PKC信号传导通路在缺氧心肌细胞表达VEGF中的作用
作者：晋军 黄岚 李红 向常青
单位：晋军(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；黄岚(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；李红(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；向常青(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)
关键词：血管内皮生长因子；蛋白激酶C；心肌细胞；缺氧
第三军医大学学报000322
提 要 目的：明确缺氧对心肌细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响及蛋白激酶C(PKC)信号传导通路在其中的作用。方法：将原代培养大鼠心肌细胞模型分组：1正常缺氧4组：A组正常对照；B组缺氧6 h；C组缺氧12 h；D组缺氧24 h。2PKC激动剂4组：A组缺氧24 h对照；B组加入PMA 10 ng/ml缺氧24 h；C组加入PMA 100 ng/ml缺氧24 h；D组加入PMA 1 000 ng/ml缺氧24 h。3PKC抑制剂2组：A组缺氧24 h对照；B组加入Chelerythrine 10 mmol/L缺氧24 h。免疫组化方法检测各组心肌细胞中VEGF的表达，经计算机图像处理，定量分析。结果：缺氧刺激心肌细胞VEGF表达上调，PMA与Chelerythrine分别增强及减弱VEGF在缺氧心肌细胞中的表达。结论：缺氧是心肌细胞表达VEGF的强烈刺激因素之一。缺氧诱导VEGF在心肌细胞中的表达，其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的。
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中图法分类号 R322.11;R392.13;R845.22 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)03-0275-03
Study of the role of PKC signaling pathway in VEGF expression in cardiac myocytes under hypoxia in rats
JIN Jun, HUANG Lan, LI Hong, XIANG Chang-qing
(Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
Abstract Objective: To study the effects of hypoxia on the expression of vascular and endothelial growth factor (VEGF) in cardiac myocytes in rats and the role of protein kinase C (PKC) signal transduction pathway in this event. Methods: The primary culture of the cardiac myocytes of rats was used. The effects of hypoxia were observed after the cardiac myocytes were cultured under hypoxia for 6, 12 and 24 hours. The role of PKC was determined after different concentrations of PMA (a PKC activator) or chelerythrine (a PKC inhibitor) were added to the medium of cardiac myocytes and cultured under hypoxia for 24 hours. VEGF protein was determined with immunohistochemical assay and image processing and quantitative analysis were done with a computer. Results: The expression of VEGF in the cardiac myocytes of rats increased after culture under hypoxia (P< 0.01) and after the administration of PMA (P< .01) and decreased after the treatment of chelerythrine (P< 0.01). Conclusion: Hypoxia is a powerful factor to increase the expression of VEGF in cardiac myocytes of rats and the activation of PKC is an essential component of the signal transduction pathway to increase the expression of VEGF in the cardiac myocytes.
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Key words vascular endothelial growth factor; protein kinase C; cardiac myocyte; hypoxia
血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种分子量为46×103的分泌性糖蛋白，1989年被分离纯化[1]，被认为是一种肝素结合分子，与其受体结合后能特异地作用于血管内皮细胞，强烈刺激其增殖，促进侧支血管形成， 并对缺血心肌具有保护作用[2]。而缺血缺氧作为一种损伤因素是否能够引起心肌分泌VEGF增加从而启动心肌自我保护机制以及在此过程中的信号传导机制还不完全清楚。本实验旨在探讨PKC通路在缺氧诱导心肌细胞VEGF表达中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
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新生Wistar乳大鼠(3 d)。原代乳鼠心肌细胞的培养，参考Simpson等[3]的方法，分离心室肌，去掉心外膜和大血管，剪碎心室肌，0.1%胰蛋白酶37°C消化5～10 min。将收集的细胞悬液用100 μm孔径的尼龙滤网过滤并离心(800转10 min)，弃上清液，加入M199培养基悬浮分散细胞，接种到100 mm培养皿中，送入培养箱(5%CO295%空气，37°C)培养。60 min后，吸出尚未贴壁的细胞悬液，倒置显微镜观察，可见单个细胞或成团细胞呈现不同频率的自发搏动(50～160次/min)。
1.2 心肌细胞缺氧模型
取出原代培养5 d的心肌细胞，更换为无血清培养液，每一培养皿为一观察单位，将实验组放入缺氧培养罐中，持续通入5%CO2-95%N2混合气体(5 L/min)，多次抽取罐内气体作血气分析，至PO2为(6.5±0.4)mmHg，37°C培养24 h。
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1.3 模型分组
①正常缺氧分4组：A组正常对照；B组缺氧6 h；C组缺氧12 h；D组缺氧24 h。②PKC激动剂4组：A组缺氧24 h对照；B组加入PMA 100 ng/ml缺氧24 h；C组加入PMA 10 ng/ml缺氧24 h；D组加入PMA 1 000 ng/ml缺氧24 h。③PKC抑制剂2组：A组缺氧24 h对照；B组加入Chelerythrine 10 mmol/L缺氧24 h。
1.4 免疫组化测定VEGF表达
心肌细胞经PBS冲洗后，以冷丙酮固定15 min，按SP免疫组化试剂盒使用方法检测，DAB显色，中心树脂封片。
1.5 统计学处理
图像分析软件系统图像处理定量(灰度值与阳性强度呈反比)，计量数据均以
±s表示，组间比较用t检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 缺氧对心肌细胞VEGF表达的影响
缺氧6、12、24 h培养的大鼠心肌细胞(B、C、D组)与常氧条件下培养的心肌细胞(A组)相比较，其VEGF蛋白表达经图像分析处理定量，前者明显高于后者(27.286±0.756、25.190±0.663、23.571±0.957 vs 31.381±0.912 P<0.01)，且B、C、D组间比较差异显著(27.286±0.756 vs 25.190±0.663 vs 23.571±0.957)。表1说明在缺氧条件下心肌VEGF表达增强，且随缺氧时间延长而增加，两者存在正相关趋势。
表1 缺氧对VEGF表达的影响(±s)
Tab1 The effect of hypoxia on the expression of VEGF(±s) Group
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VEGF expression(Grey degree value)
A
31.381±0.912
B
27.286±0.756*
C
25.190±0.663*△
D
23.571±0.957*△＃
*：P<0.01 vs A；△：P<0.01 vs B；
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＃：P<0.01 vs C
2.2 PKC激动剂与抑制剂对缺氧时心肌细胞VEGF表达的影响
PMA加入组(B、C、D组)心肌细胞在缺氧培养24 h后，其VEGF表达较A组(单纯缺氧)升高(21.381±1.615、19.476±1.152、17.381±1.508 vs 23.571±0.957 P< 0.01)，且随PMA剂量增加而增加。Chelerythrine加入组心肌细胞VEGF表达量降低(27.619±0.731 vs 23.571±0.957, P< 0.01)，见表2。
表2 PKC活性剂对VEGF表达的影响(±s)
Tab2 the effect of PKC activator on the expression of VEGF(±s) Group
, 百拇医药
VEGF expression(Grey degree value)
PMA
Cherythrine
A
23.571±0.597
23.571±0.597
B
21.381±1.651*
27.619±0.731*
C
19.476±1.152*△
, 百拇医药
D
17.381±1.508*△＃
*：P<0.01 vs A；△：P<0.01 vs B；
＃：P<0.01 vs C
3 讨论
心肌组织需氧与供氧的不平衡，是冠心病最基本的病理生理基础，由此引发一系列的临床病状，如心绞痛、心肌梗塞等。已经发现，组织缺血、缺氧会导致新生血管的增多，以增加血流量，提高缺血组织的氧供，如：高原生活的人群、动物，其肺毛细血管密度增加，增强了氧的摄取量。这一过程可以看做是机体在外界环境刺激下的一种自我保护的反馈性调节反应。VEGF作为一种内皮细胞的有丝分裂原和促血管形成因子，直接特异地作用于血管内皮细胞，引起内皮细胞的增殖，在新生血管生成过程中起着“扳机”样作用。因而有理由推测VEGF也参与了急性心肌缺血、缺氧时的血管再生过程。本实验在培养心肌细胞缺氧模型中应用免疫组化方法探测缺氧对心肌细胞产生VEGF的影响。发现VEGF在心肌细胞中的表达，缺氧组较对照组显著升高(27.868±0.756、25.190±0.663、23.571±0.597 vs 31.381±0.912 P<0.01)，在缺氧6、12、24 h不同时段，VEGF的产生随时间延长而增加，证实缺氧是心肌细胞产生VEGF的强烈刺激因素之一，是机体在外界环境影响下自身反馈性的保护反应。缺氧反馈性地刺激VEGF产生增加，而VEGF与其受体结合后，产生一系列的生物效应，最终促进内皮细胞的有丝分裂，毛细血管生成增多，心肌侧支循环增加，其意义在于增加梗塞缺血区心肌的血液供应，挽救濒死心肌。
, 百拇医药
Mukhopadhy等[4]的研究显示：人内皮细胞在缺氧条件下产生VEGF是通过酪氨酸激酶途径传导的，Src家族成员的活化，可激活Raf-lk，从而启动Raf-lk介导的细胞内信号传导通路。更多的研究证实，缺氧诱导VEGF的表达还存在其它途径，Takagi等[5]证实：缺氧诱导视网膜微血管细胞产生VEGF，是由腺苷的释放以及腺苷激活cAMP依赖的蛋白激酶A所介导的。此外，据报道：在缺氧诱导VEGF表达的信号传导中也有Ca2+离子流的参与[6]。蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)参与了体内多种物质的生物合成，是重要的信号传导介质。本实验应用PKC激动剂PMA及PKC抑制剂Chelerythrine探讨PKC通路在心肌细胞缺氧产生VEGF中的作用。结果显示：PMA刺激组(B、C、D组)，其VEGF表达量与缺氧对照组A组相比较，均有非常显著差异(P<0.01)，且呈剂量相关趋势。而PKC抑制剂Chelerythrine组VEGF表达量与缺氧对照组相比降低(P<0.01)。说明在缺氧状态下，PMA促进心肌细胞分泌产生VEGF，而PKC抑制剂则减弱了此作用，但未完全阻断此过程，由此说明：缺氧诱导大鼠心肌细胞分泌产生VEGF蛋白，其信号传导部分是通过PKC通路完成的。对于其它信号传导通路的存在尚有待进一步证实。
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作者简介：晋军(1969.09)，男，山西省太原市人，博士研究生，主治医师，主要从事缺血性心脏病方面的研究，发表论文8篇。
参考文献
[1] Hahimoto E, Teruhiko O, Takaski N, et al. Rapid induction of vascular endothelial growth factor expression by transient ischemia in rat heart[J]. Am J Physiol, 1994, 267(4):H1 948-H1 954.
[2] Banai S, Jaklitsh M T, Shou M, et al. Angiongenic induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by VEGF in dogs[J]. Circulation,1994,89(5):2 183-2 189.
, http://www.100md.com
[3] Simpson P, Savion S. Differentiation of rat myocytes in single cell culture with and without proliferating nonmyocardial cells[J]. Circ Res,1982,50(1):101-116.
[4] Mukhopadhy D, Tsiokas L, Zhou X M, et al. Hypoxia in duction of human endothelial cell browth factor expression through cSrc activation[J]. Nature,1995,375(2):577-581.
[5] Takagi H, King G L, Robinson G S, et al. Adenosine medited hypoxia induction of vascular endothelial growth factor in retinal microvascular endothelial cells[J]. Inv Ophtal Vis Sci,1996,37(5):2 165-2 176.
[6] Claffy K, Wilkison W O, Spiegelman B M. Vascular-en dothelilal growth factor regulation by cell differentiation and activated second messenger pathways[J]. J Biol Chem,1992,267(16):16 317-16 322.
收稿日期：1999-05-25；修回日期：2000-01-11, 百拇医药
单位：晋军(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；黄岚(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；李红(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；向常青(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)
关键词：血管内皮生长因子；蛋白激酶C；心肌细胞；缺氧
第三军医大学学报000322
提 要 目的：明确缺氧对心肌细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响及蛋白激酶C(PKC)信号传导通路在其中的作用。方法：将原代培养大鼠心肌细胞模型分组：1正常缺氧4组：A组正常对照；B组缺氧6 h；C组缺氧12 h；D组缺氧24 h。2PKC激动剂4组：A组缺氧24 h对照；B组加入PMA 10 ng/ml缺氧24 h；C组加入PMA 100 ng/ml缺氧24 h；D组加入PMA 1 000 ng/ml缺氧24 h。3PKC抑制剂2组：A组缺氧24 h对照；B组加入Chelerythrine 10 mmol/L缺氧24 h。免疫组化方法检测各组心肌细胞中VEGF的表达，经计算机图像处理，定量分析。结果：缺氧刺激心肌细胞VEGF表达上调，PMA与Chelerythrine分别增强及减弱VEGF在缺氧心肌细胞中的表达。结论：缺氧是心肌细胞表达VEGF的强烈刺激因素之一。缺氧诱导VEGF在心肌细胞中的表达，其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R322.11;R392.13;R845.22 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)03-0275-03
Study of the role of PKC signaling pathway in VEGF expression in cardiac myocytes under hypoxia in rats
JIN Jun, HUANG Lan, LI Hong, XIANG Chang-qing
(Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
Abstract Objective: To study the effects of hypoxia on the expression of vascular and endothelial growth factor (VEGF) in cardiac myocytes in rats and the role of protein kinase C (PKC) signal transduction pathway in this event. Methods: The primary culture of the cardiac myocytes of rats was used. The effects of hypoxia were observed after the cardiac myocytes were cultured under hypoxia for 6, 12 and 24 hours. The role of PKC was determined after different concentrations of PMA (a PKC activator) or chelerythrine (a PKC inhibitor) were added to the medium of cardiac myocytes and cultured under hypoxia for 24 hours. VEGF protein was determined with immunohistochemical assay and image processing and quantitative analysis were done with a computer. Results: The expression of VEGF in the cardiac myocytes of rats increased after culture under hypoxia (P< 0.01) and after the administration of PMA (P< .01) and decreased after the treatment of chelerythrine (P< 0.01). Conclusion: Hypoxia is a powerful factor to increase the expression of VEGF in cardiac myocytes of rats and the activation of PKC is an essential component of the signal transduction pathway to increase the expression of VEGF in the cardiac myocytes.
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Key words vascular endothelial growth factor; protein kinase C; cardiac myocyte; hypoxia
血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种分子量为46×103的分泌性糖蛋白，1989年被分离纯化[1]，被认为是一种肝素结合分子，与其受体结合后能特异地作用于血管内皮细胞，强烈刺激其增殖，促进侧支血管形成， 并对缺血心肌具有保护作用[2]。而缺血缺氧作为一种损伤因素是否能够引起心肌分泌VEGF增加从而启动心肌自我保护机制以及在此过程中的信号传导机制还不完全清楚。本实验旨在探讨PKC通路在缺氧诱导心肌细胞VEGF表达中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
新生Wistar乳大鼠(3 d)。原代乳鼠心肌细胞的培养，参考Simpson等[3]的方法，分离心室肌，去掉心外膜和大血管，剪碎心室肌，0.1%胰蛋白酶37°C消化5～10 min。将收集的细胞悬液用100 μm孔径的尼龙滤网过滤并离心(800转10 min)，弃上清液，加入M199培养基悬浮分散细胞，接种到100 mm培养皿中，送入培养箱(5%CO295%空气，37°C)培养。60 min后，吸出尚未贴壁的细胞悬液，倒置显微镜观察，可见单个细胞或成团细胞呈现不同频率的自发搏动(50～160次/min)。
1.2 心肌细胞缺氧模型
取出原代培养5 d的心肌细胞，更换为无血清培养液，每一培养皿为一观察单位，将实验组放入缺氧培养罐中，持续通入5%CO2-95%N2混合气体(5 L/min)，多次抽取罐内气体作血气分析，至PO2为(6.5±0.4)mmHg，37°C培养24 h。
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1.3 模型分组
①正常缺氧分4组：A组正常对照；B组缺氧6 h；C组缺氧12 h；D组缺氧24 h。②PKC激动剂4组：A组缺氧24 h对照；B组加入PMA 100 ng/ml缺氧24 h；C组加入PMA 10 ng/ml缺氧24 h；D组加入PMA 1 000 ng/ml缺氧24 h。③PKC抑制剂2组：A组缺氧24 h对照；B组加入Chelerythrine 10 mmol/L缺氧24 h。
1.4 免疫组化测定VEGF表达
心肌细胞经PBS冲洗后，以冷丙酮固定15 min，按SP免疫组化试剂盒使用方法检测，DAB显色，中心树脂封片。
1.5 统计学处理
图像分析软件系统图像处理定量(灰度值与阳性强度呈反比)，计量数据均以
±s表示，组间比较用t检验。, 百拇医药
2 结果
2.1 缺氧对心肌细胞VEGF表达的影响
缺氧6、12、24 h培养的大鼠心肌细胞(B、C、D组)与常氧条件下培养的心肌细胞(A组)相比较，其VEGF蛋白表达经图像分析处理定量，前者明显高于后者(27.286±0.756、25.190±0.663、23.571±0.957 vs 31.381±0.912 P<0.01)，且B、C、D组间比较差异显著(27.286±0.756 vs 25.190±0.663 vs 23.571±0.957)。表1说明在缺氧条件下心肌VEGF表达增强，且随缺氧时间延长而增加，两者存在正相关趋势。
表1 缺氧对VEGF表达的影响(
±s)Tab1 The effect of hypoxia on the expression of VEGF(
±s) Group, http://www.100md.com
VEGF expression(Grey degree value)
A
31.381±0.912
B
27.286±0.756*
C
25.190±0.663*△
D
23.571±0.957*△＃
*：P<0.01 vs A；△：P<0.01 vs B；
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＃：P<0.01 vs C
2.2 PKC激动剂与抑制剂对缺氧时心肌细胞VEGF表达的影响
PMA加入组(B、C、D组)心肌细胞在缺氧培养24 h后，其VEGF表达较A组(单纯缺氧)升高(21.381±1.615、19.476±1.152、17.381±1.508 vs 23.571±0.957 P< 0.01)，且随PMA剂量增加而增加。Chelerythrine加入组心肌细胞VEGF表达量降低(27.619±0.731 vs 23.571±0.957, P< 0.01)，见表2。
表2 PKC活性剂对VEGF表达的影响(
±s)Tab2 the effect of PKC activator on the expression of VEGF(
±s) Group, 百拇医药
VEGF expression(Grey degree value)
PMA
Cherythrine
A
23.571±0.597
23.571±0.597
B
21.381±1.651*
27.619±0.731*
C
19.476±1.152*△
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D
17.381±1.508*△＃
*：P<0.01 vs A；△：P<0.01 vs B；
＃：P<0.01 vs C
3 讨论
心肌组织需氧与供氧的不平衡，是冠心病最基本的病理生理基础，由此引发一系列的临床病状，如心绞痛、心肌梗塞等。已经发现，组织缺血、缺氧会导致新生血管的增多，以增加血流量，提高缺血组织的氧供，如：高原生活的人群、动物，其肺毛细血管密度增加，增强了氧的摄取量。这一过程可以看做是机体在外界环境刺激下的一种自我保护的反馈性调节反应。VEGF作为一种内皮细胞的有丝分裂原和促血管形成因子，直接特异地作用于血管内皮细胞，引起内皮细胞的增殖，在新生血管生成过程中起着“扳机”样作用。因而有理由推测VEGF也参与了急性心肌缺血、缺氧时的血管再生过程。本实验在培养心肌细胞缺氧模型中应用免疫组化方法探测缺氧对心肌细胞产生VEGF的影响。发现VEGF在心肌细胞中的表达，缺氧组较对照组显著升高(27.868±0.756、25.190±0.663、23.571±0.597 vs 31.381±0.912 P<0.01)，在缺氧6、12、24 h不同时段，VEGF的产生随时间延长而增加，证实缺氧是心肌细胞产生VEGF的强烈刺激因素之一，是机体在外界环境影响下自身反馈性的保护反应。缺氧反馈性地刺激VEGF产生增加，而VEGF与其受体结合后，产生一系列的生物效应，最终促进内皮细胞的有丝分裂，毛细血管生成增多，心肌侧支循环增加，其意义在于增加梗塞缺血区心肌的血液供应，挽救濒死心肌。
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Mukhopadhy等[4]的研究显示：人内皮细胞在缺氧条件下产生VEGF是通过酪氨酸激酶途径传导的，Src家族成员的活化，可激活Raf-lk，从而启动Raf-lk介导的细胞内信号传导通路。更多的研究证实，缺氧诱导VEGF的表达还存在其它途径，Takagi等[5]证实：缺氧诱导视网膜微血管细胞产生VEGF，是由腺苷的释放以及腺苷激活cAMP依赖的蛋白激酶A所介导的。此外，据报道：在缺氧诱导VEGF表达的信号传导中也有Ca2+离子流的参与[6]。蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)参与了体内多种物质的生物合成，是重要的信号传导介质。本实验应用PKC激动剂PMA及PKC抑制剂Chelerythrine探讨PKC通路在心肌细胞缺氧产生VEGF中的作用。结果显示：PMA刺激组(B、C、D组)，其VEGF表达量与缺氧对照组A组相比较，均有非常显著差异(P<0.01)，且呈剂量相关趋势。而PKC抑制剂Chelerythrine组VEGF表达量与缺氧对照组相比降低(P<0.01)。说明在缺氧状态下，PMA促进心肌细胞分泌产生VEGF，而PKC抑制剂则减弱了此作用，但未完全阻断此过程，由此说明：缺氧诱导大鼠心肌细胞分泌产生VEGF蛋白，其信号传导部分是通过PKC通路完成的。对于其它信号传导通路的存在尚有待进一步证实。
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作者简介：晋军(1969.09)，男，山西省太原市人，博士研究生，主治医师，主要从事缺血性心脏病方面的研究，发表论文8篇。
参考文献
[1] Hahimoto E, Teruhiko O, Takaski N, et al. Rapid induction of vascular endothelial growth factor expression by transient ischemia in rat heart[J]. Am J Physiol, 1994, 267(4):H1 948-H1 954.
[2] Banai S, Jaklitsh M T, Shou M, et al. Angiongenic induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by VEGF in dogs[J]. Circulation,1994,89(5):2 183-2 189.
, http://www.100md.com
[3] Simpson P, Savion S. Differentiation of rat myocytes in single cell culture with and without proliferating nonmyocardial cells[J]. Circ Res,1982,50(1):101-116.
[4] Mukhopadhy D, Tsiokas L, Zhou X M, et al. Hypoxia in duction of human endothelial cell browth factor expression through cSrc activation[J]. Nature,1995,375(2):577-581.
[5] Takagi H, King G L, Robinson G S, et al. Adenosine medited hypoxia induction of vascular endothelial growth factor in retinal microvascular endothelial cells[J]. Inv Ophtal Vis Sci,1996,37(5):2 165-2 176.
[6] Claffy K, Wilkison W O, Spiegelman B M. Vascular-en dothelilal growth factor regulation by cell differentiation and activated second messenger pathways[J]. J Biol Chem,1992,267(16):16 317-16 322.
收稿日期：1999-05-25；修回日期：2000-01-11, 百拇医药