车前草不同提取方法的比较研究*
作者：袁 珂 简秀梅 孟 江
单位：袁 珂(郑州 450003 河南中医学院)；简秀梅(桐柏 474780 河南油田双河医院)；孟 江(河南中医学院中药系毕业实习生)
关键词：车前草；乌苏酸；提取；含量测定；破碎
中国现代应用药学990408 摘要 目的：对车前草的不同提取方法进行了比较研究。方法：采用5种不同的提取方法，对提取物的收率进行比较，并以乌苏酸为考察指标分别对其进行含量测定。结果：破碎提取法所提取的乌苏酸含量较高。结论：破碎提取法与其它方法相比，具有提取快速完全、不需加热、节省时间、溶剂和能源，所提取的有效成分含量较高等优点。
Compaprision among several different extraction methods for Herba plantaginis
, 百拇医药
Yuan Ke(Yuan K)，Jian Xiumei(Jian XM)，Meng Jiang(Meng J)(Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450003)
ABSTRACT OBJECTIVE：To compare the different extraction methods for Herba plantaginis.METHOD:The recoveries of extract content by five different extraction methods were compared,and ursolic acid was assaged as index.RESULTS:The smashing extraction method gave the higher yield of ursolic acid.CONCLUSION:The smashing extraction method was superior to other methods.This method had the advantages of fast extraction speed,no heat,be economical of time,solvent and energy,and have high yield of ursolic acid.
, 百拇医药
KEY WORDS Herba plantaginis,ursolic acid,extraction method,determination of content,smashing extraction
车前草又名车前、车轮菜、猪耳草、钱串草等。为车前科植物车前(Plantago asiatica L.)或平车前(Plantago depressa Willd.)的干燥全草。车前草中主要有效成分为乌苏酸、车前苷、桃叶珊瑚苷等。现代药理研究表明[1，2]，乌苏酸具有较强的抗肿瘤活性，它不仅对多种致癌、促癌物有抵抗作用，而且对多种恶性肿瘤细胞例如P388和L1210白血病细胞，A-549人肺腺癌细胞有抑制生长作用，同时它还具有抗突变、抗氧化和诱导癌细胞分化及增强细胞免疫功能等方面的作用。作者对车前草的不同提取方法进行了研究，通过对5种提取方法所得提取物的收率及提取物中乌苏酸的含量进行测定比较，确定出最佳提取方法，为工业生产提供参考依据。
, http://www.100md.com
1 仪器与试剂
CS-9301双波长薄层扫描仪(日本岛津)；三用紫外线分析仪(江苏省江阴市申港电光仪器厂)。点样定量毛细管(Drummond Scientific CO USA)，PBQI型薄层铺板器(重庆南岸新力实验电器厂)，硅胶(青岛海洋化工厂)。
车前草于1997年7月采自河南省郑州市郊，乌苏酸对照品(中国药品生物制品检定所)。破碎提取采用自制中草药破碎提取器(已获国家专利)。
所用试剂均为分析纯。
2 实验方法与结果
2.1 含量测定方法的建立
2.1.1 薄层层析条件及薄层扫描条件：吸附剂：硅胶G-0.3% CMC-Na(3∶1)搅拌均匀后涂布于(10×20cm)玻璃板上，厚度为0.3mm，室温置干后于105℃活化1h置干燥器中备用。展开剂：氯仿-丙酮(8∶2)，展开方式：上行，展距15cm。显色剂：50%硫酸乙醇液，喷湿润，100～105℃烘烤5min，至斑点清晰，取出，放凉后，在紫外灯(365nm)下定位，Rf值在0.5左右。
, 百拇医药
采用反射法单波长锯齿扫描法，狭缝0.4×0.4mm，线性参数Sx=3，灵敏度中，测定波长λs=330nm。
2.1.2对照品溶液和样品溶液的制备：精密称取乌苏酸对照品1.04mg，置2ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，为0.52mg/ml。
分别精密称取车前草原料8份，每份20g，其中4份分别进行回流提取、渗漉提取、冷浸提取及破碎提取，另4份分别选用甲醇、95%乙醇、丙酮及乙醚4种不同的溶剂同时进行索氏提取，将提取液浓缩至干，残渣分别用甲醇溶解，转移至量瓶中用甲醇定容至刻度备用。
2.1.3线性化范围试验：用定量毛细管吸取上述对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0和5.0μl点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂，烘烤至出现紫红色斑点。放置30min后进行扫描测定。以乌苏酸量(μg)为横坐标，以斑点峰面积值为纵坐标作图，得一不通过原点的直线，求得回归方程：Y=300.72X+15.106，r=0.999(n=5)。结果表明乌苏酸在0.52～2.60μg范围内，与其峰面积值呈良好的线性关系。
, 百拇医药
2.1.4 稳定性试验：在同一硅胶G薄层板上，点乌苏酸对照品溶液4μl，进行展开、显色后，分别于30，60，90和120min进行扫描测定，结果2h内斑点面积积分值基本不变，X=638.891,RSD=1.68%。
2.1.5 精密度及重现性试验：用定量毛细管吸取对照品溶液4μl点相同浓度的5个点于同一块薄层板上，进行展开、显色、扫描，结果斑点面积积分值平均值
=653.136,RSD=2.17%,说明精密度尚好。
同一展开后的样品斑点连续5次扫描测定，结果斑点面积积分值平均值=758.233,RSD=1.74%，说明重现性好。
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2.1.6 加样回收率试验：取干燥恒重并过60目筛的车前草10g，加入适量乌苏酸对照品，加95%乙醇200ml置索氏提取器中提取至近无色(10h)，将提取液浓缩至干，残渣用适量甲醇溶解，转移至50ml量瓶中用甲醇定容至刻度，测定结果，乌苏酸的平均回收率为97.86%,RSD为1.84%。
2.2 不同溶剂提取所得提取物量及收率的比较
2.2.1 提取方法：为了选择出合适的溶剂进行提取，我们分别选用甲醇、95%乙醇、丙酮和乙醚4种不同的溶剂分别进行索氏提取，原料均取20g，溶剂用量为250ml，提取时间均为12h。分别将提取液浓缩至稠膏状移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率，见表1。
2.2.2 不同提取溶剂中乌苏酸的含量比较：分别吸取一定量由不同溶剂提取所制得的样品溶液点于同一硅胶G薄层板上，随行点对照品溶液1和3μl进行展开、显色、扫描，用外标两点法计算出各样品中乌苏酸的含量，结果见表2。
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表1 不同溶剂提取所得提取物量及收率的比较 提取溶剂
提取物量(g)
收率(%)
甲醇
1.85
9.25
95%乙醇
2.14
10.70
丙酮
1.52
7.60
, http://www.100md.com 乙醚
1.41
7.05
表2 不同溶剂提取所得提取物中乌苏酸含量测定结果 提取溶剂
含量(%)
平均含量(%)
RSD(%)
甲醇
0.315 0.318 0.310
0.314
1.26
95%乙醇
, 百拇医药
0.316 0.308 0.312
0.312
1.28
丙酮
0.254 0.250 0.261
0.261
2.18
乙醚
0.274 0.287 0.284
0.282
2.42
由表1可以看出，由4种不同的溶剂进行索氏提取，以95%乙醇进行提取所得提取物的收率为最高；从表2可以看出，以甲醇或95%乙醇为溶剂进行提取，所得提取物中乌苏酸含量相对最高。虽然以甲醇提取的含量略高于95%乙醇，但由于两者数值很接近，又考虑到95%乙醇与其它溶剂相比，具有无毒安全，价廉易得的优点，故提取溶剂选定95%乙醇。
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2.3 不同提取方法所得提取物量及收率的比较
2.3.1回流提取法：称取原料50g，适当切碎后用10倍量95%乙醇回流提取3次，每次3h，合并提取液，抽滤后将滤液浓缩至一定量移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率。
2.3.2 索氏提取：称取原料50g，粉碎并过60目筛后置索氏提取器套筒中，用15倍量95%乙醇进行索氏提取至提取液近无色(约12h)，将提取液浓缩至一定量后移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率。
2.3.3 渗漉提取：称取原料50g，适当切碎后用95%乙醇润湿后装入渗漉筒中，加溶剂浸泡24h后开始渗漉，控制流速使其用30倍量的溶剂渗漉72h。将渗漉液浓缩至一定量后移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率。
2.3.4 冷浸提取：称取原料50g，适当切碎后每次用10倍量95%乙醇浸提3d，共提3次，合并浸提液，抽滤，将滤液浓缩至一定量后移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率。
, 百拇医药
2.3.5 破碎提取[3]：称取原料50g，用10倍量95%乙醇提取2min。提取后的材料已完全破碎成了匀浆状，抽滤，将滤液浓缩至一定量后移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率。结果见表3。表3 不同提取方法所得提取物量及收率的比较 提取方法
提取物量(g)
收率(%)
回流提取
4.18
8.36
索氏提取
5.12
10.24
, 百拇医药
渗漉提取
2.74
5.48
冷浸提取
3.05
6.10
破碎提取
3.02
6.04
2.4 不同提取方法中乌苏酸的含量比较
分别吸取一定量由不同提取方法所制得的样品溶液点于同一硅胶G薄层板上，随行点对照品溶液1和3μl进行展开、显色、扫描，用外标两点法计算出样品中乌苏酸的含量，结果见表4。表4 不同提取方法所得提取物中乌苏酸含量测定结果 提取方法
, http://www.100md.com
含量(%)
平均含量(%)
RSD(%)
回流提取
0.252 0.256 0.263
0.257
2.17
索氏提取
0.312 0.303 0.308
0.308
1.47
渗漉提取
, 百拇医药
0.274 0.260 0.265
0.266
2.66
冷浸提取
0.278 0.282 0.274
0.278
1.44
破碎提取
0.294 0.290 0.299
0.294
1.53
3 讨 论
, 百拇医药
3.1 在回流提取法中，溶剂用量较大(为30倍量)，提取所需时间较长，这样由于药液长时间受热，很容易使其中的有效成分发生改变，同时也浪费时间和能源。
在索氏提取法中，虽然溶剂用量不大，但由于需要进行长时间的加热提取，因此从时间、能源、设备等方面考虑都不及冷提法，所以此法只用来与其它方法做对照。
3种冷提法(渗漉，冷浸，破碎)则避免了加热，从而使其中的有效成分有了一定的安全性。但冷浸法和渗漉法所用溶剂量较大(均为30倍量)，提取时间也较长(前者为9d，后者为3d)，操作较麻烦，因此虽说冷浸法和渗漉法避免了加热，但同样存在费时，费工，费溶剂的缺点。破碎法则克服了上述不足，它不仅操作简单，且提取时间极短(仅2min)，提取充分完全，溶剂用量少，具有省时、省工、省电、省溶剂的特点。
3.2 从表3可以看出，采用5种不同的提取方法进行提取，所得提取物收率高低次序为：索氏法>回流法>冷浸法>破碎法>渗漉法；从表4可以看出，不同提取方法所得提取物中乌苏酸含量高低次序为：破碎法>冷浸法>渗漉法>回流法。由此可见，尽管破碎法的收率并不高，但所含有效成分乌苏酸的含量却较高，又具有上述诸多优点，因此，车前草的提取方法应优选破碎提取
, 百拇医药
*河南省自然科学基金课题第9940240号
参考文献
[1] 沈红梅，程涛，乔传桌，等.乌梅的体外抗肿瘤活性及免疫调节作用初探.中国中药杂志，1995，20(6)∶365.
[2] 黄镜，孙燕.熊果酸的抗肿瘤活性.中国新药杂志，1997，6(2)∶101.
[3] 袁珂，刘延泽，冀春茹.中草药化学成分研究中几种不同提取方法的比较研究.天然产物研究与开发，1997，9(4)∶57.
[4] 袁珂.微波加热快速测定中药提取物的干重及出膏率.河南科学,1998,16(1)∶108.
收稿日期：1998-11-16, 百拇医药
单位：袁 珂(郑州 450003 河南中医学院)；简秀梅(桐柏 474780 河南油田双河医院)；孟 江(河南中医学院中药系毕业实习生)
关键词：车前草；乌苏酸；提取；含量测定；破碎
中国现代应用药学990408 摘要 目的：对车前草的不同提取方法进行了比较研究。方法：采用5种不同的提取方法，对提取物的收率进行比较，并以乌苏酸为考察指标分别对其进行含量测定。结果：破碎提取法所提取的乌苏酸含量较高。结论：破碎提取法与其它方法相比，具有提取快速完全、不需加热、节省时间、溶剂和能源，所提取的有效成分含量较高等优点。
Compaprision among several different extraction methods for Herba plantaginis
, 百拇医药
Yuan Ke(Yuan K)，Jian Xiumei(Jian XM)，Meng Jiang(Meng J)(Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450003)
ABSTRACT OBJECTIVE：To compare the different extraction methods for Herba plantaginis.METHOD:The recoveries of extract content by five different extraction methods were compared,and ursolic acid was assaged as index.RESULTS:The smashing extraction method gave the higher yield of ursolic acid.CONCLUSION:The smashing extraction method was superior to other methods.This method had the advantages of fast extraction speed,no heat,be economical of time,solvent and energy,and have high yield of ursolic acid.
, 百拇医药
KEY WORDS Herba plantaginis,ursolic acid,extraction method,determination of content,smashing extraction
车前草又名车前、车轮菜、猪耳草、钱串草等。为车前科植物车前(Plantago asiatica L.)或平车前(Plantago depressa Willd.)的干燥全草。车前草中主要有效成分为乌苏酸、车前苷、桃叶珊瑚苷等。现代药理研究表明[1，2]，乌苏酸具有较强的抗肿瘤活性，它不仅对多种致癌、促癌物有抵抗作用，而且对多种恶性肿瘤细胞例如P388和L1210白血病细胞，A-549人肺腺癌细胞有抑制生长作用，同时它还具有抗突变、抗氧化和诱导癌细胞分化及增强细胞免疫功能等方面的作用。作者对车前草的不同提取方法进行了研究，通过对5种提取方法所得提取物的收率及提取物中乌苏酸的含量进行测定比较，确定出最佳提取方法，为工业生产提供参考依据。
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1 仪器与试剂
CS-9301双波长薄层扫描仪(日本岛津)；三用紫外线分析仪(江苏省江阴市申港电光仪器厂)。点样定量毛细管(Drummond Scientific CO USA)，PBQI型薄层铺板器(重庆南岸新力实验电器厂)，硅胶(青岛海洋化工厂)。
车前草于1997年7月采自河南省郑州市郊，乌苏酸对照品(中国药品生物制品检定所)。破碎提取采用自制中草药破碎提取器(已获国家专利)。
所用试剂均为分析纯。
2 实验方法与结果
2.1 含量测定方法的建立
2.1.1 薄层层析条件及薄层扫描条件：吸附剂：硅胶G-0.3% CMC-Na(3∶1)搅拌均匀后涂布于(10×20cm)玻璃板上，厚度为0.3mm，室温置干后于105℃活化1h置干燥器中备用。展开剂：氯仿-丙酮(8∶2)，展开方式：上行，展距15cm。显色剂：50%硫酸乙醇液，喷湿润，100～105℃烘烤5min，至斑点清晰，取出，放凉后，在紫外灯(365nm)下定位，Rf值在0.5左右。
, 百拇医药
采用反射法单波长锯齿扫描法，狭缝0.4×0.4mm，线性参数Sx=3，灵敏度中，测定波长λs=330nm。
2.1.2对照品溶液和样品溶液的制备：精密称取乌苏酸对照品1.04mg，置2ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，为0.52mg/ml。
分别精密称取车前草原料8份，每份20g，其中4份分别进行回流提取、渗漉提取、冷浸提取及破碎提取，另4份分别选用甲醇、95%乙醇、丙酮及乙醚4种不同的溶剂同时进行索氏提取，将提取液浓缩至干，残渣分别用甲醇溶解，转移至量瓶中用甲醇定容至刻度备用。
2.1.3线性化范围试验：用定量毛细管吸取上述对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0和5.0μl点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂，烘烤至出现紫红色斑点。放置30min后进行扫描测定。以乌苏酸量(μg)为横坐标，以斑点峰面积值为纵坐标作图，得一不通过原点的直线，求得回归方程：Y=300.72X+15.106，r=0.999(n=5)。结果表明乌苏酸在0.52～2.60μg范围内，与其峰面积值呈良好的线性关系。
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2.1.4 稳定性试验：在同一硅胶G薄层板上，点乌苏酸对照品溶液4μl，进行展开、显色后，分别于30，60，90和120min进行扫描测定，结果2h内斑点面积积分值基本不变，X=638.891,RSD=1.68%。
2.1.5 精密度及重现性试验：用定量毛细管吸取对照品溶液4μl点相同浓度的5个点于同一块薄层板上，进行展开、显色、扫描，结果斑点面积积分值平均值
=653.136,RSD=2.17%,说明精密度尚好。同一展开后的样品斑点连续5次扫描测定，结果斑点面积积分值平均值
=758.233,RSD=1.74%，说明重现性好。, http://www.100md.com
2.1.6 加样回收率试验：取干燥恒重并过60目筛的车前草10g，加入适量乌苏酸对照品，加95%乙醇200ml置索氏提取器中提取至近无色(10h)，将提取液浓缩至干，残渣用适量甲醇溶解，转移至50ml量瓶中用甲醇定容至刻度，测定结果，乌苏酸的平均回收率为97.86%,RSD为1.84%。
2.2 不同溶剂提取所得提取物量及收率的比较
2.2.1 提取方法：为了选择出合适的溶剂进行提取，我们分别选用甲醇、95%乙醇、丙酮和乙醚4种不同的溶剂分别进行索氏提取，原料均取20g，溶剂用量为250ml，提取时间均为12h。分别将提取液浓缩至稠膏状移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率，见表1。
2.2.2 不同提取溶剂中乌苏酸的含量比较：分别吸取一定量由不同溶剂提取所制得的样品溶液点于同一硅胶G薄层板上，随行点对照品溶液1和3μl进行展开、显色、扫描，用外标两点法计算出各样品中乌苏酸的含量，结果见表2。
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表1 不同溶剂提取所得提取物量及收率的比较 提取溶剂
提取物量(g)
收率(%)
甲醇
1.85
9.25
95%乙醇
2.14
10.70
丙酮
1.52
7.60
, http://www.100md.com 乙醚
1.41
7.05
表2 不同溶剂提取所得提取物中乌苏酸含量测定结果 提取溶剂
含量(%)
平均含量(%)
RSD(%)
甲醇
0.315 0.318 0.310
0.314
1.26
95%乙醇
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0.316 0.308 0.312
0.312
1.28
丙酮
0.254 0.250 0.261
0.261
2.18
乙醚
0.274 0.287 0.284
0.282
2.42
由表1可以看出，由4种不同的溶剂进行索氏提取，以95%乙醇进行提取所得提取物的收率为最高；从表2可以看出，以甲醇或95%乙醇为溶剂进行提取，所得提取物中乌苏酸含量相对最高。虽然以甲醇提取的含量略高于95%乙醇，但由于两者数值很接近，又考虑到95%乙醇与其它溶剂相比，具有无毒安全，价廉易得的优点，故提取溶剂选定95%乙醇。
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2.3 不同提取方法所得提取物量及收率的比较
2.3.1回流提取法：称取原料50g，适当切碎后用10倍量95%乙醇回流提取3次，每次3h，合并提取液，抽滤后将滤液浓缩至一定量移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率。
2.3.2 索氏提取：称取原料50g，粉碎并过60目筛后置索氏提取器套筒中，用15倍量95%乙醇进行索氏提取至提取液近无色(约12h)，将提取液浓缩至一定量后移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率。
2.3.3 渗漉提取：称取原料50g，适当切碎后用95%乙醇润湿后装入渗漉筒中，加溶剂浸泡24h后开始渗漉，控制流速使其用30倍量的溶剂渗漉72h。将渗漉液浓缩至一定量后移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率。
2.3.4 冷浸提取：称取原料50g，适当切碎后每次用10倍量95%乙醇浸提3d，共提3次，合并浸提液，抽滤，将滤液浓缩至一定量后移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率。
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2.3.5 破碎提取[3]：称取原料50g，用10倍量95%乙醇提取2min。提取后的材料已完全破碎成了匀浆状，抽滤，将滤液浓缩至一定量后移入微波炉[4]中烘干至恒重，称重，计算收率。结果见表3。表3 不同提取方法所得提取物量及收率的比较 提取方法
提取物量(g)
收率(%)
回流提取
4.18
8.36
索氏提取
5.12
10.24
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渗漉提取
2.74
5.48
冷浸提取
3.05
6.10
破碎提取
3.02
6.04
2.4 不同提取方法中乌苏酸的含量比较
分别吸取一定量由不同提取方法所制得的样品溶液点于同一硅胶G薄层板上，随行点对照品溶液1和3μl进行展开、显色、扫描，用外标两点法计算出样品中乌苏酸的含量，结果见表4。表4 不同提取方法所得提取物中乌苏酸含量测定结果 提取方法
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含量(%)
平均含量(%)
RSD(%)
回流提取
0.252 0.256 0.263
0.257
2.17
索氏提取
0.312 0.303 0.308
0.308
1.47
渗漉提取
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0.274 0.260 0.265
0.266
2.66
冷浸提取
0.278 0.282 0.274
0.278
1.44
破碎提取
0.294 0.290 0.299
0.294
1.53
3 讨 论
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3.1 在回流提取法中，溶剂用量较大(为30倍量)，提取所需时间较长，这样由于药液长时间受热，很容易使其中的有效成分发生改变，同时也浪费时间和能源。
在索氏提取法中，虽然溶剂用量不大，但由于需要进行长时间的加热提取，因此从时间、能源、设备等方面考虑都不及冷提法，所以此法只用来与其它方法做对照。
3种冷提法(渗漉，冷浸，破碎)则避免了加热，从而使其中的有效成分有了一定的安全性。但冷浸法和渗漉法所用溶剂量较大(均为30倍量)，提取时间也较长(前者为9d，后者为3d)，操作较麻烦，因此虽说冷浸法和渗漉法避免了加热，但同样存在费时，费工，费溶剂的缺点。破碎法则克服了上述不足，它不仅操作简单，且提取时间极短(仅2min)，提取充分完全，溶剂用量少，具有省时、省工、省电、省溶剂的特点。
3.2 从表3可以看出，采用5种不同的提取方法进行提取，所得提取物收率高低次序为：索氏法>回流法>冷浸法>破碎法>渗漉法；从表4可以看出，不同提取方法所得提取物中乌苏酸含量高低次序为：破碎法>冷浸法>渗漉法>回流法。由此可见，尽管破碎法的收率并不高，但所含有效成分乌苏酸的含量却较高，又具有上述诸多优点，因此，车前草的提取方法应优选破碎提取
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*河南省自然科学基金课题第9940240号
参考文献
[1] 沈红梅，程涛，乔传桌，等.乌梅的体外抗肿瘤活性及免疫调节作用初探.中国中药杂志，1995，20(6)∶365.
[2] 黄镜，孙燕.熊果酸的抗肿瘤活性.中国新药杂志，1997，6(2)∶101.
[3] 袁珂，刘延泽，冀春茹.中草药化学成分研究中几种不同提取方法的比较研究.天然产物研究与开发，1997，9(4)∶57.
[4] 袁珂.微波加热快速测定中药提取物的干重及出膏率.河南科学,1998,16(1)∶108.
收稿日期：1998-11-16, 百拇医药
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