IL-3体外造血支持效应的初步研究
作者：王红卫 缪竞诚 张澜生 杨吉成 盛伟华 李丽娥
单位：王红卫(苏州医学院细胞免疫中心，苏州215007)；缪竞诚(苏州医学院细胞免疫中心，苏州215007)；张澜生(苏州医学院细胞免疫中心，苏州215007)；杨吉成(苏州医学院基因工程研究室，苏州 215007)；盛伟华(苏州医学院细胞免疫中心，苏州215007)；李丽娥(苏州医学院细胞免疫中心，苏州215007)
关键词：骨髓基质细胞；脐血造血细胞；长期培养
中国免疫学杂志000602 摘 要 目的：探讨IL-3体外促进脐血造血细胞增殖分化的效应。方法：连续2次Ficoll-Hypaque分离，初步纯化脐血造血细胞，将其单个核细胞接种于经γ射线预处理的成人骨髓基质细胞层上，加入适量IL-3，并设不加IL-3的对照组，持续培养6 w，定期检测非粘附细胞和集落形成细胞(CFC)。结果：IL-3组3～6 w非粘附细胞数和CFC产率显著高于对照组，分别为对照组的2.7～4.5倍和1.6～2.3倍。结论：IL-3在基质细胞支持的培养体系中可以促进脐血原始造血细胞的增殖分化。
, 百拇医药
中国图书分类号 R331.2
The preliminary study on the supportive effect of IL-3 in vitro on hematopoiesis
WANG Hong-Wei,MIAO Jing-Cheng,ZHANG Lan-Sheng et al
(Cellular Immunity Centre,Suzhou Medical College,Suzhou 215007)
Abstract Objective:To elucidate the enhanced effect of IL-3 on the proliferation and differentiation of cord blood hematopoietic cells in vitro.Methods:To preliminarily purify cord blood hematopoietic cells by continuiously double Ficoll-Hypaque method.The adult marrow stromal layer was establishied by static liquid culture,then irradiated with γ-ray.The mononuclear cells(MNCs) were cultured in stromal-contact system with or without IL-3 for six weeks.The nonadherent cells and CFCs were counted and measured at different time point.Results:The experimental group with IL-3 was remarkable greater increase than control group in terms of the number of nonadherent cells(2.7～4.5 fold increase)and the production of CFCs(1.6～2.3 fold increase).Conclusion:IL-3 enhanced the proliferation and differentiation of positive hematopoietic cells from cord blood in the stroma-supported culture.
, 百拇医药
Key word Bone marrow stromal cell Cord blood hematopoietic cell Long-term culture
70年代，Dexter 等在体外建立了人类骨髓长期培养方法，使体外探讨和研究造血微环境及造血调控机制成为可能，体外建立的骨髓基质滋养层包括多种细胞成分，如成纤维细胞，内皮细胞，脂肪细胞，巨噬细胞等，这些细胞与造血干、祖细胞密切接触，并分泌多种局部造血生长因子(HGF)，支持干、祖细胞生长，分化和自我更新[1]。IL-3是早期多能生长因子，单独或与其它因子配伍，可以促进多能干细胞自我更新及定向祖细胞的增殖[2]。骨髓基质细胞不能合成IL-3，已为一些学者证实[3]。因此，我们在成人骨髓基质细胞支持的培养体系中加入IL-3，探讨其对脐血造血细胞增殖分化的作用。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 细胞因子和其它试剂 IL-3由中科院生化所刘新垣院士馈赠，GM-CSF由第二军医大学曹雪涛教授馈赠，甲基纤维素(原装进口)由苏州医学院陈子兴教授提供，G-CSF、EPO、FCS、HS为Gibco公司产品(以上细胞因子均为基因工程重组产品)。
1.2 标本 5份健康足月顺产新生儿脐血(肝素抗凝)，采集后8 h内，按Harris等报道[4]，使用Fico -Hypaque(1.077 g/ml)连续2次密度梯度离心，收获脐血MNCs，调整细胞浓度。成人骨髓取自苏医附一院胸外科手术切除的肋骨(无血液病和其它累及骨髓的疾病)，将冲洗出的骨髓细胞用Ficoll-Hypaque(1.077 g/ml)分离后，制成适当浓度的细胞悬液。
1.3 原代贴壁基质细胞层的建立 成人骨髓MNCs按1×106 ml-1密度悬浮于5 ml基质RPMI 1640培养液中(含12.5%FCS，12.5%HS，10-6mol/L氢化可的松100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素)，于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养，每周半量换液1次，去除非粘附细胞，培养3～4 w后，可见混合贴壁细胞层形成，使用前2～3 d，将贴壁细胞送至苏州医学院辐照中心辐照(γ射线 15 GY)，经辐照的基质细胞采用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化，洗涤离心后，按1×104/cm2的密度接种培养。
, 百拇医药
1.4 长期培养和扩增实验 1×106脐血MNCs悬浮于5 ml 1640培养基中(含20%FCS，1×10-6mol/L氢化可的松，100 U/ml,青霉素，100 μg/ml，链霉素)，接种至含基质细胞的培养瓶中(均设复瓶)，在实验组中加入20 ng/ml的IL-3，每周半量换1次(实验组用含IL-3的培养基，对照组则不加IL-3)于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养6 w，每周计数非粘附细胞，每2周检测CFC产率。
1.5 集落培养方法 将新鲜分离的脐血MNCs，培养2、4、6 w的各实验组和对照组的1×105非粘附细胞接种到含1.3%甲基纤维素的1640培养体系中(含20%FCS，氢考1×106 mol/L，IL-3 25 ng/ml,GM-CSF 40 ng/ml,EPO 2 U/ml)于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养2～3 w，倒置显微镜下观察CFC-GM，BFU-E，CFC-GEMM，HPP-CFC，计数CFC总数(CFC50细胞)。
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1.6 统计学处理 本文实验数据用
±s表示，两组间比较用配对t检验，P<0.05差别具有显著性。
2 结果
IL-3处理组和对照组非粘附细胞数及CFC产率的动态变化见表1、表2。
表1 脐血长期培养过程中非粘附细胞总数(×106)的动态变化
Tab.1 Dynamic variation of total cord blood
nonadherent cells during long-term culture(×106) Group
1 week
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2 week
3 week
4 week
5 week
6 week
Control group
2.45±0.191)
0.99±0.211)
0.25±0.073)
0.17±0.043)
0.21±0.053)
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0.19±0.032)
IL-3 treatment
2.47±0.24
1.02±0.18
0.85±0.09
0.78±0.07
0.67±0.04
0.52±0.05
Note:Comparision between IL-3 treatment and control group 1)P>0.05;2)P<0.05，3)P<0.01表2 IL-3组和对照组2、4、6 wCFC产率(/105MNCs)的比较(n=5)
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Tab.2 The comparation of 2,4,6 week CFC产率(/105MNCs)
between IL-3 group and control group (n=5) Week
Control group
IL-3 treatment group
P
2
52.4±4.2
54.7±9.3
P>0.05
4
, 百拇医药
15.3±3.1
35.4±5.3
P<0.01
6
11.5±4.2
18.3±3.4
P<0.05
由上表可知，IL-3组1 w、2 w CFC及2 w CFC产率与对照组相比无显著差异，培养至第3周IL-3组造血细胞增殖明显，围绕基质细胞形成许多铺路石样造血岛，IL-3组3、4 w非粘附细胞数分别为对照组的3.4倍和4.5倍，4 w CFC产率为对照组的2.3倍，培养缓5 w后，IL-3诱导的造血活动开始趋缓，但5～6 w非粘附细胞数均高于对照组，分别为对照组的3.2倍和2.7倍，6 w CFC产率为对照组的1.6倍。
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3 讨论
在持续6 w的培养中，均可检测到非粘附细胞及祖细胞(CFC)，提示基质细胞在体外可以长期维持造血活动。然而在整个培养阶段非粘附细胞数和祖细胞均呈下降趋势，可是由于培养技术和培养体系自身的缺陷。IL-3是可以促进早期原始造血细胞增殖分化的，IL-3组4 w、6 w CFC产率均显著高于对照组，同时伴随非粘附细胞数的显著增加。这种效应可能是由于IL-3直接或与基质细胞分泌的其它生长因子协同作用的结果[2]，也可能是由于外源IL-3促进基质细胞合成早期作用因子如SCF、IL-6的原因[5，6]。IL-3作为多能造血生长因子已广泛应用于造血调控领域的基础和应用性研究。动物实验证实，经基因工程改造的可分泌IL-3的骨髓基质细胞，同造血干、祖细胞混合移植给SCID小鼠，可以更长时间维持供者来源的造血干、祖细胞的造血活动，并改善造血重建的质量[6，7]。可能预示，转染IL-3的基质细胞在自体骨髓移植中的应用有广阔前景，结果证实，基质支持联合IL-3的使用在一定程度上可以促进脐血干、祖细胞的增殖分化，提示IL-3在亲缘和非亲缘供者的脐血干细胞移植有着潜在的应用前景。
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作者简介：王红卫，男，29岁，现在复旦大学读博士，主要从事造血调控基因治疗方面的研究；
指导教师，杨吉成，男，教授
参考文献
1，Eerson S G.Exvivo expansion of hematopoietic progenitors and stem cells:the next generation of cellular therapeutics.Blood,1995;87(8):3082
2，Coutinho L H,Will A,Radford H et al.Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor(CSF),human granulocyte macrophage-CSF,and gibbon interleukin-3 on hemaxopoiesis in human long-term bone marrow culture.Blood,1990;75(11):2118
, 百拇医药
3，Guba S C,Sartor C I,Gottschalk I R et al.Bone marrow stromal fibroblasts secrete interleukin-6 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the absence of inflammtory stimulation:demonstration by serum-free bioassay,enzyme-linked immunosorbent assay,and reverse transcriptase polymerase chain reaction.Blood,1992;80(5):1190
4，Harris D T,Schumacher M J,Rychlik S et al.Collection separation and cryopreservation of umbilical cord blood for use in transplantation.Bone Marrow Transplant,1994;13:135
, 百拇医药
5，Rougier F,Comu E,Praloran V et al.IL-6 and IL-8 production by human bone marrow stromal cells.Cytokine,1998;10(2):93
6，Nolta E A,Hanley B M,Kohn D B.Sustained human hematopoiesis in immunodeficient mice by cotransplantation bone marrow stromal expressing human interlukin-3:analysis of gene transduction of long-lived progenitors.Blood,1994;83(10):3041
7，Dao N A,Pepper K A,Nolta J A.Long-term cytokine production from engineered primary human stromal cells influences human hematopoiesis in an in vivo xenograft model.Stem Cells,1997;15:443
1999-01-30, 百拇医药
单位：王红卫(苏州医学院细胞免疫中心，苏州215007)；缪竞诚(苏州医学院细胞免疫中心，苏州215007)；张澜生(苏州医学院细胞免疫中心，苏州215007)；杨吉成(苏州医学院基因工程研究室，苏州 215007)；盛伟华(苏州医学院细胞免疫中心，苏州215007)；李丽娥(苏州医学院细胞免疫中心，苏州215007)
关键词：骨髓基质细胞；脐血造血细胞；长期培养
中国免疫学杂志000602 摘 要 目的：探讨IL-3体外促进脐血造血细胞增殖分化的效应。方法：连续2次Ficoll-Hypaque分离，初步纯化脐血造血细胞，将其单个核细胞接种于经γ射线预处理的成人骨髓基质细胞层上，加入适量IL-3，并设不加IL-3的对照组，持续培养6 w，定期检测非粘附细胞和集落形成细胞(CFC)。结果：IL-3组3～6 w非粘附细胞数和CFC产率显著高于对照组，分别为对照组的2.7～4.5倍和1.6～2.3倍。结论：IL-3在基质细胞支持的培养体系中可以促进脐血原始造血细胞的增殖分化。
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中国图书分类号 R331.2
The preliminary study on the supportive effect of IL-3 in vitro on hematopoiesis
WANG Hong-Wei,MIAO Jing-Cheng,ZHANG Lan-Sheng et al
(Cellular Immunity Centre,Suzhou Medical College,Suzhou 215007)
Abstract Objective:To elucidate the enhanced effect of IL-3 on the proliferation and differentiation of cord blood hematopoietic cells in vitro.Methods:To preliminarily purify cord blood hematopoietic cells by continuiously double Ficoll-Hypaque method.The adult marrow stromal layer was establishied by static liquid culture,then irradiated with γ-ray.The mononuclear cells(MNCs) were cultured in stromal-contact system with or without IL-3 for six weeks.The nonadherent cells and CFCs were counted and measured at different time point.Results:The experimental group with IL-3 was remarkable greater increase than control group in terms of the number of nonadherent cells(2.7～4.5 fold increase)and the production of CFCs(1.6～2.3 fold increase).Conclusion:IL-3 enhanced the proliferation and differentiation of positive hematopoietic cells from cord blood in the stroma-supported culture.
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Key word Bone marrow stromal cell Cord blood hematopoietic cell Long-term culture
70年代，Dexter 等在体外建立了人类骨髓长期培养方法，使体外探讨和研究造血微环境及造血调控机制成为可能，体外建立的骨髓基质滋养层包括多种细胞成分，如成纤维细胞，内皮细胞，脂肪细胞，巨噬细胞等，这些细胞与造血干、祖细胞密切接触，并分泌多种局部造血生长因子(HGF)，支持干、祖细胞生长，分化和自我更新[1]。IL-3是早期多能生长因子，单独或与其它因子配伍，可以促进多能干细胞自我更新及定向祖细胞的增殖[2]。骨髓基质细胞不能合成IL-3，已为一些学者证实[3]。因此，我们在成人骨髓基质细胞支持的培养体系中加入IL-3，探讨其对脐血造血细胞增殖分化的作用。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 细胞因子和其它试剂 IL-3由中科院生化所刘新垣院士馈赠，GM-CSF由第二军医大学曹雪涛教授馈赠，甲基纤维素(原装进口)由苏州医学院陈子兴教授提供，G-CSF、EPO、FCS、HS为Gibco公司产品(以上细胞因子均为基因工程重组产品)。
1.2 标本 5份健康足月顺产新生儿脐血(肝素抗凝)，采集后8 h内，按Harris等报道[4]，使用Fico -Hypaque(1.077 g/ml)连续2次密度梯度离心，收获脐血MNCs，调整细胞浓度。成人骨髓取自苏医附一院胸外科手术切除的肋骨(无血液病和其它累及骨髓的疾病)，将冲洗出的骨髓细胞用Ficoll-Hypaque(1.077 g/ml)分离后，制成适当浓度的细胞悬液。
1.3 原代贴壁基质细胞层的建立 成人骨髓MNCs按1×106 ml-1密度悬浮于5 ml基质RPMI 1640培养液中(含12.5%FCS，12.5%HS，10-6mol/L氢化可的松100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素)，于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养，每周半量换液1次，去除非粘附细胞，培养3～4 w后，可见混合贴壁细胞层形成，使用前2～3 d，将贴壁细胞送至苏州医学院辐照中心辐照(γ射线 15 GY)，经辐照的基质细胞采用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化，洗涤离心后，按1×104/cm2的密度接种培养。
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1.4 长期培养和扩增实验 1×106脐血MNCs悬浮于5 ml 1640培养基中(含20%FCS，1×10-6mol/L氢化可的松，100 U/ml,青霉素，100 μg/ml，链霉素)，接种至含基质细胞的培养瓶中(均设复瓶)，在实验组中加入20 ng/ml的IL-3，每周半量换1次(实验组用含IL-3的培养基，对照组则不加IL-3)于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养6 w，每周计数非粘附细胞，每2周检测CFC产率。
1.5 集落培养方法 将新鲜分离的脐血MNCs，培养2、4、6 w的各实验组和对照组的1×105非粘附细胞接种到含1.3%甲基纤维素的1640培养体系中(含20%FCS，氢考1×106 mol/L，IL-3 25 ng/ml,GM-CSF 40 ng/ml,EPO 2 U/ml)于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养2～3 w，倒置显微镜下观察CFC-GM，BFU-E，CFC-GEMM，HPP-CFC，计数CFC总数(CFC50细胞)。
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1.6 统计学处理 本文实验数据用
±s表示，两组间比较用配对t检验，P<0.05差别具有显著性。2 结果
IL-3处理组和对照组非粘附细胞数及CFC产率的动态变化见表1、表2。
表1 脐血长期培养过程中非粘附细胞总数(×106)的动态变化
Tab.1 Dynamic variation of total cord blood
nonadherent cells during long-term culture(×106) Group
1 week
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2 week
3 week
4 week
5 week
6 week
Control group
2.45±0.191)
0.99±0.211)
0.25±0.073)
0.17±0.043)
0.21±0.053)
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0.19±0.032)
IL-3 treatment
2.47±0.24
1.02±0.18
0.85±0.09
0.78±0.07
0.67±0.04
0.52±0.05
Note:Comparision between IL-3 treatment and control group 1)P>0.05;2)P<0.05，3)P<0.01表2 IL-3组和对照组2、4、6 wCFC产率(/105MNCs)的比较(n=5)
, 百拇医药
Tab.2 The comparation of 2,4,6 week CFC产率(/105MNCs)
between IL-3 group and control group (n=5) Week
Control group
IL-3 treatment group
P
2
52.4±4.2
54.7±9.3
P>0.05
4
, 百拇医药
15.3±3.1
35.4±5.3
P<0.01
6
11.5±4.2
18.3±3.4
P<0.05
由上表可知，IL-3组1 w、2 w CFC及2 w CFC产率与对照组相比无显著差异，培养至第3周IL-3组造血细胞增殖明显，围绕基质细胞形成许多铺路石样造血岛，IL-3组3、4 w非粘附细胞数分别为对照组的3.4倍和4.5倍，4 w CFC产率为对照组的2.3倍，培养缓5 w后，IL-3诱导的造血活动开始趋缓，但5～6 w非粘附细胞数均高于对照组，分别为对照组的3.2倍和2.7倍，6 w CFC产率为对照组的1.6倍。
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3 讨论
在持续6 w的培养中，均可检测到非粘附细胞及祖细胞(CFC)，提示基质细胞在体外可以长期维持造血活动。然而在整个培养阶段非粘附细胞数和祖细胞均呈下降趋势，可是由于培养技术和培养体系自身的缺陷。IL-3是可以促进早期原始造血细胞增殖分化的，IL-3组4 w、6 w CFC产率均显著高于对照组，同时伴随非粘附细胞数的显著增加。这种效应可能是由于IL-3直接或与基质细胞分泌的其它生长因子协同作用的结果[2]，也可能是由于外源IL-3促进基质细胞合成早期作用因子如SCF、IL-6的原因[5，6]。IL-3作为多能造血生长因子已广泛应用于造血调控领域的基础和应用性研究。动物实验证实，经基因工程改造的可分泌IL-3的骨髓基质细胞，同造血干、祖细胞混合移植给SCID小鼠，可以更长时间维持供者来源的造血干、祖细胞的造血活动，并改善造血重建的质量[6，7]。可能预示，转染IL-3的基质细胞在自体骨髓移植中的应用有广阔前景，结果证实，基质支持联合IL-3的使用在一定程度上可以促进脐血干、祖细胞的增殖分化，提示IL-3在亲缘和非亲缘供者的脐血干细胞移植有着潜在的应用前景。
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作者简介：王红卫，男，29岁，现在复旦大学读博士，主要从事造血调控基因治疗方面的研究；
指导教师，杨吉成，男，教授
参考文献
1，Eerson S G.Exvivo expansion of hematopoietic progenitors and stem cells:the next generation of cellular therapeutics.Blood,1995;87(8):3082
2，Coutinho L H,Will A,Radford H et al.Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor(CSF),human granulocyte macrophage-CSF,and gibbon interleukin-3 on hemaxopoiesis in human long-term bone marrow culture.Blood,1990;75(11):2118
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3，Guba S C,Sartor C I,Gottschalk I R et al.Bone marrow stromal fibroblasts secrete interleukin-6 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the absence of inflammtory stimulation:demonstration by serum-free bioassay,enzyme-linked immunosorbent assay,and reverse transcriptase polymerase chain reaction.Blood,1992;80(5):1190
4，Harris D T,Schumacher M J,Rychlik S et al.Collection separation and cryopreservation of umbilical cord blood for use in transplantation.Bone Marrow Transplant,1994;13:135
, 百拇医药
5，Rougier F,Comu E,Praloran V et al.IL-6 and IL-8 production by human bone marrow stromal cells.Cytokine,1998;10(2):93
6，Nolta E A,Hanley B M,Kohn D B.Sustained human hematopoiesis in immunodeficient mice by cotransplantation bone marrow stromal expressing human interlukin-3:analysis of gene transduction of long-lived progenitors.Blood,1994;83(10):3041
7，Dao N A,Pepper K A,Nolta J A.Long-term cytokine production from engineered primary human stromal cells influences human hematopoiesis in an in vivo xenograft model.Stem Cells,1997;15:443
1999-01-30, 百拇医药