原核表达的可溶性血管内皮生长因子受体对血管内皮生长因子活性的抑制
作者：宋述梅 寿成超
单位：北京市肿瘤防治研究所 北京医科大学临床肿瘤学院生化与分子生物学研究室 100034)
关键词：
中华医学杂志000328 血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其VEGF受体(sKDR)在刺激内皮细胞增殖中有特殊作用[1]，阻断VEGF与受体KDR的结合已成为抗血管形成的重要靶点。VEGF抗体已被证明能有效抑制肿瘤的生长[2]，近来运用可溶性sKDR又为阻断VEGF与内源性受体的结合提供了新的思路[3]。我们首次采用原核表达系统进行了sKDR的大量表达，表达产物经变性、复性处理后，能直接结合VEGF，可抑制VEGF对内皮细胞的刺激增殖，也可以抑制鸡胚的血管形成。
二、材料和方法
, 百拇医药
1.细胞株及主要试剂：人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)由中国预防医学科学院病毒学研究所遗传室惠赠；人重组VEGF165购自美国Upstate Biotechnology Co. ；体外活性ED50近似1 mg/L；125I-VEGF购自美国life Technologies Incorp；3H-TdR购自中国科学院原子能研究所；四甲基偶氮唑盐(MTT)为SIGMA公司产品；受精鸡蛋购自北京市丰台区种鸡场。
2.sKDR的表达、提取、变性、复性：用含目的片段的表达载体pGEX2T-KDR I-IV转化大肠杆菌XL-1 Blue，挑单克隆扩增。异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达，以包含体的形式存在。纯化的包含体用变性液(尿素8 mol/L，DTT 10 mmol/L，Tris-HCl 50 mmol/L pH 8.5)室温变性处理3～4 h，然后用8～10倍体积的复性液(Tris-HCl 50 mmol/L pH 8.5, EDTA 5 mmol/L, GSH 5 mmol/L, GSSG 2 mmol/L) 室温复性4 h以上。获得的可溶性GST-KDR行SDS-PAGE分析其纯度及含量。
, 百拇医药
3.sKDR与125I-VEGF的结合实验:(1)固相化受体-配基结合实验:sKDR与VEGF的直接结合实验基本按文献[4]进行。经复性后的sKDR蛋白用10 mmoL磷酸钠缓冲液(pH 6.2)稀释成1 mg/L，50 μl/孔加入96孔板, 4℃过夜包被；用结合缓冲液(DMEM/25 mmoL HEPES, pH 7.6，含0.3% BSA)室温封闭2 h；加入不同浓度125I-VEGF( 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 8, 1 μg/L), 室温2～3 h；用200 μl结合缓冲液冲洗3次后，于γ-计数仪测各孔的cpm值即为总结合(TB)。非特异性结合(NB)通过于不同浓度125I-VEGF组中加入60倍过量的sKDR孵育后再加入各孔测cpm。以特异结合(SB)cpm值(TB-NB)来绘制sKDR与125I-VEGF的结合饱和曲线。(2) 竞争性固相受体-配基结合检测: 按上述相同方法包被sKDR受体于96孔板上，并用结合缓冲液室温封闭2～3 h，每孔加入固定量125I-VEGF(2 μg/L) 和逐渐增加量的sKDR蛋白, 以竞争125I-VEGF与固相化sKDR结合, 室温反应3 h，用γ计数器测cpm值。观察不同浓度的游离sKDR竞争抑制125I-VEGF与固相化sKDR结合情况。
, 百拇医药
4. 体外内皮细胞增生抑制检测：(1) 细胞计数方法检测sKDR对EC增殖的影响： HUVEC细胞在24孔板中接种培养过夜后换成0.4% FCS培养液, 饥饿培养24 h后，加入不同浓度sKDR, 各孔同时加入等量VEGF165(2 μg/L)并设单独VEGF (2 μg/L) 刺激孔及PBS对照，每组设4个平行孔。分别于24、48、72 h进行计数并与对照组进行比较。 (2)3H-TdR掺入法检测sKDR对EC DNA合成的抑制作用 ： 接种HUVEC至96孔培养板(2×103细胞/孔), 撤血清至0.4%培养24 h后分组，每孔加入不同浓度sKDR, 同时加VEGF (2 μg/L), 并设VEGF单独刺激组及无关蛋白组，培养48 h后, 再加入3H-TdR 18.5kBq/孔, 继续作用6～8 h, 吸出培养上清液, 用细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维膜上并用95%酒精固定、干燥, 将膜置于含2.5 ml液闪液的闪烁瓶中, 用液闪仪测定各孔cpm值。
, 百拇医药
5.体内sKDR对鸡胚绒毛尿囊膜血管形成抑制效应测定：参考付生法等[5]方法加以改进，将孵化第9天加药改为第6天开始加药，将直径为3 mm的圆形玻璃纤维膜放在绒毛尿囊膜血管较少部位，然后将sKDR(2 μg/胚)与VEGF(2 ng/胚)同时加在膜上，并设PBS和无关蛋白P21对照，及VEGF单独刺激组对照，38℃孵育箱培养48 h后观察各组鸡胚血管发育情况。
二、结果
1.sKDR的表达、提取及其变性复性后处理: 质粒pGEX2T-KDR I-IV 转化大肠杆菌XL-1 Blue, IPTG诱导表达, 表达蛋白质的相对分子质量为66 000左右, 与预计值相符。GST-KDR经变性、复性处理未见明显降解。以类似方法表达、提取，变性和复性处理的GST-P21也获得了类似的结果。
2.sKDR与VEGF的直接结合实验：固相化受体配基结合实验表明, 固相化的sKDR能直接结合游离的125I-VEGF, 结合量随125I-VEGF浓度的增加而增加。选敏感浓度125I-VEGF 2 μg/L为固定值, 用不同浓度的非包被sKDR(0.001、0.01、0.1、1、2、6、10 mg/L), 进行竞争抑制检测, 结果表明，随游离sKDR浓度的升高, 结合到固相sKDR的125I-VEGF值逐渐减少。
, 百拇医药
3.sKDR体外抑制EC增殖活性：细胞计数法发现sKDR
明显抑制外加VEGF及内源性VEGF所致的EC增殖, 且具有剂量和时间依赖性。3H-TdR掺入实验结果表明, sKDR对EC 3H-TdR掺入量有明显抑制作用并呈剂量依赖关系。与VEGF刺激组相比，2.5 mg/L和7.5 mg/L的sKDR对EC3H-TdR掺入抑制率分别为61.8%和68.8%, 与对照组GST-P21相比差异具有显著意义(P<0.01)。
4.sKDR体内抑制鸡胚血管形成：结果如图1所示, 当sKDR剂量为2 μg/胚并同时加入VEGF 2 ng/胚时, 与对照组PBS或VEGF刺激组相比, sKDR对所有受检鸡胚均有明显的血管抑制作用。表现为玻璃纤维纸片周围大多数无血管形成，胚血管明显受抑，数量变少、变稀且血流量明显减少。而无关蛋白P21对鸡胚血管形成无明显影响。
, 百拇医药
图1 sKDR对鸡胚绒毛尿囊膜血管形成的抑制作用
三、讨论
本研究首次运用原核表达系统大量表达sKDR，表达的sKDR以包含体形式存在, 采用温和的变性剂尿素并加用DTT(10 mmol/L)使包含体蛋白的二硫键断开, 用还原型和氧化型谷胱苷肽和适量EDTA在Tris-HCl pH 8.5条件下使蛋白复性, 让还原的巯基重新氧化形成配对正确的二硫键。经过上述处理的sKDR产物具有直接结合VEGF及抑制内皮细胞增殖和血管形成的生物活性。以前报道可溶性PDGF受体能够以高亲和力结合其配基充当竞争抑制剂，通过与内源性功能受体竞争配基而阻止受体活化；sKDR的体内外抑制EC及血管形成活性也可能是基于上述机制。重组可溶性受体像其他重组蛋白如INF一样易于直接应用于病人。正是由于上述优势，可溶性VEGF受体作为新一代抗肿瘤血管治疗试剂正越来越受到研究者及临床工作者的青睐。
基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(39525021)
, 百拇医药
参考文献：
1 Strawn LM, Mcmahan G, Sehreck H, et al . Flk-1 as a target for tumor growth inhibition. Cancer Res, 1996, 56: 3540-3545.
2 Borgstrom P, Bourdon MA, Hillan KJ, et al. Neutralizing anti-vascular endothelial growth factor antibody completely inhibits angiogenesis and growth of human prostate carcinoma micro tumors in vivo. Prostate, 1998, 35:1-10.
3 Lin P, Sanker S, Shan SQ, et al. Inhibition of tumor growth by targeting tumor endothelium using a soluble vascular endothelial growth factor receptor. Cell growth ＆ differentiation 1998,9: 49-58.
4 Tanaka K, Yamaguchi S, Sawano A, et al. Characterization of the extracellular domain in vascular endothelial growth factor receptor-1 (Flt-1 Tyrosine Kinase). Jpn J Cancer Res, 1997, 88: 867-876.
5 付生法，陆应麟，张朝山,等. 检测血管生长抑制因子作用的鸡胚绒毛尿囊膜技术.军事医学科学院院刊.1993，17：294-297.
收稿日期：1999-04-14, http://www.100md.com
单位：北京市肿瘤防治研究所 北京医科大学临床肿瘤学院生化与分子生物学研究室 100034)
关键词：
中华医学杂志000328 血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其VEGF受体(sKDR)在刺激内皮细胞增殖中有特殊作用[1]，阻断VEGF与受体KDR的结合已成为抗血管形成的重要靶点。VEGF抗体已被证明能有效抑制肿瘤的生长[2]，近来运用可溶性sKDR又为阻断VEGF与内源性受体的结合提供了新的思路[3]。我们首次采用原核表达系统进行了sKDR的大量表达，表达产物经变性、复性处理后，能直接结合VEGF，可抑制VEGF对内皮细胞的刺激增殖，也可以抑制鸡胚的血管形成。
二、材料和方法
, 百拇医药
1.细胞株及主要试剂：人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)由中国预防医学科学院病毒学研究所遗传室惠赠；人重组VEGF165购自美国Upstate Biotechnology Co. ；体外活性ED50近似1 mg/L；125I-VEGF购自美国life Technologies Incorp；3H-TdR购自中国科学院原子能研究所；四甲基偶氮唑盐(MTT)为SIGMA公司产品；受精鸡蛋购自北京市丰台区种鸡场。
2.sKDR的表达、提取、变性、复性：用含目的片段的表达载体pGEX2T-KDR I-IV转化大肠杆菌XL-1 Blue，挑单克隆扩增。异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达，以包含体的形式存在。纯化的包含体用变性液(尿素8 mol/L，DTT 10 mmol/L，Tris-HCl 50 mmol/L pH 8.5)室温变性处理3～4 h，然后用8～10倍体积的复性液(Tris-HCl 50 mmol/L pH 8.5, EDTA 5 mmol/L, GSH 5 mmol/L, GSSG 2 mmol/L) 室温复性4 h以上。获得的可溶性GST-KDR行SDS-PAGE分析其纯度及含量。
, 百拇医药
3.sKDR与125I-VEGF的结合实验:(1)固相化受体-配基结合实验:sKDR与VEGF的直接结合实验基本按文献[4]进行。经复性后的sKDR蛋白用10 mmoL磷酸钠缓冲液(pH 6.2)稀释成1 mg/L，50 μl/孔加入96孔板, 4℃过夜包被；用结合缓冲液(DMEM/25 mmoL HEPES, pH 7.6，含0.3% BSA)室温封闭2 h；加入不同浓度125I-VEGF( 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 8, 1 μg/L), 室温2～3 h；用200 μl结合缓冲液冲洗3次后，于γ-计数仪测各孔的cpm值即为总结合(TB)。非特异性结合(NB)通过于不同浓度125I-VEGF组中加入60倍过量的sKDR孵育后再加入各孔测cpm。以特异结合(SB)cpm值(TB-NB)来绘制sKDR与125I-VEGF的结合饱和曲线。(2) 竞争性固相受体-配基结合检测: 按上述相同方法包被sKDR受体于96孔板上，并用结合缓冲液室温封闭2～3 h，每孔加入固定量125I-VEGF(2 μg/L) 和逐渐增加量的sKDR蛋白, 以竞争125I-VEGF与固相化sKDR结合, 室温反应3 h，用γ计数器测cpm值。观察不同浓度的游离sKDR竞争抑制125I-VEGF与固相化sKDR结合情况。
, 百拇医药
4. 体外内皮细胞增生抑制检测：(1) 细胞计数方法检测sKDR对EC增殖的影响： HUVEC细胞在24孔板中接种培养过夜后换成0.4% FCS培养液, 饥饿培养24 h后，加入不同浓度sKDR, 各孔同时加入等量VEGF165(2 μg/L)并设单独VEGF (2 μg/L) 刺激孔及PBS对照，每组设4个平行孔。分别于24、48、72 h进行计数并与对照组进行比较。 (2)3H-TdR掺入法检测sKDR对EC DNA合成的抑制作用 ： 接种HUVEC至96孔培养板(2×103细胞/孔), 撤血清至0.4%培养24 h后分组，每孔加入不同浓度sKDR, 同时加VEGF (2 μg/L), 并设VEGF单独刺激组及无关蛋白组，培养48 h后, 再加入3H-TdR 18.5kBq/孔, 继续作用6～8 h, 吸出培养上清液, 用细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维膜上并用95%酒精固定、干燥, 将膜置于含2.5 ml液闪液的闪烁瓶中, 用液闪仪测定各孔cpm值。
, 百拇医药
5.体内sKDR对鸡胚绒毛尿囊膜血管形成抑制效应测定：参考付生法等[5]方法加以改进，将孵化第9天加药改为第6天开始加药，将直径为3 mm的圆形玻璃纤维膜放在绒毛尿囊膜血管较少部位，然后将sKDR(2 μg/胚)与VEGF(2 ng/胚)同时加在膜上，并设PBS和无关蛋白P21对照，及VEGF单独刺激组对照，38℃孵育箱培养48 h后观察各组鸡胚血管发育情况。
二、结果
1.sKDR的表达、提取及其变性复性后处理: 质粒pGEX2T-KDR I-IV 转化大肠杆菌XL-1 Blue, IPTG诱导表达, 表达蛋白质的相对分子质量为66 000左右, 与预计值相符。GST-KDR经变性、复性处理未见明显降解。以类似方法表达、提取，变性和复性处理的GST-P21也获得了类似的结果。
2.sKDR与VEGF的直接结合实验：固相化受体配基结合实验表明, 固相化的sKDR能直接结合游离的125I-VEGF, 结合量随125I-VEGF浓度的增加而增加。选敏感浓度125I-VEGF 2 μg/L为固定值, 用不同浓度的非包被sKDR(0.001、0.01、0.1、1、2、6、10 mg/L), 进行竞争抑制检测, 结果表明，随游离sKDR浓度的升高, 结合到固相sKDR的125I-VEGF值逐渐减少。
, 百拇医药
3.sKDR体外抑制EC增殖活性：细胞计数法发现sKDR
明显抑制外加VEGF及内源性VEGF所致的EC增殖, 且具有剂量和时间依赖性。3H-TdR掺入实验结果表明, sKDR对EC 3H-TdR掺入量有明显抑制作用并呈剂量依赖关系。与VEGF刺激组相比，2.5 mg/L和7.5 mg/L的sKDR对EC3H-TdR掺入抑制率分别为61.8%和68.8%, 与对照组GST-P21相比差异具有显著意义(P<0.01)。
4.sKDR体内抑制鸡胚血管形成：结果如图1所示, 当sKDR剂量为2 μg/胚并同时加入VEGF 2 ng/胚时, 与对照组PBS或VEGF刺激组相比, sKDR对所有受检鸡胚均有明显的血管抑制作用。表现为玻璃纤维纸片周围大多数无血管形成，胚血管明显受抑，数量变少、变稀且血流量明显减少。而无关蛋白P21对鸡胚血管形成无明显影响。
, 百拇医药
图1 sKDR对鸡胚绒毛尿囊膜血管形成的抑制作用
三、讨论
本研究首次运用原核表达系统大量表达sKDR，表达的sKDR以包含体形式存在, 采用温和的变性剂尿素并加用DTT(10 mmol/L)使包含体蛋白的二硫键断开, 用还原型和氧化型谷胱苷肽和适量EDTA在Tris-HCl pH 8.5条件下使蛋白复性, 让还原的巯基重新氧化形成配对正确的二硫键。经过上述处理的sKDR产物具有直接结合VEGF及抑制内皮细胞增殖和血管形成的生物活性。以前报道可溶性PDGF受体能够以高亲和力结合其配基充当竞争抑制剂，通过与内源性功能受体竞争配基而阻止受体活化；sKDR的体内外抑制EC及血管形成活性也可能是基于上述机制。重组可溶性受体像其他重组蛋白如INF一样易于直接应用于病人。正是由于上述优势，可溶性VEGF受体作为新一代抗肿瘤血管治疗试剂正越来越受到研究者及临床工作者的青睐。
基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(39525021)
, 百拇医药
参考文献：
1 Strawn LM, Mcmahan G, Sehreck H, et al . Flk-1 as a target for tumor growth inhibition. Cancer Res, 1996, 56: 3540-3545.
2 Borgstrom P, Bourdon MA, Hillan KJ, et al. Neutralizing anti-vascular endothelial growth factor antibody completely inhibits angiogenesis and growth of human prostate carcinoma micro tumors in vivo. Prostate, 1998, 35:1-10.
3 Lin P, Sanker S, Shan SQ, et al. Inhibition of tumor growth by targeting tumor endothelium using a soluble vascular endothelial growth factor receptor. Cell growth ＆ differentiation 1998,9: 49-58.
4 Tanaka K, Yamaguchi S, Sawano A, et al. Characterization of the extracellular domain in vascular endothelial growth factor receptor-1 (Flt-1 Tyrosine Kinase). Jpn J Cancer Res, 1997, 88: 867-876.
5 付生法，陆应麟，张朝山,等. 检测血管生长抑制因子作用的鸡胚绒毛尿囊膜技术.军事医学科学院院刊.1993，17：294-297.
收稿日期：1999-04-14, http://www.100md.com