Fas可能是雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡的途径之一
作者：鲍一笑 张玲珍 李 莉 张登海 孔宪涛
单位：第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心，上海200003
关键词：雷公藤红素；HMC-1细胞；Fas；Fas-L；凋亡
中国免疫学杂志990205 中国图书分类号 R392.12 R285.5
摘 要 目的：探讨雷公藤红素对HMC-1细胞表达Fas、Fas-L的影响及与凋亡的关系。方法：用流式细胞仪检测细胞凋亡和Fas、Fas-L的表达。结果：HMC-1细胞能自发表达Fas，不表达Fas-L。经雷公藤红素作用，Fas呈先升后降的变化，Fas-L低水平表达。Fas阳性率下降与凋亡率增加相关。结论：Fas可能是雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡的途径之一。
Fas may be one of the molecules which mediates HMC-1 cell apoptosis induced by tripterine
, 百拇医药
BAO Yi-Xiao,ZHANG Ling-Zhen,LI Li et al.
Clinical Immunology Center of PLA,Changzheng Hospital,the Second Military Medical University ,Shanghai 200003
Abstract Objective:This paper reports the effect of tripterine on the expression Fas and Fas-L in HMC-1 cells and the relation to apoptosis.Methods:The expression of Fas/Fas-L and apoptosis were assayed by flow cytometry.Results:HMC-1 cells constituantly express Fas(22.7%),but not Fas-L.On exposure to tripterine at the concentration of 1.0 μmol/L,Fas positive rate increased to 57.5% at 2 h,then decreased to 12.5% at 4 h and 2.3% at 6 h.Fas-L expressed at lower level.There were significant relation between the decrease of Fas positive rate and increase apoptosis.Conclusion:Fas is one of the molecules which mediates HMC-1 cell apoptosis induced by tripterine.
, 百拇医药
Key words Tripterine HMC-1 cell Fas Fas-L Apoptosis
雷公藤红素是雷公藤单体之一，属三萜类色素[1] 。它能诱导人肥大细胞系HMC-1细胞凋亡[2]，但诱导凋亡的机制尚不清楚[3]。 Fas抗原(CD95)是一种膜受体，属TNFR/NGFR家族成员，表达于多种类型的细胞表面，其配体(Fas ligand ,Fas-L)主要表达于活化的淋巴细胞。Fas与Fas L结合能迅速地启动细胞凋亡。 本文研究雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡过程中Fas 及Fas-L表达的变化及与凋亡的关系，以探讨雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡的机制。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 HMC-1细胞培养于5%CO2 , 37℃孵箱中。培养基IMDM(GIBCOBRL )含10% 热灭活小牛血清，0.1 U/L青霉素，0.1 U/L 链霉素。培养细胞密度为0.5×106～1.0×106 ml-1,取对数生长期细胞待用。
, 百拇医药
1.2 细胞凋亡的检测
1.2.1 形态观察 HMC-1细胞呈圆或椭圆形。凋亡时细胞膜内陷，核浓缩，形成凋亡小体。
1.2.2 流式细胞仪(FCM) DNA含量分析 1×106个细胞加50 μl含0.1% Triton-X100 的碘化丙啶(PI) (5 μg/ml) 染色，避光放置5 min,加0.5 ml PBS, 上流式细胞仪检测,Multicycles软件分析结果。
1.2.3 DNA琼脂糖电泳 1×106细胞加100 μl TBE缓冲液， 0.25% NP-40, 0.1 mg/ml Rnase，50℃水浴30 min；再加 1 mg/ml蛋白酶K,50℃水浴30 min，即获得需要的DNA溶液。取30 μl DNA溶液于1.8%琼脂糖凝胶电泳,细胞凋亡时可出现梯形条带。
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1.3 Fas和Fas-L的测定 0.5×106 个HMC-1细胞，加鼠抗人anti-Fas或anti-Fas-L单克隆抗体20 μl，加同型非特异性IgG为阴性对照 (Immuno Tech公司),4℃共育30 min；加 FITC-anti-鼠IgM 20 μl, 4℃共育30 min。FCM检测(COULTE，EPICS XL)，计数10 000个细胞。
1.4 凋亡细胞群中Fas的测定 中晚期凋亡细胞膜透性可以增加 ，不加Triton-X100的PI可渗入细胞着色。对细胞进行Fas标记后，加0.1%PI染色，在流式细胞仪上进行双标记分析。
1.5 数据处理 t检验。
2 结果
2.1 雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡 在雷公藤红素作用下 HMC-1细胞可出现细胞皱缩，核浓缩，形成凋亡小体的形态改变(图1)。作用24 h,DNA琼脂糖电泳可见梯形条带(图2)。
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2.2 HMC-1细胞Fas和Fas-L的表达 HMC-1细胞大小不等，在流式细胞仪上根据前向散射程度可将其分为大、中、小三群，三群细胞分别占37.5%,12.1%,23.7%，三群细胞Fas的阳性率分别为20.0%,37.1%和6.5%；整群细胞表达Fas的阳性率为22.7%，不表达Fas-L 。
图1 HMC-1细胞在雷公藤红素作用下呈凋亡形态改变(HE染色，×400)
Fig.1 Tripterine induced morphological changes characteristic of apoptosis(HE stain,×400)
Note:Condensation of chromatin and apoptotic body formation in HMC-1 cells
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图2 雷公藤红素作用24 h HMC-1细胞DNA琼脂糖电泳显示梯形条带
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA from HMC-1 cells treated with tripterine for 24 hours
Note:Marker:657,458,328,289,176 bp
2.3 雷公藤红素对HMC-1细胞表达Fas和Fas-L的影响 在雷公藤红素作用下Fas 阳性率呈先升后降的变化，升高的程度和下降的速率与药物的剂量相关(图3)。 Fas-L 在1.000 μmol/L作用下，0,4,6 h分别为0,3.3%,1.8%。 0.125, 0.250, 0.500, 1.000 μmol/L 雷公藤红素作用4 h,Fas-L阳性率分别为3.4%,4.0%,5.7%和1.8% 。
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2.4 PI染色阳性细胞群中Fas阳性率增高 1.000 μmol/L雷公藤红素作用4 h，PI 染色阳性细胞为21.4%±5.0 % (n＝5)， PI阳性细胞群中Fas阳性率为29.1%±3.9 % ，PI阴性细胞群中Fas阳性率为5.7%±1.2 %，两者相比有显著差异，P<0.01。
2.5 Fas阳性率与凋亡率变化的关系 HMC-1细胞与1.000 μmol/L雷公藤红素共育，在0，2，4，8 h 同时测定Fas阳性率和细胞凋亡率，分析两者的相关性。发现Fas阳性率自2 h开始呈下降趋势，细胞凋亡率自2 h开始呈上升趋势。至6 h,Fas阳性率仅为2.3%，趋于0，细胞凋亡率继续上升，见图4。
图3 在雷公藤红素作用下流式细胞仪测定HMC-1细胞Fas阳性率的变化
Fig.3 Fas positive rate changes measured on flow cytometry in tripterine treated HMC-1 cells
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图4 HMC-1细胞在1 μmol/L雷公藤红素作用下Fas阳性率和凋亡率的变化
Fig.4 Fas and apoptotic positive rate changes in 1 μmol/L tripterine treated HMC-1 cells
3 讨论
雷公藤红素能以时间和剂量依赖方式诱导肥大细胞系HMC-1细胞凋亡，提示雷公藤红素抗炎症[4] 、治疗类风湿性关节炎[5]等与肥大细胞相关疾病的作用与此有关。
既往的研究已经表明，Fas广泛地表达于胸腺细胞，活化T、B淋巴细胞，NK细胞，单核细胞等免疫细胞表面，是介导细胞凋亡，维持细胞数量稳定的重要分子[6]。 本实验的研究表明HMC-1细胞也能表达Fas，提示Fas 在介导肥大细胞凋亡、维持肥大细胞数量稳定方面发挥重要的作用。HMC-1细胞大小不等，可能与其分化阶段不同有关。它们表达Fas的水平也不相同，提示不同分化阶段的细胞对凋亡的敏感性不同。
, 百拇医药
多种因素可影响Fas的表达，其表达水平的变化会影响到细胞对凋亡的敏感性。如外周血T细胞在超抗原作用下高水平地表达Fas和Fas-L ，由此促进T细胞的凋亡[7]。本实验发现雷公藤红素使HMC-1细胞表达Fas增高，同时诱使Fas-L呈低水平表达。雷公藤红素的这一作用可能与其诱导HMC-1细胞凋亡有关。 因为Fas的高表达提高了HMC-1细胞凋亡的敏感性，尤其在体内接触到Fas-L阳性淋巴细胞即可以引起凋亡；在体外接触到Fas-L阳性的HMC-1细胞也可引起凋亡。凋亡细胞群中Fas阳性率增高。凋亡率的增加伴随Fas阳性率的下降，二者在启动时间上一致。这些均支持雷公藤红素促进Fas表达与其诱导HMC-1细胞凋亡有关。
但是，雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡并非均由Fas介导。1.000 μmol/L雷公藤红素作用8 h，Fas阳性细胞几乎消失，而凋亡率继续升高，48 h可达90%，远远高于Fas阳性细胞比例，因此雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡还存在其它途径， Fas只是其途径之一。
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Fas可能是雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡的途径之一 国家自然科学基金资助项目(编号 39400123)
作者简介：鲍一笑，男，34岁，临床免疫学博士，主要研究哮喘的免疫机理
4 参考文献
1 岗艳云，张正行. 雷公藤及其单体的药理作用研究进展.中国药科大学学报, 1995;26 (4): 252
2 Butterfield J H, Weiler D, Dewald G et al.Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast leukemia.Leuk Res ,1988;12(4): 34
3 鲍一笑，孔宪涛，李 莉 et al.雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡及与细胞周期的关系. 中国中西医结合杂志, 1998;18(基础理论研究特集):198
, http://www.100md.com
4 徐维敏，张罗修，程彰华 et al.雷公藤红素对IL-1和IL-2活性及PGE2释放的抑制作用.药学学报, 1991; 10(9): 641
5 严云屏，施守义，施宜平 et al.雷公藤红素外用治疗类风湿性关节炎局部肿瘤.新药与临床，1989; 8(6): 365
6 Krammer P H, Daniel J, Walaczak H et al.The role of APO-1-mediated apoptosis in immune system. Immunol Rev，1994; 142:175
7 Renno T, Hahne M, Tschopp J et al. Peripheral T cells undergoing superantigen-induced apoptosis in vivo express B220 and upregulate Fas and Fas ligand. J Exp Med，1996;183(2):431
〔收稿1997-12-05 修回1998-03-23〕, 百拇医药
单位：第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心，上海200003
关键词：雷公藤红素；HMC-1细胞；Fas；Fas-L；凋亡
中国免疫学杂志990205 中国图书分类号 R392.12 R285.5
摘 要 目的：探讨雷公藤红素对HMC-1细胞表达Fas、Fas-L的影响及与凋亡的关系。方法：用流式细胞仪检测细胞凋亡和Fas、Fas-L的表达。结果：HMC-1细胞能自发表达Fas，不表达Fas-L。经雷公藤红素作用，Fas呈先升后降的变化，Fas-L低水平表达。Fas阳性率下降与凋亡率增加相关。结论：Fas可能是雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡的途径之一。
Fas may be one of the molecules which mediates HMC-1 cell apoptosis induced by tripterine
, 百拇医药
BAO Yi-Xiao,ZHANG Ling-Zhen,LI Li et al.
Clinical Immunology Center of PLA,Changzheng Hospital,the Second Military Medical University ,Shanghai 200003
Abstract Objective:This paper reports the effect of tripterine on the expression Fas and Fas-L in HMC-1 cells and the relation to apoptosis.Methods:The expression of Fas/Fas-L and apoptosis were assayed by flow cytometry.Results:HMC-1 cells constituantly express Fas(22.7%),but not Fas-L.On exposure to tripterine at the concentration of 1.0 μmol/L,Fas positive rate increased to 57.5% at 2 h,then decreased to 12.5% at 4 h and 2.3% at 6 h.Fas-L expressed at lower level.There were significant relation between the decrease of Fas positive rate and increase apoptosis.Conclusion:Fas is one of the molecules which mediates HMC-1 cell apoptosis induced by tripterine.
, 百拇医药
Key words Tripterine HMC-1 cell Fas Fas-L Apoptosis
雷公藤红素是雷公藤单体之一，属三萜类色素[1] 。它能诱导人肥大细胞系HMC-1细胞凋亡[2]，但诱导凋亡的机制尚不清楚[3]。 Fas抗原(CD95)是一种膜受体，属TNFR/NGFR家族成员，表达于多种类型的细胞表面，其配体(Fas ligand ,Fas-L)主要表达于活化的淋巴细胞。Fas与Fas L结合能迅速地启动细胞凋亡。 本文研究雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡过程中Fas 及Fas-L表达的变化及与凋亡的关系，以探讨雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡的机制。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 HMC-1细胞培养于5%CO2 , 37℃孵箱中。培养基IMDM(GIBCOBRL )含10% 热灭活小牛血清，0.1 U/L青霉素，0.1 U/L 链霉素。培养细胞密度为0.5×106～1.0×106 ml-1,取对数生长期细胞待用。
, 百拇医药
1.2 细胞凋亡的检测
1.2.1 形态观察 HMC-1细胞呈圆或椭圆形。凋亡时细胞膜内陷，核浓缩，形成凋亡小体。
1.2.2 流式细胞仪(FCM) DNA含量分析 1×106个细胞加50 μl含0.1% Triton-X100 的碘化丙啶(PI) (5 μg/ml) 染色，避光放置5 min,加0.5 ml PBS, 上流式细胞仪检测,Multicycles软件分析结果。
1.2.3 DNA琼脂糖电泳 1×106细胞加100 μl TBE缓冲液， 0.25% NP-40, 0.1 mg/ml Rnase，50℃水浴30 min；再加 1 mg/ml蛋白酶K,50℃水浴30 min，即获得需要的DNA溶液。取30 μl DNA溶液于1.8%琼脂糖凝胶电泳,细胞凋亡时可出现梯形条带。
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1.3 Fas和Fas-L的测定 0.5×106 个HMC-1细胞，加鼠抗人anti-Fas或anti-Fas-L单克隆抗体20 μl，加同型非特异性IgG为阴性对照 (Immuno Tech公司),4℃共育30 min；加 FITC-anti-鼠IgM 20 μl, 4℃共育30 min。FCM检测(COULTE，EPICS XL)，计数10 000个细胞。
1.4 凋亡细胞群中Fas的测定 中晚期凋亡细胞膜透性可以增加 ，不加Triton-X100的PI可渗入细胞着色。对细胞进行Fas标记后，加0.1%PI染色，在流式细胞仪上进行双标记分析。
1.5 数据处理 t检验。
2 结果
2.1 雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡 在雷公藤红素作用下 HMC-1细胞可出现细胞皱缩，核浓缩，形成凋亡小体的形态改变(图1)。作用24 h,DNA琼脂糖电泳可见梯形条带(图2)。
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2.2 HMC-1细胞Fas和Fas-L的表达 HMC-1细胞大小不等，在流式细胞仪上根据前向散射程度可将其分为大、中、小三群，三群细胞分别占37.5%,12.1%,23.7%，三群细胞Fas的阳性率分别为20.0%,37.1%和6.5%；整群细胞表达Fas的阳性率为22.7%，不表达Fas-L 。
图1 HMC-1细胞在雷公藤红素作用下呈凋亡形态改变(HE染色，×400)
Fig.1 Tripterine induced morphological changes characteristic of apoptosis(HE stain,×400)
Note:Condensation of chromatin and apoptotic body formation in HMC-1 cells
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图2 雷公藤红素作用24 h HMC-1细胞DNA琼脂糖电泳显示梯形条带
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA from HMC-1 cells treated with tripterine for 24 hours
Note:Marker:657,458,328,289,176 bp
2.3 雷公藤红素对HMC-1细胞表达Fas和Fas-L的影响 在雷公藤红素作用下Fas 阳性率呈先升后降的变化，升高的程度和下降的速率与药物的剂量相关(图3)。 Fas-L 在1.000 μmol/L作用下，0,4,6 h分别为0,3.3%,1.8%。 0.125, 0.250, 0.500, 1.000 μmol/L 雷公藤红素作用4 h,Fas-L阳性率分别为3.4%,4.0%,5.7%和1.8% 。
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2.4 PI染色阳性细胞群中Fas阳性率增高 1.000 μmol/L雷公藤红素作用4 h，PI 染色阳性细胞为21.4%±5.0 % (n＝5)， PI阳性细胞群中Fas阳性率为29.1%±3.9 % ，PI阴性细胞群中Fas阳性率为5.7%±1.2 %，两者相比有显著差异，P<0.01。
2.5 Fas阳性率与凋亡率变化的关系 HMC-1细胞与1.000 μmol/L雷公藤红素共育，在0，2，4，8 h 同时测定Fas阳性率和细胞凋亡率，分析两者的相关性。发现Fas阳性率自2 h开始呈下降趋势，细胞凋亡率自2 h开始呈上升趋势。至6 h,Fas阳性率仅为2.3%，趋于0，细胞凋亡率继续上升，见图4。
图3 在雷公藤红素作用下流式细胞仪测定HMC-1细胞Fas阳性率的变化
Fig.3 Fas positive rate changes measured on flow cytometry in tripterine treated HMC-1 cells
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图4 HMC-1细胞在1 μmol/L雷公藤红素作用下Fas阳性率和凋亡率的变化
Fig.4 Fas and apoptotic positive rate changes in 1 μmol/L tripterine treated HMC-1 cells
3 讨论
雷公藤红素能以时间和剂量依赖方式诱导肥大细胞系HMC-1细胞凋亡，提示雷公藤红素抗炎症[4] 、治疗类风湿性关节炎[5]等与肥大细胞相关疾病的作用与此有关。
既往的研究已经表明，Fas广泛地表达于胸腺细胞，活化T、B淋巴细胞，NK细胞，单核细胞等免疫细胞表面，是介导细胞凋亡，维持细胞数量稳定的重要分子[6]。 本实验的研究表明HMC-1细胞也能表达Fas，提示Fas 在介导肥大细胞凋亡、维持肥大细胞数量稳定方面发挥重要的作用。HMC-1细胞大小不等，可能与其分化阶段不同有关。它们表达Fas的水平也不相同，提示不同分化阶段的细胞对凋亡的敏感性不同。
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多种因素可影响Fas的表达，其表达水平的变化会影响到细胞对凋亡的敏感性。如外周血T细胞在超抗原作用下高水平地表达Fas和Fas-L ，由此促进T细胞的凋亡[7]。本实验发现雷公藤红素使HMC-1细胞表达Fas增高，同时诱使Fas-L呈低水平表达。雷公藤红素的这一作用可能与其诱导HMC-1细胞凋亡有关。 因为Fas的高表达提高了HMC-1细胞凋亡的敏感性，尤其在体内接触到Fas-L阳性淋巴细胞即可以引起凋亡；在体外接触到Fas-L阳性的HMC-1细胞也可引起凋亡。凋亡细胞群中Fas阳性率增高。凋亡率的增加伴随Fas阳性率的下降，二者在启动时间上一致。这些均支持雷公藤红素促进Fas表达与其诱导HMC-1细胞凋亡有关。
但是，雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡并非均由Fas介导。1.000 μmol/L雷公藤红素作用8 h，Fas阳性细胞几乎消失，而凋亡率继续升高，48 h可达90%，远远高于Fas阳性细胞比例，因此雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡还存在其它途径， Fas只是其途径之一。
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Fas可能是雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡的途径之一 国家自然科学基金资助项目(编号 39400123)
作者简介：鲍一笑，男，34岁，临床免疫学博士，主要研究哮喘的免疫机理
4 参考文献
1 岗艳云，张正行. 雷公藤及其单体的药理作用研究进展.中国药科大学学报, 1995;26 (4): 252
2 Butterfield J H, Weiler D, Dewald G et al.Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast leukemia.Leuk Res ,1988;12(4): 34
3 鲍一笑，孔宪涛，李 莉 et al.雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡及与细胞周期的关系. 中国中西医结合杂志, 1998;18(基础理论研究特集):198
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4 徐维敏，张罗修，程彰华 et al.雷公藤红素对IL-1和IL-2活性及PGE2释放的抑制作用.药学学报, 1991; 10(9): 641
5 严云屏，施守义，施宜平 et al.雷公藤红素外用治疗类风湿性关节炎局部肿瘤.新药与临床，1989; 8(6): 365
6 Krammer P H, Daniel J, Walaczak H et al.The role of APO-1-mediated apoptosis in immune system. Immunol Rev，1994; 142:175
7 Renno T, Hahne M, Tschopp J et al. Peripheral T cells undergoing superantigen-induced apoptosis in vivo express B220 and upregulate Fas and Fas ligand. J Exp Med，1996;183(2):431
〔收稿1997-12-05 修回1998-03-23〕, 百拇医药