病理性瘢痕成纤维细胞Fas介导的死亡信号传导研究Ⅰ:Ca2+在Fas介导的死亡通道中的作用
作者：王向东 高建华 鲁峰 黎小间
单位：王向东(第一军医大学南方医院 药材科，广东 广州 510515)；高建华(第一军医大学南方医院 药材科，广东 广州 510515)；鲁峰(第一军医大学南方医院 整形外科，广东 广州 510515)；黎小间(第一军医大学南方医院 整形外科，广东 广州 510515)
关键词：瘢痕疙瘩；增生性瘢瓣； Fas单克隆抗体；钙
第一军医大学学报000417 摘要：目的 研究和比较增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞经Fas单抗(FasMcab)诱导产生凋亡的能力，同时探讨Ca2+在其相应死亡信号通道中的作用。方法 取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各6例，通过细胞培养6～8代后，以FasMcab为处理因素作用于增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞24 h。应用透射电镜证实凋亡现象的发生，流式细胞仪检测并比较两者凋亡率。同时，应用粘附式细胞仪检测FasMcab作用下胞内Ca2+的变化。结果 增生性瘢痕成纤维细胞在工作浓度以上的FasMcab作用下，发生明显的凋亡现象，其凋亡率随着单抗浓度的增高不断增高。瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度梯度下，均未发生明显凋亡，且各组间差异无显著意义。在FasMcab作用下，增生性瘢痕成纤维细胞内Ca2+显著增高而瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2+无变化。结论 Fas介导凋亡的异常可能是瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖-凋亡调控异常的细胞生物学机制之一，胞内Ca2+产生的障碍可能与其Fas介导凋亡的异常密切相关。
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中图分类号：R364.3 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0297-03
Death signal transduction mediated by Fas on fibroblasts derived from pathological scars Ⅰ: differences of Fas-induced apoptosis and responses of intracellular Ca2+ in fibroblasts derived from hypertrophic scar and keloid
WANG Xiang-dong
(Departments of PharmacyNanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
, 百拇医药
GAO Jian-hua, LU Feng, LI Xiao-jian
(Departments of Plastic Surgery, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective To explore the difference of Fas-induced apoptosis and investigate the responses of intercellular Ca2+ to FasMcab in fibroblasts derived from hypertrophic scar and keloid. Method Both of 6 samples of hypertrophic scars and keloids were collected. The means of cell culture was used, and only 6-8 passages of fibroblasts were selected for experiment. Fibroblasts derived from these samples were exposed to different concentrations of FasMcab for 24 h to investigate the Fas-induced apoptosis. With the help of the adherent cell analysis and sorting interactive laser coytometer (ACAS 570), the responses of intercellular Ca2+ was detected at the same time. Results FasMcab (Ig M) induced apoptosis of fibroblasts derived from the hypertropic scars , but no obvious apoptosis was detected in keloids-derived fibroblasts. Exposed to different concentrations of FasMcab, the intercellular Ca2+ rose prominently in hypertrophic scar-derived fibroblasts but no changes were seen in keloids-derived fibroblasts. Conclusion The abnormal Fas-induced apoptosis may be one of the important mechanisms of the unbalanced propagation and apoptosis. As an important messenger, the deficiency of the production of intracellular Ca2+ may be responsible for the abnormal apoptosis of keloid.
, 百拇医药
Key words：keloid; hypertrophic scar; FasMcab; calcium
瘢痕疙瘩是目前整形外科界一个最棘手的问题，临床表现为超过原伤口界限，呈蟹足样浸润生长，侵犯临近组织，自始自终难以退化且单纯手术切除后易复发等[1]。 随着细胞凋亡在各研究领域的进展，这种程序性细胞死亡在瘢痕机制研究领域也越来越受到重视。近年来研究发现，在肉芽组织转变为瘢痕组织的过程中，存在着大量的成纤维细胞凋亡，细胞凋亡异常可导致病理性瘢痕的发生[2～4]。同时，成纤维细胞增殖-凋亡的调控异常被证实可能直接导致瘢痕疙瘩的形成[5]。 FasR-Fas在调控细胞增殖和凋亡中所起的重要作用在众多研究领域中已得到广泛的重视[6、7]，而且Fas介导的凋亡还被认为是成纤维细胞内死亡信号传递的最主要通道[8]。本实验试图通过对其相应的信号传导系统的研究，探讨病理性瘢痕成纤维细胞增殖-凋亡失衡的细胞生物学机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
本实验所有瘢痕疙瘩和增生性瘢痕均取自南方医院整形外科手术患者，并经临床及病理诊断证实。瘢痕疙瘩患者6例，男女各3例，病变部位分别为耳垂及前胸；增生性瘢痕患者6例，男4例，女2例，病变部位分别位于足背和肘部。患者年龄在22～28岁之间。DMEM 培养液为美国Gibco公司产品，荧光染料碘化丙啶与Fluo-3-AM为美国Sigma公司产品，FasMcab(IgM)为美国Coulter公司产品，胎牛血清为美国Hyclone公司产品。
1.2 方法
1.2.1 成纤维细胞的培养 手术切取的瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织，在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成1 mm×1 mm×1 mm 左右的组织块置于培养瓶中。在体积分数为95%空气和5%二氧化碳、37 ℃、饱和湿度条件下培养6～8 h，使组织块牢固地粘附在瓶壁上。然后加入含15%胎牛血清的DMEM培养液适量，继续培养，3～4 d换液1次。2～3周后，原代细胞生长成单层时，用0.25% 胰蛋白酶消化后，按1:3的比例传代培养。此后每2～3 d换液1次，每4～5 d传代1次，实验用第6～8代细胞。
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1.2.2 透射电镜观察[9] 选优质琼脂糖，用蒸馏水配成浓度为2%的溶液，加热溶解后，取约6 ml加入10 ml的锥形离心管中，然后垂直放入一根锥形的玻璃棒，冰水溶解，待琼脂凝固后抽出棒心，4℃保存备用。各取1瓶处于指数生长期的细胞，加入FasMcab，使各瓶终浓度达到100 ng/ml，在95%空气和5%二氧化碳、37 ℃、饱和湿度条件下孵育24 h。用0.25%胰蛋白酶消化后加入离心管内，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入PBS混匀。将细胞悬液加入有琼脂空槽的离心管中， 800～1 000 r/min离心；取出离心管中的琼脂，尖刀切下细胞团块，将细胞团投入含2.5% 戊二醛的固定液中，4 ℃保存。PBS洗细胞团3次，1%锇酸后固定30～60 min。常规电镜样品制备程序，脱水、浸透、过锂、超薄切片、铀铅染色后，透射电镜下观察、照相。
1.2.3 流式细胞仪PI染色检测FasMcab诱导的病理性瘢痕成纤维细胞凋亡[10] 各取6瓶处于指数生长期的细胞，加入FasMcab，使各瓶终浓度分别达到0、1、10、100、500 ng/ml及1 μg/ml，在体积分数为95%空气和5%二氧化碳、37 ℃、饱和湿度条件下孵育24 h，0.25%胰蛋白酶消化后收集于离心管中，1 000 r/min离心5 min。PBS洗二遍，以70% 冰乙醇固定细胞12 h以上，PBS离心沉淀去除固定液，加入500 μl PI染液(含PI 100 μg/ml、 RNase 1 mg/ml)，37 ℃闭光孵育30 min，在Coulter EPICS Elite ESP流式细胞仪上进行细胞DNA含量分析，以区分正常细胞和凋亡细胞。
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1.2.4 FasMcab作用下成纤维细胞内Ca2+变化的粘附式细胞仪检测[10] 取处于指数生长期的细胞，用0.25% 的胰蛋白酶消化后，加入适量含15% 胎牛血清的DMEM培养液。吹打后，按每皿含细胞1×105的密度接种到Petri培养皿中。在95% 空气和5% 二氧化碳、37 ℃、饱和湿度条件下孵育8～10 h，使细胞完全贴壁并伸展呈梭形。将培养皿取出，室温下Hanks液漂洗3次。加入20 μmol/ml荧光染料Fluo-3-AM 80～100 μl标记胞内Ca2+，37 ℃避光孵育30～40 min。Hanks液漂洗3次，加入0.5 ml Hanks液后待检测。将含已染色细胞的培养皿置于ACAS570交互式激光细胞仪(美国Meridian公司)载物台上，先直观地扫描测定细胞内染料初始荧光强度，得到细胞图像。2～3 min后分别加入不同浓度梯度的FasMcab，观察胞内Ca2+随时间的变化，绘制各时间-荧光值曲线图。
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1.2.5 FasMcab作用下成纤维细胞内Ca2+变化的测定 根据时间-荧光值曲线所提供的各种类型细胞FasMcab作用后胞内荧光值变化的情况，计算在相同时间间隔内(0～15 min)，波峰(波谷)与作用点间荧光比值的差值。
1.2.6 统计学处理 所得数据用
±s表示，统计处理应用SPSS软件，采用方差检验和t检验进行比较分析。
2 结果
2.1 细胞形态学改变
增生性瘢痕成纤维细胞在100 ng/ml FasMcab作用下，通过透射电镜可以观察到细胞皱缩、染色质固缩边集等凋亡特征性形态学改变。
2.2 细胞凋亡率
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增生性瘢痕成纤维细胞在工作浓度(>10 ng/ml) 以上的FasMcab作用下，随浓度梯度的增高，其凋亡率不断增高；瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度梯度下，凋亡率无显著 差异。两者之间的差异具有统计学意义(表1)。
表1 FasMcab诱导的成纤维细胞的凋亡率(%,±s)
Tab. 1 Apoptosis of fibroblasts induced by FasMcab (%, Mean±SD)
0 ng/ml
1 ng/ml
10 ng/ml
100 ng/ml
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500 ng/ml
1μg/ml
Hypertrophic scar
4.1±0.3
5.9±0.7
17.1±3.6
25.6±7.1
33.8±9.8
47.5±12.0
Keloid
4.2±0.5
7.5±1.3*
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5.9±0.8*
5.7±1.6*
8.7±2.1*
6.7±0.9*
n=5000； * P< 0.01 vs hypertrophic scar
2.3 细胞内Ca2+变化
各有效浓度(≥10 ng/ml)FasMcab作用下，增生性瘢痕成纤维细胞内Ca2+ 显著升高；而瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2+无明显变化，两者之间的差异具有统计学意义(表2)。
表2 FasMcab作用下成纤维细胞内Ca2+的变化率(%，±s)
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Tab.2 The changes of Ca2+ within fibroblasts induced by FasMcab
(%, Mean±SD)
1 ng/ml
10 ng/ml
100 ng/ml
1 μg/ml
Hypertrophic scar
+2.1±0.8
+5.8±0.8
+16.2±1.9
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+18.2±3.2
Keloid
+1.2±0.4*
-1±0.3*
+2.2±0.6*
-3.1±1.1*
“+” means intracellular Ca 2+ increase； “-” means intracellular Ca2+ decrease； n=5000；* P< 0.01 vs hypertrophic scar
3 讨论
成纤维细胞被证实是创伤愈合、瘢痕形成、增生和挛缩的功能性细胞，其增殖-凋亡的异常直接导致瘢痕疙瘩的形成[2]，但目前仍缺乏导致这种异常的细胞生物学证据。随着细胞生物学和免疫学的进展，FasR-FasL系统在调控细胞增殖和凋亡中被证实起着重要作用[3～6、11] ，而且Fas介导的凋亡还被认为是介导死亡信号传递的最主要通道[8]。本实验结果发现瘢痕疙瘩成纤维细胞有别于增生性瘢痕成纤维细胞，在FasMcab作用下不能正常凋亡。这表明瘢痕疙瘩这种Fas介导的凋亡抗性是导致瘢痕疙瘩成纤维细胞异常增殖(高增殖-低凋亡)的细胞生物学机制之一。瘢痕疙瘩成纤维细胞对FasMcab诱导的凋亡产生抗性的具体原因目前尚不清楚。我们考虑主要可能与以下几个方面有关：(1) 相应的Fas受体不表达或低表达。(2) 其相应受体基因结构的缺陷导致受体无功能表达。(3) 外源性抑制蛋白(如Bcl-2蛋白等)的过度表达导致凋亡的阻断。(4) 相应的死亡信号递质(如Ca2+及氧自由基等)产生的障碍。
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信号通道的研究已成为目前生命科学领域研究的热点之一，关于Fas介导的死亡信号传导通道的研究也越来越受到重视。Schraven[12] 用Fas单抗刺激人B淋巴细胞，发现胞内Ca2+显著增高，并与细胞内的DNA裂解、细胞凋亡密切相关。我们的实验发现，在FasMcab作用下，增生性瘢痕成纤维细胞胞内Ca2+显著增高；瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2+无显著变化，且这种变化与细胞凋亡实验相一致。提示，Ca2+产生的不足可能直接导致Fas介导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常。至于导致瘢痕疙瘩内Ca2+产生阻断的原因目前仍不清楚，有待进一步研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870807)
作者简介：王向东(1964-)，男，河北廊坊人，1995年毕业于第一军医大学，主管技师，电话：85141888-87260
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参考文献：
[1] 汪良能，高学书. 整形外科学[M]. 北京：人民卫生出版社，1989.324-32.
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[3] Garbin S, Pittet B, Montandon D, et al. Covering by a flap induces apoptosis of granulation tissue fibroblasts and vascular cells[J]. Wound Repair Regener, 1996, 4(3):244-52.
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[4] Su Y, Arnold F, Cherry G, et al. Proliferation and apoptosis in chronic wounds[J]. Wound Repair Regener, 1996, 4 (2):141-50.
[5] Matsuoka LY, Uitto J, Wortsman J, et al. Ultrastrural characteristics of keloid fibroblasts[J]. Am J Dermatopathol, 1988, 10(4):505-20.
[6] Leithauser F, Dhein J, Mechtersheimer G, et al. Constitutive and induced expression of APO-1, a new member of the nerve growth factor /tumor necrosis factor receptor superfamily, in normal and neoplastic cells[J]. Lab Invest, 1993, 69(4):415-23.
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[7] Jelaska A, Korn JF. Anti-Fas induces apoptosis and proliferation in human dermal fibroblasts: differences between foreskin and adult fibroblasts[J]. J Cell Physiol, 1998, 175(1):19-29.
[8] Freiberg RA, Spencer DM, Choate KA, et al. Fas signal transduction triggers either proliferation or apoptosis in human fibroblasts[J]. J Invest Dermatol, 1997, 108(2):215-23.
[9] 张景强，朴英杰. 生物电子显微技术[M]. 广州:中山大学出版社, 1993.84-105.
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[10] 鲍永耀，雷国学. 细胞术[M]. 广州:第一军医大学科研处, 1997.16-7.
[11] 黎小间，高建华，鲁 峰. 病理性瘢痕成纤维细胞Fas受体及Bc1-2蛋白的表达[J]. 第一军医大学学报, 2000(3):231-2.
[12] Schraven B, Peter ME. APO-1(CD95)-mediated apoptosis in Jurkat cells does not involve src kinases or CD45[J]. FEBS Lett, 1995, 368(5): 491-4.
收稿日期：1999-06-22, 百拇医药
单位：王向东(第一军医大学南方医院 药材科，广东 广州 510515)；高建华(第一军医大学南方医院 药材科，广东 广州 510515)；鲁峰(第一军医大学南方医院 整形外科，广东 广州 510515)；黎小间(第一军医大学南方医院 整形外科，广东 广州 510515)
关键词：瘢痕疙瘩；增生性瘢瓣； Fas单克隆抗体；钙
第一军医大学学报000417 摘要：目的 研究和比较增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞经Fas单抗(FasMcab)诱导产生凋亡的能力，同时探讨Ca2+在其相应死亡信号通道中的作用。方法 取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各6例，通过细胞培养6～8代后，以FasMcab为处理因素作用于增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞24 h。应用透射电镜证实凋亡现象的发生，流式细胞仪检测并比较两者凋亡率。同时，应用粘附式细胞仪检测FasMcab作用下胞内Ca2+的变化。结果 增生性瘢痕成纤维细胞在工作浓度以上的FasMcab作用下，发生明显的凋亡现象，其凋亡率随着单抗浓度的增高不断增高。瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度梯度下，均未发生明显凋亡，且各组间差异无显著意义。在FasMcab作用下，增生性瘢痕成纤维细胞内Ca2+显著增高而瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2+无变化。结论 Fas介导凋亡的异常可能是瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖-凋亡调控异常的细胞生物学机制之一，胞内Ca2+产生的障碍可能与其Fas介导凋亡的异常密切相关。
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中图分类号：R364.3 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0297-03
Death signal transduction mediated by Fas on fibroblasts derived from pathological scars Ⅰ: differences of Fas-induced apoptosis and responses of intracellular Ca2+ in fibroblasts derived from hypertrophic scar and keloid
WANG Xiang-dong
(Departments of PharmacyNanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
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GAO Jian-hua, LU Feng, LI Xiao-jian
(Departments of Plastic Surgery, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective To explore the difference of Fas-induced apoptosis and investigate the responses of intercellular Ca2+ to FasMcab in fibroblasts derived from hypertrophic scar and keloid. Method Both of 6 samples of hypertrophic scars and keloids were collected. The means of cell culture was used, and only 6-8 passages of fibroblasts were selected for experiment. Fibroblasts derived from these samples were exposed to different concentrations of FasMcab for 24 h to investigate the Fas-induced apoptosis. With the help of the adherent cell analysis and sorting interactive laser coytometer (ACAS 570), the responses of intercellular Ca2+ was detected at the same time. Results FasMcab (Ig M) induced apoptosis of fibroblasts derived from the hypertropic scars , but no obvious apoptosis was detected in keloids-derived fibroblasts. Exposed to different concentrations of FasMcab, the intercellular Ca2+ rose prominently in hypertrophic scar-derived fibroblasts but no changes were seen in keloids-derived fibroblasts. Conclusion The abnormal Fas-induced apoptosis may be one of the important mechanisms of the unbalanced propagation and apoptosis. As an important messenger, the deficiency of the production of intracellular Ca2+ may be responsible for the abnormal apoptosis of keloid.
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Key words：keloid; hypertrophic scar; FasMcab; calcium
瘢痕疙瘩是目前整形外科界一个最棘手的问题，临床表现为超过原伤口界限，呈蟹足样浸润生长，侵犯临近组织，自始自终难以退化且单纯手术切除后易复发等[1]。 随着细胞凋亡在各研究领域的进展，这种程序性细胞死亡在瘢痕机制研究领域也越来越受到重视。近年来研究发现，在肉芽组织转变为瘢痕组织的过程中，存在着大量的成纤维细胞凋亡，细胞凋亡异常可导致病理性瘢痕的发生[2～4]。同时，成纤维细胞增殖-凋亡的调控异常被证实可能直接导致瘢痕疙瘩的形成[5]。 FasR-Fas在调控细胞增殖和凋亡中所起的重要作用在众多研究领域中已得到广泛的重视[6、7]，而且Fas介导的凋亡还被认为是成纤维细胞内死亡信号传递的最主要通道[8]。本实验试图通过对其相应的信号传导系统的研究，探讨病理性瘢痕成纤维细胞增殖-凋亡失衡的细胞生物学机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
本实验所有瘢痕疙瘩和增生性瘢痕均取自南方医院整形外科手术患者，并经临床及病理诊断证实。瘢痕疙瘩患者6例，男女各3例，病变部位分别为耳垂及前胸；增生性瘢痕患者6例，男4例，女2例，病变部位分别位于足背和肘部。患者年龄在22～28岁之间。DMEM 培养液为美国Gibco公司产品，荧光染料碘化丙啶与Fluo-3-AM为美国Sigma公司产品，FasMcab(IgM)为美国Coulter公司产品，胎牛血清为美国Hyclone公司产品。
1.2 方法
1.2.1 成纤维细胞的培养 手术切取的瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织，在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成1 mm×1 mm×1 mm 左右的组织块置于培养瓶中。在体积分数为95%空气和5%二氧化碳、37 ℃、饱和湿度条件下培养6～8 h，使组织块牢固地粘附在瓶壁上。然后加入含15%胎牛血清的DMEM培养液适量，继续培养，3～4 d换液1次。2～3周后，原代细胞生长成单层时，用0.25% 胰蛋白酶消化后，按1:3的比例传代培养。此后每2～3 d换液1次，每4～5 d传代1次，实验用第6～8代细胞。
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1.2.2 透射电镜观察[9] 选优质琼脂糖，用蒸馏水配成浓度为2%的溶液，加热溶解后，取约6 ml加入10 ml的锥形离心管中，然后垂直放入一根锥形的玻璃棒，冰水溶解，待琼脂凝固后抽出棒心，4℃保存备用。各取1瓶处于指数生长期的细胞，加入FasMcab，使各瓶终浓度达到100 ng/ml，在95%空气和5%二氧化碳、37 ℃、饱和湿度条件下孵育24 h。用0.25%胰蛋白酶消化后加入离心管内，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入PBS混匀。将细胞悬液加入有琼脂空槽的离心管中， 800～1 000 r/min离心；取出离心管中的琼脂，尖刀切下细胞团块，将细胞团投入含2.5% 戊二醛的固定液中，4 ℃保存。PBS洗细胞团3次，1%锇酸后固定30～60 min。常规电镜样品制备程序，脱水、浸透、过锂、超薄切片、铀铅染色后，透射电镜下观察、照相。
1.2.3 流式细胞仪PI染色检测FasMcab诱导的病理性瘢痕成纤维细胞凋亡[10] 各取6瓶处于指数生长期的细胞，加入FasMcab，使各瓶终浓度分别达到0、1、10、100、500 ng/ml及1 μg/ml，在体积分数为95%空气和5%二氧化碳、37 ℃、饱和湿度条件下孵育24 h，0.25%胰蛋白酶消化后收集于离心管中，1 000 r/min离心5 min。PBS洗二遍，以70% 冰乙醇固定细胞12 h以上，PBS离心沉淀去除固定液，加入500 μl PI染液(含PI 100 μg/ml、 RNase 1 mg/ml)，37 ℃闭光孵育30 min，在Coulter EPICS Elite ESP流式细胞仪上进行细胞DNA含量分析，以区分正常细胞和凋亡细胞。
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1.2.4 FasMcab作用下成纤维细胞内Ca2+变化的粘附式细胞仪检测[10] 取处于指数生长期的细胞，用0.25% 的胰蛋白酶消化后，加入适量含15% 胎牛血清的DMEM培养液。吹打后，按每皿含细胞1×105的密度接种到Petri培养皿中。在95% 空气和5% 二氧化碳、37 ℃、饱和湿度条件下孵育8～10 h，使细胞完全贴壁并伸展呈梭形。将培养皿取出，室温下Hanks液漂洗3次。加入20 μmol/ml荧光染料Fluo-3-AM 80～100 μl标记胞内Ca2+，37 ℃避光孵育30～40 min。Hanks液漂洗3次，加入0.5 ml Hanks液后待检测。将含已染色细胞的培养皿置于ACAS570交互式激光细胞仪(美国Meridian公司)载物台上，先直观地扫描测定细胞内染料初始荧光强度，得到细胞图像。2～3 min后分别加入不同浓度梯度的FasMcab，观察胞内Ca2+随时间的变化，绘制各时间-荧光值曲线图。
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1.2.5 FasMcab作用下成纤维细胞内Ca2+变化的测定 根据时间-荧光值曲线所提供的各种类型细胞FasMcab作用后胞内荧光值变化的情况，计算在相同时间间隔内(0～15 min)，波峰(波谷)与作用点间荧光比值的差值。
1.2.6 统计学处理 所得数据用
±s表示，统计处理应用SPSS软件，采用方差检验和t检验进行比较分析。2 结果
2.1 细胞形态学改变
增生性瘢痕成纤维细胞在100 ng/ml FasMcab作用下，通过透射电镜可以观察到细胞皱缩、染色质固缩边集等凋亡特征性形态学改变。
2.2 细胞凋亡率
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增生性瘢痕成纤维细胞在工作浓度(>10 ng/ml) 以上的FasMcab作用下，随浓度梯度的增高，其凋亡率不断增高；瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度梯度下，凋亡率无显著 差异。两者之间的差异具有统计学意义(表1)。
表1 FasMcab诱导的成纤维细胞的凋亡率(%,
±s)Tab. 1 Apoptosis of fibroblasts induced by FasMcab (%, Mean±SD)
0 ng/ml
1 ng/ml
10 ng/ml
100 ng/ml
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500 ng/ml
1μg/ml
Hypertrophic scar
4.1±0.3
5.9±0.7
17.1±3.6
25.6±7.1
33.8±9.8
47.5±12.0
Keloid
4.2±0.5
7.5±1.3*
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5.9±0.8*
5.7±1.6*
8.7±2.1*
6.7±0.9*
n=5000； * P< 0.01 vs hypertrophic scar
2.3 细胞内Ca2+变化
各有效浓度(≥10 ng/ml)FasMcab作用下，增生性瘢痕成纤维细胞内Ca2+ 显著升高；而瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2+无明显变化，两者之间的差异具有统计学意义(表2)。
表2 FasMcab作用下成纤维细胞内Ca2+的变化率(%，
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Tab.2 The changes of Ca2+ within fibroblasts induced by FasMcab
(%, Mean±SD)
1 ng/ml
10 ng/ml
100 ng/ml
1 μg/ml
Hypertrophic scar
+2.1±0.8
+5.8±0.8
+16.2±1.9
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+18.2±3.2
Keloid
+1.2±0.4*
-1±0.3*
+2.2±0.6*
-3.1±1.1*
“+” means intracellular Ca 2+ increase； “-” means intracellular Ca2+ decrease； n=5000；* P< 0.01 vs hypertrophic scar
3 讨论
成纤维细胞被证实是创伤愈合、瘢痕形成、增生和挛缩的功能性细胞，其增殖-凋亡的异常直接导致瘢痕疙瘩的形成[2]，但目前仍缺乏导致这种异常的细胞生物学证据。随着细胞生物学和免疫学的进展，FasR-FasL系统在调控细胞增殖和凋亡中被证实起着重要作用[3～6、11] ，而且Fas介导的凋亡还被认为是介导死亡信号传递的最主要通道[8]。本实验结果发现瘢痕疙瘩成纤维细胞有别于增生性瘢痕成纤维细胞，在FasMcab作用下不能正常凋亡。这表明瘢痕疙瘩这种Fas介导的凋亡抗性是导致瘢痕疙瘩成纤维细胞异常增殖(高增殖-低凋亡)的细胞生物学机制之一。瘢痕疙瘩成纤维细胞对FasMcab诱导的凋亡产生抗性的具体原因目前尚不清楚。我们考虑主要可能与以下几个方面有关：(1) 相应的Fas受体不表达或低表达。(2) 其相应受体基因结构的缺陷导致受体无功能表达。(3) 外源性抑制蛋白(如Bcl-2蛋白等)的过度表达导致凋亡的阻断。(4) 相应的死亡信号递质(如Ca2+及氧自由基等)产生的障碍。
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信号通道的研究已成为目前生命科学领域研究的热点之一，关于Fas介导的死亡信号传导通道的研究也越来越受到重视。Schraven[12] 用Fas单抗刺激人B淋巴细胞，发现胞内Ca2+显著增高，并与细胞内的DNA裂解、细胞凋亡密切相关。我们的实验发现，在FasMcab作用下，增生性瘢痕成纤维细胞胞内Ca2+显著增高；瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2+无显著变化，且这种变化与细胞凋亡实验相一致。提示，Ca2+产生的不足可能直接导致Fas介导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常。至于导致瘢痕疙瘩内Ca2+产生阻断的原因目前仍不清楚，有待进一步研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870807)
作者简介：王向东(1964-)，男，河北廊坊人，1995年毕业于第一军医大学，主管技师，电话：85141888-87260
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收稿日期：1999-06-22, 百拇医药