TGFα-PE40对兔颈总动脉损伤后内膜增生的抑制作用
作者：王 兵 李玉莉△ 关战军 张国元 吴宗贵 何 金△ 徐永华▲
单位：
关键词：转化生长因子α；绿脓杆菌外毒素；血管成形术；血管内膜；损伤
第二军医大学学报980220 摘要 目的：探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα-PE40；TP40)对动脉损伤后内膜增生的抑制作用。方法：48只兔随机分为治疗组(n＝24)和对照组(n＝24)，均高脂饲养；行右颈总动脉球囊内膜剥脱术后24 h，治疗组于动脉损伤段局部给予TP40 30 μg治疗，对照组给予生理盐水；治疗后第2，4和8周取实验动脉段行光镜观察及计算机图像分析。结果：光镜观察见对照组动脉内膜不规则增厚，新生内膜可见大量平滑肌细胞，管腔狭窄，治疗组动脉内膜增生被明显抑制，管腔无狭窄；计算机图像分析显示动脉损伤后第2，4和8周治疗组内膜截面积显著小于对照组(P<0.01)。结论：TP40对动脉损伤后的内膜增生具有抑制作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 541.402
Inhibitory effects of TGFα-PE40 on the neointimal proliferation after rabbit common carotid arterial injury
Wang Bing, Li Yuli, Guan Zhanjun, Zhang Guoyuan, Wu Zonggui, He Jin, Xu Yonghua(Department of Cardiovasology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003 )
Abstract Objective: To investigate inhibitory effects of recombinant TGFα-PE40(TP40) on neointimal proliferation after arterial injury. Methods: Forty-eight rabbits fed by rich cholesterol diet were randomly divided into treatment group(n=24)and control group(n=24).Rabbits in the treatment group were treated by local administration of TP40(30 μg)24 h after arterial injury, and those in the control group by saline. Optical microscope and computer image analysis were used to study rabbit arterial segment 2，4 and 8 weeks after treatment. Results: Irregular thickening of arterial intima,large amount of smooth muscle cells within neointima, stenosis of arterial cavity of the control group and significant inhibition of intimal proliferation, no stenosis of arterial cavity of the treatment group were observed by optical microscope. Computer image analysis showed that neointimal area of the treatment group 2，4 and 8 weeks after treatment was significant smaller than that of control(P<0.01). Conclusion: It indicates that TP40 can greatly inhibit neointimal proliferation after arterial injury.
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Key words transforming growth factor α；pseudomonas exotoxin; angioplasty; vascular intima; injury
经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后6个月内再狭窄的发生率高达30%～50%[1]，成为其应用的主要障碍。研究表明，血管平滑肌细胞(SMCs)的过度增殖在PTCA术后再狭窄中起重要作用。十多年来，研究人员对再狭窄的药物预防进行了大量的研究，但至今临床尚无有效措施。本实验拟探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα-PE40；TP40)对动脉损伤后内膜增生的抑制作用。
1 材料和方法
1.1 动物分组及饲养 纯种新西兰雄性兔48只，体质量2.5～3.5 kg，随机分为治疗组和对照组，每组24只。以上两组再分为2，4和8周3个亚组，每个亚组8只兔。动脉损伤前10 d，开始每只兔每日喂高脂饲料50 g(含胆固醇1 g、蛋黄粉10 g、猪油10 g和混合饲料29 g)，其余为普通饲料，术后继续高脂饲养。喂高脂饲料前及后1，3和5周随机取8只兔抽血送检血清总胆固醇。
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1.2 颈总动脉球囊内膜剥脱术 3%戊巴比妥纳(30 mg/kg)静注麻醉，颈正中切口，钝性分离右颈总动脉和右颈外动脉。将右颈外动脉远心端结扎，近心端用线提起，剪开动脉，逆行插入4F PTCA球囊导管(球囊直径3.0 mm，长20 mm，美国Usci公司)约4～5 cm，连接手推式压力泵(美国Namic公司)，向球囊内注入肝素生理盐水，使其膨胀并维持压力为303.97 kPa。缓慢回拉导管至切口后，回抽球囊内液体，使压力降为零，再将导管送入，重复上述过程3次。退出导管，结扎(活结)右颈外动脉切口近心端，使右颈总动脉恢复正常血流，缝合皮肤。
1.3 给药方法及剂量 右颈总动脉球囊损伤后24 h，麻醉动物，拆开颈部缝线及右颈外动脉切口近心端结扎线，实验组经Cuff管在损伤的2 cm动脉腔内注入TP40(中国科学院上海细胞生物学研究所徐永华教授合成并提供)30 μg(1 μg /μl)，对照组则注入生理盐水30 μl。给药处的两端用线向上提起以阻断血流并防止药物流失，20 min时松开此线，结扎右颈外动脉切口近心端，使右颈总动脉恢复正常血流。在治疗后的第2，4和8周活体取出实验动脉段，组织切片经HE及弹力纤维染色后做既定的指标检测。
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1.4 计算机图像分析 各组每个动脉标本取3张切片，取各组平均值。切片以横截面图像输入VIDAS计算机图像分析系统(德国Opton公司)，测量动脉内膜和中膜截面积(mm2)，求出两者比值。
1.5 统计学处理 各组数据以
±s表示，组间比较使用t检验。
2 结 果
2.1 血清总胆固醇浓度动态变化 高脂饲养前血清总胆固醇浓度为(1.09±0.45) mmol/L；高脂饲养1，3和5周时分别为(10.37±1.77) (P<0.01)，(23.47±3.41) (P<0.001)和(23.95±2.87) mmol/L (P<0.001)。
2.2 光镜观察结果 对照组2周时见动脉管腔呈同心性或偏心性狭窄，内膜不规则增厚，新生内膜可见大量梭形SMCs，排列紊乱，内膜和中膜有较多的泡沫细胞。4周时内膜较2周时进一步增厚，弹力纤维成分增多，见大量泡沫细胞，管腔狭窄更明显，甚至完全闭塞(图1A)。8周的病理变化与4周基本相同，但新生内膜SMCs数量减少，有较多的细胞外基质堆积。TP40 30 μg治疗2周组内膜增生被完全抑制，未见新生内膜，中膜结构清晰，无变性及坏死，管腔无狭窄。4周组内膜增生被明显抑制，仅轻度增生，新内膜见较多梭形SMCs，内膜和中膜有较多泡沫细胞，管腔无明显狭窄(图1B)。8周组内膜增生程度较4周组明显，新生内膜中SMCs数量减少，有较多细胞外基质堆积。
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2.3 计算机图像分析结果 TP40 30 μg能显著抑制兔颈总动脉损伤后的内膜增生(表1)。
3 讨 论
动脉球囊损伤后，中膜SMCs被激活，由收缩表型的静止状态转化为合成表型的增殖状态，进而迁
图1 4周时兔颈总动脉横切面显微摄片
Fig 1 The photomicrograph of histologic cross-section of rabbit common carotid artery
A：Control group; B: Treatment group (Elastin×100)
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表1 TGFα-PE40治疗后血管内膜面积、中膜面积及比值
Tab 1 Neointimal area, medial area and neointimal area/medial area after TGFα-PE40 treatment(n=24,±s) Group
Neointimal area(A/mm2)
Medial area(A/mm2)
Neointimal area/medial area (%)
2 week Control group
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0.429 2±0.128 6
0.654 8±0.158 3
66.52±14.80
Treatment group
0.002 0±0.000 7**
0.547 7±0.090 2
0.43± 0.09**
4 week Control group
0.968 6±0.305 4
0.593 4±0.103 7
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152.05±26.51
Treatment group
0.068 6±0.020 6**
0.480 8±0.110 1
14.16± 2.46**
8 week Control group
1.072 0±0.432 8
0.634 7±0.140 3
163.92±37.49
Treatment group
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0.133 0±0.042 0**
0.509 6±0.111 2
28.44± 4.50**
*P<0.05, **P<0.01 vs control group
移至内膜下增殖，合成并分泌细胞外基质，造成损伤管腔的狭窄[2,3]。动脉损伤后24 h，其增殖的SMCs胞膜上开始高水平地表达表皮生长因子受体(EGFR)[4]。EGFR的高水平表达可能是EGFR基因扩增、重排或转录异常所致[5]。SMCs高水平表达的EGFR可成为抑制其增殖的导向攻击目标。
TGFα是一种转化细胞异常表达的多肽类生长因子，其结构与EGF有同源性，能与EGFR结合，介导细胞增殖效应或细胞表型可逆性转化。绿脓杆菌外毒素(PE)是一种多肽毒素，它通过和靶细胞表面PE受体的结合进入细胞，催化延伸因子2的ADP-核糖基化，阻止蛋白质合成而导致细胞死亡。PE分子由受体结合结构域、转位结构域和活性结构域3部分组成。如果将PE分子中与受体结合的结构域去除，则剩余的部分——PE40失去与PE受体结合进入细胞的能力[6]。用基因工程方法将TGFα cDNA顺序与PE40片段cDNA顺序连接，并插入表达型载体，构建成可表达的重组质粒，转化大肠杆菌后表达出有生理活性的TP40融合蛋白[7]。TP40具有与表达EGFR的靶细胞特异结合的能力，因而起着导向的作用；同时携带PE40进入细胞，高效地阻断细胞内蛋白质合成，导致细胞死亡。
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TP40适宜剂量的选择对治疗结果影响较大。TP40治疗后2周的结果显示：TP40 15 μg虽然能显著抑制内膜增生，但仍有少量新生内膜，提示用药剂量偏小；TP40 60 μg虽能完全抑制内膜的增生，但造成中膜大量SMCs的变性及坏死，提示用药剂量过大；TP40 30 μg既能完全抑制内膜的增生，又未造成血管壁的坏死，是本实验较适宜的用药剂量。
TP40对靶细胞蛋白质合成抑制作用的强度，依赖细胞表面EGFR的数量[5]。利用增殖期与静止期SMCs EGFR表达水平的差异，有可能选择合适的TP40浓度，达到对增殖期SMCs有效杀伤，而对静止期SMCs较小损害的目的。正常动脉因有内皮细胞(ECs)覆盖的屏障作用，且ECs与中膜SMCs均处于收缩表型的静止状态，两者EGFR的表达水平均较低，即使是TP40 60 μg对正常动脉仍未造成损伤。所以，TP40局部用药在抑制内膜增生的使用中是安全的(资料待发表)。本研究表明动脉球囊损伤后第24 h 1次性给药治疗，2周的疗效显著，4周和8周的结果虽然令人满意，但有内膜的轻度增生。若能在内皮细胞完全修复前多次给药，可望取得更理想的疗效。TP40对动脉损伤后内膜增生所具有的导向抑制作用，为PTCA后再狭窄的预防研究开辟了一个新的领域。
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参 考 文 献
1 Rozeman Y, Gilon D, Welber S，et al. Total coronary artery occlusion late after successful coronary angioplasty of moderately severe lesion:incidence and clinical manifestations. Cardiology,1994，85(3～4):222
2 Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993,362(6423):801
3 Casscells W. Migration of smooth muscle and endothelial cells:critical events in restenosis. Circulation, 1992，86(3):723
, 百拇医药
4 Pastore CJ, Isner JM, Bacha PA, et al. Epidermal growth factor receptor-targeted cytotoxin inhibits neointimal hyperplasia in vivo. Results of local versus systemic administration. Circ Res, 1995, 77(3):519
5 徐永华，彭素芬，江万里，等.TGFα-PE40的基因克隆、表达和对人癌细胞生长的抑制作用.实验生物学报，1993，26(3)：289
6 Fu YM, Mesri EA, Yu ZX，et al. Cytotoxic effects of vascular smooth muscle cells of the chimeric toxin, heparin binding TGF alpha-Pseudomonas exotoxin.Cardiovasc Res, 1993，27(9):1691
7 Epstein SE, Siegall CB, Biro S，et al. Cytotoxic effects of recombinant chimeric toxin on rapidly proliferating vascular smooth muscle cells.Circulation, 1991，84(2):778
(1997-07-15收稿，1997-11-08修回), 百拇医药
单位：
关键词：转化生长因子α；绿脓杆菌外毒素；血管成形术；血管内膜；损伤
第二军医大学学报980220 摘要 目的：探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα-PE40；TP40)对动脉损伤后内膜增生的抑制作用。方法：48只兔随机分为治疗组(n＝24)和对照组(n＝24)，均高脂饲养；行右颈总动脉球囊内膜剥脱术后24 h，治疗组于动脉损伤段局部给予TP40 30 μg治疗，对照组给予生理盐水；治疗后第2，4和8周取实验动脉段行光镜观察及计算机图像分析。结果：光镜观察见对照组动脉内膜不规则增厚，新生内膜可见大量平滑肌细胞，管腔狭窄，治疗组动脉内膜增生被明显抑制，管腔无狭窄；计算机图像分析显示动脉损伤后第2，4和8周治疗组内膜截面积显著小于对照组(P<0.01)。结论：TP40对动脉损伤后的内膜增生具有抑制作用。
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中国图书资料分类法分类号 R 541.402
Inhibitory effects of TGFα-PE40 on the neointimal proliferation after rabbit common carotid arterial injury
Wang Bing, Li Yuli, Guan Zhanjun, Zhang Guoyuan, Wu Zonggui, He Jin, Xu Yonghua(Department of Cardiovasology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003 )
Abstract Objective: To investigate inhibitory effects of recombinant TGFα-PE40(TP40) on neointimal proliferation after arterial injury. Methods: Forty-eight rabbits fed by rich cholesterol diet were randomly divided into treatment group(n=24)and control group(n=24).Rabbits in the treatment group were treated by local administration of TP40(30 μg)24 h after arterial injury, and those in the control group by saline. Optical microscope and computer image analysis were used to study rabbit arterial segment 2，4 and 8 weeks after treatment. Results: Irregular thickening of arterial intima,large amount of smooth muscle cells within neointima, stenosis of arterial cavity of the control group and significant inhibition of intimal proliferation, no stenosis of arterial cavity of the treatment group were observed by optical microscope. Computer image analysis showed that neointimal area of the treatment group 2，4 and 8 weeks after treatment was significant smaller than that of control(P<0.01). Conclusion: It indicates that TP40 can greatly inhibit neointimal proliferation after arterial injury.
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Key words transforming growth factor α；pseudomonas exotoxin; angioplasty; vascular intima; injury
经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后6个月内再狭窄的发生率高达30%～50%[1]，成为其应用的主要障碍。研究表明，血管平滑肌细胞(SMCs)的过度增殖在PTCA术后再狭窄中起重要作用。十多年来，研究人员对再狭窄的药物预防进行了大量的研究，但至今临床尚无有效措施。本实验拟探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα-PE40；TP40)对动脉损伤后内膜增生的抑制作用。
1 材料和方法
1.1 动物分组及饲养 纯种新西兰雄性兔48只，体质量2.5～3.5 kg，随机分为治疗组和对照组，每组24只。以上两组再分为2，4和8周3个亚组，每个亚组8只兔。动脉损伤前10 d，开始每只兔每日喂高脂饲料50 g(含胆固醇1 g、蛋黄粉10 g、猪油10 g和混合饲料29 g)，其余为普通饲料，术后继续高脂饲养。喂高脂饲料前及后1，3和5周随机取8只兔抽血送检血清总胆固醇。
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1.2 颈总动脉球囊内膜剥脱术 3%戊巴比妥纳(30 mg/kg)静注麻醉，颈正中切口，钝性分离右颈总动脉和右颈外动脉。将右颈外动脉远心端结扎，近心端用线提起，剪开动脉，逆行插入4F PTCA球囊导管(球囊直径3.0 mm，长20 mm，美国Usci公司)约4～5 cm，连接手推式压力泵(美国Namic公司)，向球囊内注入肝素生理盐水，使其膨胀并维持压力为303.97 kPa。缓慢回拉导管至切口后，回抽球囊内液体，使压力降为零，再将导管送入，重复上述过程3次。退出导管，结扎(活结)右颈外动脉切口近心端，使右颈总动脉恢复正常血流，缝合皮肤。
1.3 给药方法及剂量 右颈总动脉球囊损伤后24 h，麻醉动物，拆开颈部缝线及右颈外动脉切口近心端结扎线，实验组经Cuff管在损伤的2 cm动脉腔内注入TP40(中国科学院上海细胞生物学研究所徐永华教授合成并提供)30 μg(1 μg /μl)，对照组则注入生理盐水30 μl。给药处的两端用线向上提起以阻断血流并防止药物流失，20 min时松开此线，结扎右颈外动脉切口近心端，使右颈总动脉恢复正常血流。在治疗后的第2，4和8周活体取出实验动脉段，组织切片经HE及弹力纤维染色后做既定的指标检测。
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1.4 计算机图像分析 各组每个动脉标本取3张切片，取各组平均值。切片以横截面图像输入VIDAS计算机图像分析系统(德国Opton公司)，测量动脉内膜和中膜截面积(mm2)，求出两者比值。
1.5 统计学处理 各组数据以
±s表示，组间比较使用t检验。2 结 果
2.1 血清总胆固醇浓度动态变化 高脂饲养前血清总胆固醇浓度为(1.09±0.45) mmol/L；高脂饲养1，3和5周时分别为(10.37±1.77) (P<0.01)，(23.47±3.41) (P<0.001)和(23.95±2.87) mmol/L (P<0.001)。
2.2 光镜观察结果 对照组2周时见动脉管腔呈同心性或偏心性狭窄，内膜不规则增厚，新生内膜可见大量梭形SMCs，排列紊乱，内膜和中膜有较多的泡沫细胞。4周时内膜较2周时进一步增厚，弹力纤维成分增多，见大量泡沫细胞，管腔狭窄更明显，甚至完全闭塞(图1A)。8周的病理变化与4周基本相同，但新生内膜SMCs数量减少，有较多的细胞外基质堆积。TP40 30 μg治疗2周组内膜增生被完全抑制，未见新生内膜，中膜结构清晰，无变性及坏死，管腔无狭窄。4周组内膜增生被明显抑制，仅轻度增生，新内膜见较多梭形SMCs，内膜和中膜有较多泡沫细胞，管腔无明显狭窄(图1B)。8周组内膜增生程度较4周组明显，新生内膜中SMCs数量减少，有较多细胞外基质堆积。
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2.3 计算机图像分析结果 TP40 30 μg能显著抑制兔颈总动脉损伤后的内膜增生(表1)。
3 讨 论
动脉球囊损伤后，中膜SMCs被激活，由收缩表型的静止状态转化为合成表型的增殖状态，进而迁
图1 4周时兔颈总动脉横切面显微摄片
Fig 1 The photomicrograph of histologic cross-section of rabbit common carotid artery
A：Control group; B: Treatment group (Elastin×100)
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表1 TGFα-PE40治疗后血管内膜面积、中膜面积及比值
Tab 1 Neointimal area, medial area and neointimal area/medial area after TGFα-PE40 treatment(n=24,
±s) GroupNeointimal area(A/mm2)
Medial area(A/mm2)
Neointimal area/medial area (%)
2 week Control group
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0.429 2±0.128 6
0.654 8±0.158 3
66.52±14.80
Treatment group
0.002 0±0.000 7**
0.547 7±0.090 2
0.43± 0.09**
4 week Control group
0.968 6±0.305 4
0.593 4±0.103 7
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152.05±26.51
Treatment group
0.068 6±0.020 6**
0.480 8±0.110 1
14.16± 2.46**
8 week Control group
1.072 0±0.432 8
0.634 7±0.140 3
163.92±37.49
Treatment group
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0.133 0±0.042 0**
0.509 6±0.111 2
28.44± 4.50**
*P<0.05, **P<0.01 vs control group
移至内膜下增殖，合成并分泌细胞外基质，造成损伤管腔的狭窄[2,3]。动脉损伤后24 h，其增殖的SMCs胞膜上开始高水平地表达表皮生长因子受体(EGFR)[4]。EGFR的高水平表达可能是EGFR基因扩增、重排或转录异常所致[5]。SMCs高水平表达的EGFR可成为抑制其增殖的导向攻击目标。
TGFα是一种转化细胞异常表达的多肽类生长因子，其结构与EGF有同源性，能与EGFR结合，介导细胞增殖效应或细胞表型可逆性转化。绿脓杆菌外毒素(PE)是一种多肽毒素，它通过和靶细胞表面PE受体的结合进入细胞，催化延伸因子2的ADP-核糖基化，阻止蛋白质合成而导致细胞死亡。PE分子由受体结合结构域、转位结构域和活性结构域3部分组成。如果将PE分子中与受体结合的结构域去除，则剩余的部分——PE40失去与PE受体结合进入细胞的能力[6]。用基因工程方法将TGFα cDNA顺序与PE40片段cDNA顺序连接，并插入表达型载体，构建成可表达的重组质粒，转化大肠杆菌后表达出有生理活性的TP40融合蛋白[7]。TP40具有与表达EGFR的靶细胞特异结合的能力，因而起着导向的作用；同时携带PE40进入细胞，高效地阻断细胞内蛋白质合成，导致细胞死亡。
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TP40适宜剂量的选择对治疗结果影响较大。TP40治疗后2周的结果显示：TP40 15 μg虽然能显著抑制内膜增生，但仍有少量新生内膜，提示用药剂量偏小；TP40 60 μg虽能完全抑制内膜的增生，但造成中膜大量SMCs的变性及坏死，提示用药剂量过大；TP40 30 μg既能完全抑制内膜的增生，又未造成血管壁的坏死，是本实验较适宜的用药剂量。
TP40对靶细胞蛋白质合成抑制作用的强度，依赖细胞表面EGFR的数量[5]。利用增殖期与静止期SMCs EGFR表达水平的差异，有可能选择合适的TP40浓度，达到对增殖期SMCs有效杀伤，而对静止期SMCs较小损害的目的。正常动脉因有内皮细胞(ECs)覆盖的屏障作用，且ECs与中膜SMCs均处于收缩表型的静止状态，两者EGFR的表达水平均较低，即使是TP40 60 μg对正常动脉仍未造成损伤。所以，TP40局部用药在抑制内膜增生的使用中是安全的(资料待发表)。本研究表明动脉球囊损伤后第24 h 1次性给药治疗，2周的疗效显著，4周和8周的结果虽然令人满意，但有内膜的轻度增生。若能在内皮细胞完全修复前多次给药，可望取得更理想的疗效。TP40对动脉损伤后内膜增生所具有的导向抑制作用，为PTCA后再狭窄的预防研究开辟了一个新的领域。
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参 考 文 献
1 Rozeman Y, Gilon D, Welber S，et al. Total coronary artery occlusion late after successful coronary angioplasty of moderately severe lesion:incidence and clinical manifestations. Cardiology,1994，85(3～4):222
2 Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993,362(6423):801
3 Casscells W. Migration of smooth muscle and endothelial cells:critical events in restenosis. Circulation, 1992，86(3):723
, 百拇医药
4 Pastore CJ, Isner JM, Bacha PA, et al. Epidermal growth factor receptor-targeted cytotoxin inhibits neointimal hyperplasia in vivo. Results of local versus systemic administration. Circ Res, 1995, 77(3):519
5 徐永华，彭素芬，江万里，等.TGFα-PE40的基因克隆、表达和对人癌细胞生长的抑制作用.实验生物学报，1993，26(3)：289
6 Fu YM, Mesri EA, Yu ZX，et al. Cytotoxic effects of vascular smooth muscle cells of the chimeric toxin, heparin binding TGF alpha-Pseudomonas exotoxin.Cardiovasc Res, 1993，27(9):1691
7 Epstein SE, Siegall CB, Biro S，et al. Cytotoxic effects of recombinant chimeric toxin on rapidly proliferating vascular smooth muscle cells.Circulation, 1991，84(2):778
(1997-07-15收稿，1997-11-08修回), 百拇医药