LPS及IL-3对人骨髓基质细胞分泌IL-6的调节效应
作者：缪竞诚 杨吉成 盛伟华 王红卫 李丽娥
单位：苏州医学院生物技术研究所，苏州215007
关键词：
中国免疫学杂志990914 中国图书分类号 R331.2-33 R392.12
骨髓造血微环境主要由基质细胞和细胞外基质(ECM)构成，基质细胞包括多种细胞成分，如成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞等，可分泌多种造血调控因子，调节造血干、祖细胞的增殖分化和自我更新[1]。基质细胞可以合成IL-6参与造血调控，已为许多学者证实[2]。近来报道显示，LPS和IL-3可以促进基质细胞合成IL-6、IL-8、SCF等，进而促进造血干、祖细胞的增殖分化[2，3]。我们拟建立人骨髓基质细胞层，探讨各种条件下IL-6的合成情况 。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 试剂：LPS北京邦定公司。IL-3深圳晶美公司。基质培养基：含10%FCS、106 mol/L的氢化可的松、100 U/ml青霉素和100 μg/ml 链霉素的RPMI 1640培养基。成人骨髓取自苏医附一院手术切除的肋骨(患者无血液系统疾病和其他累及骨髓的疾病)。经梯度离心分离取单个核细胞，制成适当浓度的细胞悬液。
1.2 方法
1.2.1 骨髓基质细胞层的建立 将上述得到的单个核细胞以1×106接种于5 ml基质培养基中，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，每周半量换液1次，去除非粘附细胞。培养2～3 w后可形成混合贴壁细胞层，用0.25%胰酶加0.02%EDTA消化传代。收集部分细胞用瑞氏染色后观察其细胞形态。
, 百拇医药 1.2.2 无刺激对照组、LPS刺激组、IL-3刺激组基质细胞培养上清的收集 参照Rougier等报道的方法[3]，将上述基质细胞消化后，以相同的密度1×106 ml-1分瓶，待细胞贴壁并铺满80%时，分别加入LPS 10、100、1 000 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，并设不加因子的无刺激组，作用24 h后收集上清。
1.2.3 IL-6活性的检测 按IL-6依赖株(B9)增殖MTT比色分析法[4]。B9细胞和IL-6标准品均由苏州医学院基因室提供。
2 结 果
2.1 骨髓基质细胞的形态学特征 传4～5代的基质细胞层主要由成纤维细胞构成(60%～70%)，细胞形体较大，呈长梭形，胞浆淡染，核大；内皮细胞(20%～30%)呈圆形或椭圆形，核大，圆形，染色质浓集，胞浆嗜碱性染色；巨噬细胞偶见，近似圆形，大小不规则，核圆，胞质不均匀，有颗粒感。
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2.2 基础和刺激条件下IL-6水平 骨髓基质细胞基础条件下可以合成低水平的IL-6(5.229±1.472 U/ml)。LPS可以促进IL-6的合成，在工作浓度分别为10、100、1 000 ng/ml的LPS刺激下，IL-6水平分别为12.188±2.67、38.153±4.521、28.614±3.840 U/ml，这一水平分别为基础水平的2.3、7.2、5.4倍；IL-3对骨髓基质细胞IL-6合成同样具有促诱生作用，使其达到23.845 U/ml，为基础水平的4.5倍。所有刺激组数据与无刺激组相比均有显著性差异(P<0.01)。
3 讨 论
IL-6是调控造血、免疫和急性炎症反应的多功能细胞因子，正常情况下，骨髓基质细胞可以合成低水平IL-6[2]，我们的实验亦证实了这一点，尽管基质细胞分泌的造血生长因子(包括IL-6)的水平较低，但对于基础造血十分重要，可能是由于这些因子通常结合在基质细胞膜和ECM表面，与造血干祖细胞局部共存而发挥高效的调节作用[1]。LPS可促进基质细胞合成分泌IL-6，且呈剂量依赖性。IL-3是早期多能造血生长因子，它可直接作用于原始干祖细胞，促进其增殖分化和自我更新，亦可通过促进基质细胞合成IL-6等因子而调节造血活动[3]。我们的实验亦证实了IL-3可促进基质细胞IL-6的合成，与不加IL-3相比具有显著性差异。
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作者简介：缪竞诚，男，47岁，主要从事细胞因子，肿瘤免疫及放疗的基础理论和应用研究
4 参考文献
1 Lemischka I R. Microenvironmental regulation of hematopoietic stem cells. Stem Cells, 1997; 15: 63
2 Guba S C, Sartor C I, Gottschalk L R et al. Bone marrow stromal fibroblasts secrete interleukin-6 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the absence of inflammatory stimulation:Demonstration by serum-free bioassay, enzyme-linked immunosorbent assay,and reverse transcriptase polymerase chain reaction. Blood,1992; 80: 1190
3 Rougier F, Cornu E, Praloran V et al. IL-6 and IL-8 production by human bone marrow stromal cells. Cytokine，1998; 10: 93
4 杨吉成，盛伟华，张 云et al.人脐带血和外周血血清5种细胞因子水平测定.中国实验免疫学，1996; 6(5): 28
〔收稿1999-01-16 修回1999-04-16〕, 百拇医药
单位：苏州医学院生物技术研究所，苏州215007
关键词：
中国免疫学杂志990914 中国图书分类号 R331.2-33 R392.12
骨髓造血微环境主要由基质细胞和细胞外基质(ECM)构成，基质细胞包括多种细胞成分，如成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞等，可分泌多种造血调控因子，调节造血干、祖细胞的增殖分化和自我更新[1]。基质细胞可以合成IL-6参与造血调控，已为许多学者证实[2]。近来报道显示，LPS和IL-3可以促进基质细胞合成IL-6、IL-8、SCF等，进而促进造血干、祖细胞的增殖分化[2，3]。我们拟建立人骨髓基质细胞层，探讨各种条件下IL-6的合成情况 。
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1 材料与方法
1.1 材料 试剂：LPS北京邦定公司。IL-3深圳晶美公司。基质培养基：含10%FCS、106 mol/L的氢化可的松、100 U/ml青霉素和100 μg/ml 链霉素的RPMI 1640培养基。成人骨髓取自苏医附一院手术切除的肋骨(患者无血液系统疾病和其他累及骨髓的疾病)。经梯度离心分离取单个核细胞，制成适当浓度的细胞悬液。
1.2 方法
1.2.1 骨髓基质细胞层的建立 将上述得到的单个核细胞以1×106接种于5 ml基质培养基中，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，每周半量换液1次，去除非粘附细胞。培养2～3 w后可形成混合贴壁细胞层，用0.25%胰酶加0.02%EDTA消化传代。收集部分细胞用瑞氏染色后观察其细胞形态。
, 百拇医药 1.2.2 无刺激对照组、LPS刺激组、IL-3刺激组基质细胞培养上清的收集 参照Rougier等报道的方法[3]，将上述基质细胞消化后，以相同的密度1×106 ml-1分瓶，待细胞贴壁并铺满80%时，分别加入LPS 10、100、1 000 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，并设不加因子的无刺激组，作用24 h后收集上清。
1.2.3 IL-6活性的检测 按IL-6依赖株(B9)增殖MTT比色分析法[4]。B9细胞和IL-6标准品均由苏州医学院基因室提供。
2 结 果
2.1 骨髓基质细胞的形态学特征 传4～5代的基质细胞层主要由成纤维细胞构成(60%～70%)，细胞形体较大，呈长梭形，胞浆淡染，核大；内皮细胞(20%～30%)呈圆形或椭圆形，核大，圆形，染色质浓集，胞浆嗜碱性染色；巨噬细胞偶见，近似圆形，大小不规则，核圆，胞质不均匀，有颗粒感。
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2.2 基础和刺激条件下IL-6水平 骨髓基质细胞基础条件下可以合成低水平的IL-6(5.229±1.472 U/ml)。LPS可以促进IL-6的合成，在工作浓度分别为10、100、1 000 ng/ml的LPS刺激下，IL-6水平分别为12.188±2.67、38.153±4.521、28.614±3.840 U/ml，这一水平分别为基础水平的2.3、7.2、5.4倍；IL-3对骨髓基质细胞IL-6合成同样具有促诱生作用，使其达到23.845 U/ml，为基础水平的4.5倍。所有刺激组数据与无刺激组相比均有显著性差异(P<0.01)。
3 讨 论
IL-6是调控造血、免疫和急性炎症反应的多功能细胞因子，正常情况下，骨髓基质细胞可以合成低水平IL-6[2]，我们的实验亦证实了这一点，尽管基质细胞分泌的造血生长因子(包括IL-6)的水平较低，但对于基础造血十分重要，可能是由于这些因子通常结合在基质细胞膜和ECM表面，与造血干祖细胞局部共存而发挥高效的调节作用[1]。LPS可促进基质细胞合成分泌IL-6，且呈剂量依赖性。IL-3是早期多能造血生长因子，它可直接作用于原始干祖细胞，促进其增殖分化和自我更新，亦可通过促进基质细胞合成IL-6等因子而调节造血活动[3]。我们的实验亦证实了IL-3可促进基质细胞IL-6的合成，与不加IL-3相比具有显著性差异。
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作者简介：缪竞诚，男，47岁，主要从事细胞因子，肿瘤免疫及放疗的基础理论和应用研究
4 参考文献
1 Lemischka I R. Microenvironmental regulation of hematopoietic stem cells. Stem Cells, 1997; 15: 63
2 Guba S C, Sartor C I, Gottschalk L R et al. Bone marrow stromal fibroblasts secrete interleukin-6 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the absence of inflammatory stimulation:Demonstration by serum-free bioassay, enzyme-linked immunosorbent assay,and reverse transcriptase polymerase chain reaction. Blood,1992; 80: 1190
3 Rougier F, Cornu E, Praloran V et al. IL-6 and IL-8 production by human bone marrow stromal cells. Cytokine，1998; 10: 93
4 杨吉成，盛伟华，张 云et al.人脐带血和外周血血清5种细胞因子水平测定.中国实验免疫学，1996; 6(5): 28
〔收稿1999-01-16 修回1999-04-16〕, 百拇医药