.1
174.8±15.2
10.5±0.7
TNF-a+IFN-g
280.3±25.1#
256.5±25.7#
20.4±2.2#
VS control:+，P<0.05，++，P<0.01. VS the groups treated with IL-6 or TNF-a alone；△ ，P<0.05，△△，P<0.01. VS the group treated with IL-1 b or TNF-a alone:**，P<0.01，VS the group treated with IFN-g or TNF-a:#，P<0.05.
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3 讨论
NO容易氧化为NO2-和NO3- 因此培养液中的高低可反映NO合成的多少。NO又可激活VSMC 腺苷酸环化酶，升高VSMC内cGMP 含量，因此，VSMC内cGMP的多少也可以反映VSMC诱生性NO合成的多少。从hVSMC NOS 活性、cGMP含量hVSMC 培养液NO2-水平来看，TNF-a与IL-1b、IL-6、IFN-g分别组合后，其诱导效应比它们单独作用要强，表现出协同效应，而LPS与细胞因子间的两两组合以及IL-1b、IFN-g、IL-6 之间的两两组合，均未表现出协同效应，因此，TNF-a可能是诱导hVSMV iNOS表达的致炎细胞因子中最为重要的。LPS、IL-1b、IL-6、TNF-a、IFN-g都可诱导hVSMC iNOS mRNA表达。由于斑点杂交重复次数不够，TNF-a与其它因子分别联合后诱导hVSMC iNOS mRNA表达是否比TNF-a 单独诱导hVSMC iNOS mRNA表达要强，还有待进一步研究。
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LPS可诱导hVSMC iNOS mRNA表达，显示出NOS活性，合成NO，从而升高hVSMC cGMP，但是在VSMC并没有发现LPS的特异性受体，因此LPS究竟通过何种途径传递信号尚不清楚。不过，LPS可诱导VSMC产生IL-1和TNF-a，而TNF-a 和IL-1都可诱导VSMC iNOS mRNA 的表达，因此LPS诱导hVSMC iNOS 表达可能通过IL-1和TNF-a介导 。
IL-1b刺激大鼠胸主动脉环数小时后，可抑制动脉环的收缩反应，NOS抑制剂可改善动脉收缩反应，以后的试验证明，IL-1b可诱导鼠类VSMC表达iNOS mRNA[7]，这证明VSMC iNOS表达与脓毒血症持续低血压相关。本实验中，IL-1b可诱导hVSMC iNOS mRNA表达，合成NO，故人类感染性休克低血压的发生也与IL-1b诱导 hVSMC iNOS 表达有关。
IL-6 单抗能降低LPS和TNF-a引起的动物死亡率。人类脓毒血症患者血清IL-6 升高，提示IL-6 可能参与人类休克病理过程[8]。但也有实验表明IL-6在休克中起的作用很小[9]。本实验结果表明，IL-6 可诱导hVSMC iNOS表达，并与TNF-a有协同效用，支持IL-6在休克中起作用的观点。
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用抗体中和IFN-g的作用可降低内毒素休克的死亡率[10]。这说明，IFN-g是内毒素休克的重要介质。本实验结果证实IFN-g可诱导hVSMC 表达iNOS，提示IFN-g参与人类休克的病理过程。
图1 LPS和细胞因子升高hVSMC培养液NO2-浓度与LPS和细胞因子浓度呈剂量依赖关系
Fig 1 LPS and cytokines cause aconcentration-dpendent increase of NO2- in the medium of cultured hVVSMC
hVSMC were incubated for 24hr in control medium or medium containing various concentration or cytokines of LPS ；n=3 for each group.VS control：* ，P<0.05 ；** ，P<0.01
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图2 LPS和细胞因子诱导hVSMC iNOS mRNA表达(A)，每点点20mg总RNA
Fig 2 LPS and cytokines induce iNOS mRNA expression in hVSMC(A).20 mg total RNA was loaded for each dot.
Stimulants for dots in Fig A are indicated in Fig B according to the position of dots in Fig A
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收稿日期：1998-01-09；修订日期：1998-04-28, 百拇医药