gr-1启动子序列调控造血生长因子表达的实验研究
作者：杜楠 裴雪涛 罗成基 李梁 邹仲敏 冯凯 白慈贤 孙兵
单位：杜楠(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研 究所，重庆 400038)；裴雪涛(军事医学科学院二所实验血液学研究室，北京 100850)；罗成基(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研 究所，重庆 400038)；李梁(军事医学科学院二所实验血液学研究室，北京 100850)；邹仲敏(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研 究所，重庆 400038)
关键词：辐射诱导基因；造血生长因子；基因治疗；辐射；骨髓基质 细胞
第三军医大学学报000403 提 要： 目的 探索辐射诱导基因调控元件启动的造血 生长因子表达及其对造血恢复的作用。方法 该实验将携带Egr-1调控 序列启动的FLT3配基(FL)和GM-CSF双顺反子表达载体(Egr-FG)导入骨髓基质细胞系HFCL( 称为HFCL/EFG)。采用RT-PCR、ELISA及细胞增殖法观察FL和GM-CSF cDNA在转染细胞中的 表达及保护造血作用。结果 构建了Egr-1调控序列启动的双顺反子 基因表达载体(Egr-FG)；在HFCL/EFG细胞中证实有外源性FL和GM-CSF基因的整合和表达， 在辐照后16 h的HFCL/EFG细胞培养上清液中，FL和GM-CSF含量较照射前明显增高( P< 0. 01)；同时证实辐射后HFCL/EFG培养上清液对造血祖细胞有明显扩增作用；共培养的骨髓有 核细胞和HFCL/EFG经照射后7 d计数非粘附细胞，HFCL/EFG组较对照组明显增加(P < 0.05 )。结论 辐射诱导基因Egr-1调控序列启动的造血生长因子基因表达载 体在辐射后表达明显增高，在体外对辐射后的造血细胞具有保护作用。
, 百拇医药
中图法分类号： R394.3 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0310-04
Study of the expression of hematopoietic growth factors regulated with Egr-1 promotor sequence
DU Nan, PEI Xue-tao, LUO Cheng-ji, LI Liang, ZHOU Zhong-min, FENG Ka i, BAI Ci-xian, SUN Bin
(Department of Radiation Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
, 百拇医药
Abstract： Objective To study the effects of radiation induci ble gene on the regulation of the expression of hematopoietic growth factor and the restoration of hematopoiesis.Methods Human GM-CSF cDNA and F LT3 Ligand(FL) were linked together with IRES and inserted into the expression v ector pCI-Egr-1 which was constructed with the substitution of CMV promotor in pCIneo with Egr-1 promotor (Egr-FG). The vector was transferred into human bo ne marrow stromal cell line HFCL with lipofectinTM. The mRNA expression of the target gene in the cells were identified with RT-PCR. The amount of FL and GM-CSF in the supernatant of HFCL-EFG cell culture was determined with ELISA. CD34+ cells isolated with MACS were cultured in the medium containing the sup ernatant of HFCL/EFG to observe its effect on the proliferation of CD34+ cells .Results The gene expression vector (Egr-FG) initiated with Egr -1 regulation sequence was successfully constructed. It was confirmed that ther e were expression of exogenous FL and GM-CSF in HFCL-EFG cells. After 16 hours of 60Co irradiation, the amount of FL and GM-CSF in the serum-free supernatant of HFCL/EFG cell culture was increased respectively(P< 0.001).It was found that after irradiation, the supernatant of HFCL/EFG culture significan tly increased its effect on the proliferation of CD34+ cells.Conclusion These in vitro data provide an experimental basis for th e in vivo use of gene therapy of hematopoietic growth foctor gene regulated by Egr-1 t o protect hematopoiesis from ionizing radiation.
, 百拇医药
Key words： radiation inducible gene; hematopoietic gro wth factor; gene therapy; radiation; bone marrow stromal cell▲
电离辐射可迅速诱导细胞中早期生长反应(Early growth resp onse,Egr-1)基因的表达，Egr-1基因启动子含有6个CArG元件，电离辐射通过 细胞产生活性氧自由基作用于CArG元件，诱导Egr-1的表达。最近Weichselbaum等[1 ]将该启动子诱导的基因疗法与放射治疗结合起来(Gene-radiatherapy)，证明用特异的 辐射诱导元件Egr-1启动子经辐射可诱导下游基因超强表达。现已证明造血生长因子具有抗 辐射及促进造血恢复作用，GM-CSF和FL(FLT3 Ligand)是作用于造血细胞不同阶段的细胞因 子[2]，我们设想采用Egr-1调控序列启动造血因子基因(GM-CSF和FL)的表达载体 导入骨髓基质细胞，然后对其进行辐射诱导Egr-1启动子下游基因表达，以促进造血恢复的 抗辐射作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 重组载体的构建
将FL cDNA (pUC18/FL由Indiana大学Dr Wang LS提供)和GM-CSF cDNA (pMX/GM-CSF由 Dr Donnell MD惠赠)，分别用IRES(pIRES)连接，再重组于携带Egr-1调控元件的pCIneo载 体上(北京放研所吕星博士惠赠)[3]，然后，构建成pCIneo-Egr-1R-GM-CSF -IRES-FL载体(Egr-FG)及各对照组载体。
1.2 细胞培养及转染
人骨髓基质细胞系HFCL[4]用含10%小牛血清的DMEM培养，待细胞呈对数生长时 ，用无血清DMEM培养液洗涤1次，然后用脂质体介导质粒DNA转染，用G418选择阳性克隆称为 HFCL/EFG。采用免疫磁珠法(MACS，Miltenti Biotec Germany)分离CD34+细胞[5] ，在含20%FCS、50 ng/ml SCF、20 ng/ml IL-3及20 ng/ml IL-6的IMDM(GIBCO)培养基 中，均在37°C及5%CO2条件下。
, 百拇医药
1.3 RT-PCR检测[6]GM-CSF和FL cDNA表达
取HFCL/EFG细胞，用RNA提取试剂盒，按说明方法分别提取总RNA。合成GM-CSF、FL及 β-actin基因序列引物。FL的PCR产物为225 bp，P1 5'-CTT GGA CCC AGC GAC AGT CTT G -3',P2 5'-TGC TGC TGA GCT CGG GAC TC-3',GM-CSF的PCR产物为495 bp，P1 5'-GCG GAT CCG CTG GAG GAT GTG GCT G, P2 5'-ATGAAACAAGAGCTAGAAACTCAGG;β-actin引物的P CR产物为249 bp，P1 5'-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT A G-3'，P2 5'-TTG TAA CCA C CT GGG ACG ATA TGG-3'；RT-PCR用cDNA合成试剂盒及方法合成cDNA，再用上述引物进行P CR，94°C 60 s,68°C 60 s,72°C 120 s共30次循环。
, 百拇医药
1.4 GM-CSF和FL表达量检测
取经2.5 Gy辐射后消化的培养细胞，按1×105细胞接种于6孔培养板，待细胞贴壁后 ，用PBS洗涤3次，用无血清IMDM培养第8 h换液并收集细胞培养上清液，每种样品重复3孔， 作时间曲线图，用人GM-CSF ELISA试剂盒(晶美生物工程有限公司)及FL多抗(Santa Cruz公 司)按常规方法测定GM-CSF和FL含量。
1.5 2.5 Gy照射后细胞培养上清液对脐血CD34+细胞的体外扩增
培养体系中含30%的2.5 Gy照后16 h的转染细胞培养上清、12.5%HS、12.5%FCS、5×10 -6mol/L氢化可的松、CD34+细胞5×103/孔及其它细胞因子(SCF 50 ng/ml+IL-3 20 ng/ml+IL-6 20 ng/ml)，阳性对照为标准品FL(Immunex) 40 ng/ml及无培养上清 的上述体系，对照组为未照射或无细胞因子的上述培养条件，7 d后，用流式细胞仪或荧光 显微镜分析CD34+细胞数量。
, 百拇医药
1.6 HFCL/EFG对2.5 Gy辐射后骨髓细胞的影响
取正常人肋骨骨髓分离单个核细胞(MNC)，分别加入MNC(1×104/孔)和HFCL/EFG(1×1 03/孔)，其它培养体系同方法1.5，给予2.5 Gy 60CO照射，常规培养7 d计数每孔非粘附细胞。
2 结果
2.1 载体的构建及转染骨髓基质细胞
构建过程见图1。经限制性内切酶分析鉴定证明Egr-1基因调控序列连接双顺反子GM-C SF cDNA和FL cDNA于携带Egr-1启动子的真核表达载体pCIneo上，并筛选出正向重组子。然 后将其用脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL，经G418抗性筛选出阳性细胞克隆HFCL/EGF。
, 百拇医药
图1 Egr-1调控的GM-CSF和FL cDNA双顺反子
表达载体的构建
Fig 1 Schematic representation of the recombinant GM-CSF and
FL cDNA bicistronic eukaryotic expression vector
2.2 GM-CSF和FL的含量检测
2.5 Gy 辐射后16 h转染细胞培养上清液ELISA检测显示HFCL/EGF培养上清液FL和GM-CS F含量照射后明显增加，未照射组FL含量为(214.45±35.61) pg/ml，GM-CSF为(15.60±3 .23) pg/ml，照射组FL为(805.46±107.21) pg/ml，GM-CSF为(485.56±81.14) pg/ml， 两组比较，P< 0.01。
, 百拇医药
2.3 辐照后HFCL/EFG培养上清液对CD34+细胞增殖的影响
液体培养结果FL标准组：(207.66±34.03)×103/ml，照射组为(174.46±22.11)×10 3/ml，未照射组为(71.62±10.22)×103/ml，结果表明：FL与其它细胞因子联合应用具 有短时间内可扩增早期造血祖细胞的作用，而HFCL/EFG细胞经照射后其培养上清也具有扩增 祖细胞的作用，且比未照射组更强(P< 0.05)。
2.4 照射的HFCL/EFG细胞对骨髓有核细胞数量的影响
HFCL/EFG与骨髓有核细胞共培养后，经辐射后含有Egr-1启动子的HFCL/EFG细胞较未含 有该启动子的细胞对辐射损伤的造血细胞具有促进其恢复和增殖的作用(P < 0.05)，见图2。
, http://www.100md.com
图2 照射后HFCL/EFG对骨髓有核细胞(MNC)的保护作用
Fig 2 Protective effects of HFCL/EFG on MNC post-radiation
2.5 RT-PCR检测GM-CSF及FL cDNA在细胞中的表达
用RT-PCR方法检测HFCL/EFG细胞中外源基因mRNA转录，见图3。
图3 RT-PCR检测HFCL/EFG细胞中GM-CSF
和FL mRNA表达
Fig 3 RT-PCR for expressions of GM-CSF and
, 百拇医药
FL mRNA in HFCL /EFG
Lane 1:Marker 100 bp DNA ladder； Lane 2,3,4:Expressions of FL m RNA and β-actin mRNA in HFCL/EFG; Lane 5: Expression of β-actin mRNA in HFCL ; Lane 6,7: Expression of GM-CSF mRNA and β-actin mRNA in HFCL/EFG; Lane 8: P CR Marker
3 讨论
造血干/祖细胞属于更新活跃、增殖旺盛的细胞，具有很高的辐射敏感性，电离辐射所 致造血损伤的主要环节是造血祖细胞增殖能力的丧失或抑制，而造血微环境是造血调控的关 键，造血微环境主要由基质细胞、细胞外基质和造血因子组成。GM-CSF是一种具有广谱活 性的造血生长因子，它不仅对多系造血祖细胞的增殖与分化是必需的，而且对多种成熟血细 胞的生存和发挥其功能也必不可少，临床研究证明GM-CSF可提高受照患者的存活率、减轻 造血组织辐射损伤，并使感染和出血易于控制。FL(FLT3 Ligand)是最近发现的一种主要促 进早期造血干/祖细胞增殖的细胞因子，是一种早期造血的关键性调节因子，与GM-CSF协同 ，效果更佳，随后发现FL与其它细胞因子相比具有更强的辐射后造血保护作用及更广阔的临 床应用前景[2]。然而它们均存在半衰期短，需大量、反复、长期应用才有效，且 有一定的副作用，而造血因子基因疗法具有促进造血重建的作用且克服上述缺点。选择基因 转移的靶细胞也非常重要，基质细胞是造血微环境的中心，在相当一段时间内造血微环境被 认为是辐射抗性组织，而现在发现造血微环境的辐射敏感性虽低于CFU-S，但较大剂量辐照 后也足以造成造血微环境的损伤，且损伤恢复较慢[7]。基质细胞生长期长，表达 时间亦长，而且一般表达载体的启动子诱导的基因表达呈组成性表达，而非依据造血需求调 控表达，体内长期过量的造血生长因子表达，尤其是早期造血生长因子，则会出现多种限 制使用的副作用，将辐射诱导基因调控机制与造血调控结合起来为造血系统基因调控性治疗 开辟了一条新思路[8]。
, 百拇医药
Egr-1基因是辐射早期对细胞起调控作用的转录因子，其调控序列可直接感受电离辐射 等刺激而诱导下游基因表达。Manome等[9]研究发现在靶细胞或靶组织中的Egr-1 启动子当扳动开关(即辐射)时，基因产物呈空间和时间性表达，这种时间上的基因表达调控 是指Egr-1启动子可以通过辐射诱导，空间调控实际上是指在某种特定组织范围内用外来一 精确地传递电离辐射[10]。根据Egr-1基因调控元件的特性，可以看出首先Eg r-1启动子的诱导因素即辐射本身具有治疗肿瘤作用，但对机体造血组织是损伤因素，然而 ，Egr-1调控元件启动的基因表达产物则是利用辐射诱导敏感性针对辐射对造血的损伤因素 起作用的；另外，Egr-1启动子与一般启动子包括组织特异性启动子不同，一般启动子诱导 的基因表达呈组成性表达，常呈持续性表达，而Egr-1启动子受到辐射后诱导的表达为超强 表达，表达量多而作用强，当辐射反应结束，基因的超强表达又随之减弱或终止，由此可消 除这种过表达带来的副作用。这种基因调控的完成有望使人们一直疑虑的辐射保护作用很强 的早期造血生长因子的临床应用变成现实。
, 百拇医药
本实验将双顺反子GM-CSF/FL cDNA插入携带Egr-1启动子的真核表达载体pCIneo的多 克隆酶切位点上。利用微小RNA病毒的内核糖体进入位点(IRES)构建的多顺反子载体则能将 多个基因在单一启动子控制下转录形成单一mRNA，因而避免了在转录调控水平对基因表达的 影响，该实验将Egr-FG导入骨髓基质细胞系HFCL，从RT-PCR及细胞因子含量检测证明双顺 反子能很好地表达两个基因，其表达水平并不低于单个基因的载体，而且它将为研究多个因 子协同作用有不同亚基组成的蛋白质提供一个简单而有效的载体。在体外HFCL/EFG经 辐射后GM-CSF和FL水平均明显升高， 未转染的HFCL基质细胞系RT-PCR未 扩出FL和GM-CSF mRNA扩增产物，原因不清；用HFCL/EFG细胞培养上清结合其它因子对CD34 +细胞有明显扩增作用，提示Egr-1启动子的确可诱导FL超表达，为进一步摸拟造血微环 境，将转染双顺反子的基质细胞与共培养的骨髓有核细胞同时照射，表明超表达细胞因子的 基质细胞对造血细胞具有保护作用，由此 提示Egr-1启动的造血因子基因疗法具有抗辐射 促进造血恢复的作用。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900040)；国家杰出青年自然科学基金资助项目(39825111)
作者简介：杜 楠(1962-)，男，河北省石家庄市人，博士， 副教授，主要从事血液学和放射医学方面的研究，发表论文20篇。电话：(023)68771552
作者单位：冯凯(军事医学科学院二所实验血液学研究室，北京 100850)
白慈贤(军事医学科学院二所实验血液学研究室，北京 100850)
孙兵(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研 究所，重庆 400038)
参考文献：
[1] Weichselbaum R R, Hallahan D E, Beckett M A, et al. Gen e therapy targeting by radiation preferentially radiosensitizes tumor cells[J] . Cancer Res,1994,54(7):4 266-4 269.
, 百拇医药
[2] Gratwohl A, Johm L, Baldomero H, et al. FLT3 ligand provi des he matopoietic protection from total body irradiation in rabbits[J]. Blood,1998,9 2(3):765-769.
[3] 吕 星，邢瑞云，孙志贤，等.小鼠Egr-1基因调控序列的克隆及其辐射诱导 特性的鉴定[J].中国肿瘤生物治疗杂志，1998，5(1)：16-19.
[4] 姜学英，苏月来，杨少光，等.人骨髓基质细胞系的建立、生物学特征和功能 研究[J].中华血液学杂志，1988，9(11)：661-664.
[5] 裴雪涛，王立生，徐 黎，等.CD34+造血祖细胞的定向诱导分化研究[J] .中华血液学杂志，1998，19(6)：289-293.
, 百拇医药
[6] F.奥斯伯 著.颜子颖，王海林 译.精编分子生物学实验指南[M].北京：科 学出版社，1998.587-601.
[7] 罗成基.造血微环境基质细胞的研究概况及前景[J].解放军医学杂志，1999 ,24(1):1-3.
[8] Keating A. A phage I study of the transplantation of genetically ma rked autologous bone marrow stromal cells[J]. Hum Gene Ther,1998,9(7):519-600.
[9] Manome Y, Kunieda T, Wen P Y, et al. Transgene expression in ma lignant glioma using a replicative adenoviral vector containing the Egr-1 promo ter: Activation by ionizing radiation or uptake of radioactive iododeoxyuidine[ J]. Hum Gene Ther,1998,9(7):1 409-1 417.
[10] Paillard F. The control of transgene expression with radiat ion[J]. Hum Gene Ther,1998,9(7):1 393-1 394.
收稿日期：1999-10-08；修回日期：1999-12-22, http://www.100md.com
单位：杜楠(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研 究所，重庆 400038)；裴雪涛(军事医学科学院二所实验血液学研究室，北京 100850)；罗成基(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研 究所，重庆 400038)；李梁(军事医学科学院二所实验血液学研究室，北京 100850)；邹仲敏(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研 究所，重庆 400038)
关键词：辐射诱导基因；造血生长因子；基因治疗；辐射；骨髓基质 细胞
第三军医大学学报000403 提 要： 目的 探索辐射诱导基因调控元件启动的造血 生长因子表达及其对造血恢复的作用。方法 该实验将携带Egr-1调控 序列启动的FLT3配基(FL)和GM-CSF双顺反子表达载体(Egr-FG)导入骨髓基质细胞系HFCL( 称为HFCL/EFG)。采用RT-PCR、ELISA及细胞增殖法观察FL和GM-CSF cDNA在转染细胞中的 表达及保护造血作用。结果 构建了Egr-1调控序列启动的双顺反子 基因表达载体(Egr-FG)；在HFCL/EFG细胞中证实有外源性FL和GM-CSF基因的整合和表达， 在辐照后16 h的HFCL/EFG细胞培养上清液中，FL和GM-CSF含量较照射前明显增高( P< 0. 01)；同时证实辐射后HFCL/EFG培养上清液对造血祖细胞有明显扩增作用；共培养的骨髓有 核细胞和HFCL/EFG经照射后7 d计数非粘附细胞，HFCL/EFG组较对照组明显增加(P < 0.05 )。结论 辐射诱导基因Egr-1调控序列启动的造血生长因子基因表达载 体在辐射后表达明显增高，在体外对辐射后的造血细胞具有保护作用。
, 百拇医药
中图法分类号： R394.3 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0310-04
Study of the expression of hematopoietic growth factors regulated with Egr-1 promotor sequence
DU Nan, PEI Xue-tao, LUO Cheng-ji, LI Liang, ZHOU Zhong-min, FENG Ka i, BAI Ci-xian, SUN Bin
(Department of Radiation Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
, 百拇医药
Abstract： Objective To study the effects of radiation induci ble gene on the regulation of the expression of hematopoietic growth factor and the restoration of hematopoiesis.Methods Human GM-CSF cDNA and F LT3 Ligand(FL) were linked together with IRES and inserted into the expression v ector pCI-Egr-1 which was constructed with the substitution of CMV promotor in pCIneo with Egr-1 promotor (Egr-FG). The vector was transferred into human bo ne marrow stromal cell line HFCL with lipofectinTM. The mRNA expression of the target gene in the cells were identified with RT-PCR. The amount of FL and GM-CSF in the supernatant of HFCL-EFG cell culture was determined with ELISA. CD34+ cells isolated with MACS were cultured in the medium containing the sup ernatant of HFCL/EFG to observe its effect on the proliferation of CD34+ cells .Results The gene expression vector (Egr-FG) initiated with Egr -1 regulation sequence was successfully constructed. It was confirmed that ther e were expression of exogenous FL and GM-CSF in HFCL-EFG cells. After 16 hours of 60Co irradiation, the amount of FL and GM-CSF in the serum-free supernatant of HFCL/EFG cell culture was increased respectively(P< 0.001).It was found that after irradiation, the supernatant of HFCL/EFG culture significan tly increased its effect on the proliferation of CD34+ cells.Conclusion These in vitro data provide an experimental basis for th e in vivo use of gene therapy of hematopoietic growth foctor gene regulated by Egr-1 t o protect hematopoiesis from ionizing radiation.
, 百拇医药
Key words： radiation inducible gene; hematopoietic gro wth factor; gene therapy; radiation; bone marrow stromal cell▲
电离辐射可迅速诱导细胞中早期生长反应(Early growth resp onse,Egr-1)基因的表达，Egr-1基因启动子含有6个CArG元件，电离辐射通过 细胞产生活性氧自由基作用于CArG元件，诱导Egr-1的表达。最近Weichselbaum等[1 ]将该启动子诱导的基因疗法与放射治疗结合起来(Gene-radiatherapy)，证明用特异的 辐射诱导元件Egr-1启动子经辐射可诱导下游基因超强表达。现已证明造血生长因子具有抗 辐射及促进造血恢复作用，GM-CSF和FL(FLT3 Ligand)是作用于造血细胞不同阶段的细胞因 子[2]，我们设想采用Egr-1调控序列启动造血因子基因(GM-CSF和FL)的表达载体 导入骨髓基质细胞，然后对其进行辐射诱导Egr-1启动子下游基因表达，以促进造血恢复的 抗辐射作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 重组载体的构建
将FL cDNA (pUC18/FL由Indiana大学Dr Wang LS提供)和GM-CSF cDNA (pMX/GM-CSF由 Dr Donnell MD惠赠)，分别用IRES(pIRES)连接，再重组于携带Egr-1调控元件的pCIneo载 体上(北京放研所吕星博士惠赠)[3]，然后，构建成pCIneo-Egr-1R-GM-CSF -IRES-FL载体(Egr-FG)及各对照组载体。
1.2 细胞培养及转染
人骨髓基质细胞系HFCL[4]用含10%小牛血清的DMEM培养，待细胞呈对数生长时 ，用无血清DMEM培养液洗涤1次，然后用脂质体介导质粒DNA转染，用G418选择阳性克隆称为 HFCL/EFG。采用免疫磁珠法(MACS，Miltenti Biotec Germany)分离CD34+细胞[5] ，在含20%FCS、50 ng/ml SCF、20 ng/ml IL-3及20 ng/ml IL-6的IMDM(GIBCO)培养基 中，均在37°C及5%CO2条件下。
, 百拇医药
1.3 RT-PCR检测[6]GM-CSF和FL cDNA表达
取HFCL/EFG细胞，用RNA提取试剂盒，按说明方法分别提取总RNA。合成GM-CSF、FL及 β-actin基因序列引物。FL的PCR产物为225 bp，P1 5'-CTT GGA CCC AGC GAC AGT CTT G -3',P2 5'-TGC TGC TGA GCT CGG GAC TC-3',GM-CSF的PCR产物为495 bp，P1 5'-GCG GAT CCG CTG GAG GAT GTG GCT G, P2 5'-ATGAAACAAGAGCTAGAAACTCAGG;β-actin引物的P CR产物为249 bp，P1 5'-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT A G-3'，P2 5'-TTG TAA CCA C CT GGG ACG ATA TGG-3'；RT-PCR用cDNA合成试剂盒及方法合成cDNA，再用上述引物进行P CR，94°C 60 s,68°C 60 s,72°C 120 s共30次循环。
, 百拇医药
1.4 GM-CSF和FL表达量检测
取经2.5 Gy辐射后消化的培养细胞，按1×105细胞接种于6孔培养板，待细胞贴壁后 ，用PBS洗涤3次，用无血清IMDM培养第8 h换液并收集细胞培养上清液，每种样品重复3孔， 作时间曲线图，用人GM-CSF ELISA试剂盒(晶美生物工程有限公司)及FL多抗(Santa Cruz公 司)按常规方法测定GM-CSF和FL含量。
1.5 2.5 Gy照射后细胞培养上清液对脐血CD34+细胞的体外扩增
培养体系中含30%的2.5 Gy照后16 h的转染细胞培养上清、12.5%HS、12.5%FCS、5×10 -6mol/L氢化可的松、CD34+细胞5×103/孔及其它细胞因子(SCF 50 ng/ml+IL-3 20 ng/ml+IL-6 20 ng/ml)，阳性对照为标准品FL(Immunex) 40 ng/ml及无培养上清 的上述体系，对照组为未照射或无细胞因子的上述培养条件，7 d后，用流式细胞仪或荧光 显微镜分析CD34+细胞数量。
, 百拇医药
1.6 HFCL/EFG对2.5 Gy辐射后骨髓细胞的影响
取正常人肋骨骨髓分离单个核细胞(MNC)，分别加入MNC(1×104/孔)和HFCL/EFG(1×1 03/孔)，其它培养体系同方法1.5，给予2.5 Gy 60CO照射，常规培养7 d计数每孔非粘附细胞。
2 结果
2.1 载体的构建及转染骨髓基质细胞
构建过程见图1。经限制性内切酶分析鉴定证明Egr-1基因调控序列连接双顺反子GM-C SF cDNA和FL cDNA于携带Egr-1启动子的真核表达载体pCIneo上，并筛选出正向重组子。然 后将其用脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL，经G418抗性筛选出阳性细胞克隆HFCL/EGF。
, 百拇医药
图1 Egr-1调控的GM-CSF和FL cDNA双顺反子
表达载体的构建
Fig 1 Schematic representation of the recombinant GM-CSF and
FL cDNA bicistronic eukaryotic expression vector
2.2 GM-CSF和FL的含量检测
2.5 Gy 辐射后16 h转染细胞培养上清液ELISA检测显示HFCL/EGF培养上清液FL和GM-CS F含量照射后明显增加，未照射组FL含量为(214.45±35.61) pg/ml，GM-CSF为(15.60±3 .23) pg/ml，照射组FL为(805.46±107.21) pg/ml，GM-CSF为(485.56±81.14) pg/ml， 两组比较，P< 0.01。
, 百拇医药
2.3 辐照后HFCL/EFG培养上清液对CD34+细胞增殖的影响
液体培养结果FL标准组：(207.66±34.03)×103/ml，照射组为(174.46±22.11)×10 3/ml，未照射组为(71.62±10.22)×103/ml，结果表明：FL与其它细胞因子联合应用具 有短时间内可扩增早期造血祖细胞的作用，而HFCL/EFG细胞经照射后其培养上清也具有扩增 祖细胞的作用，且比未照射组更强(P< 0.05)。
2.4 照射的HFCL/EFG细胞对骨髓有核细胞数量的影响
HFCL/EFG与骨髓有核细胞共培养后，经辐射后含有Egr-1启动子的HFCL/EFG细胞较未含 有该启动子的细胞对辐射损伤的造血细胞具有促进其恢复和增殖的作用(P < 0.05)，见图2。
, http://www.100md.com
图2 照射后HFCL/EFG对骨髓有核细胞(MNC)的保护作用
Fig 2 Protective effects of HFCL/EFG on MNC post-radiation
2.5 RT-PCR检测GM-CSF及FL cDNA在细胞中的表达
用RT-PCR方法检测HFCL/EFG细胞中外源基因mRNA转录，见图3。
图3 RT-PCR检测HFCL/EFG细胞中GM-CSF
和FL mRNA表达
Fig 3 RT-PCR for expressions of GM-CSF and
, 百拇医药
FL mRNA in HFCL /EFG
Lane 1:Marker 100 bp DNA ladder； Lane 2,3,4:Expressions of FL m RNA and β-actin mRNA in HFCL/EFG; Lane 5: Expression of β-actin mRNA in HFCL ; Lane 6,7: Expression of GM-CSF mRNA and β-actin mRNA in HFCL/EFG; Lane 8: P CR Marker
3 讨论
造血干/祖细胞属于更新活跃、增殖旺盛的细胞，具有很高的辐射敏感性，电离辐射所 致造血损伤的主要环节是造血祖细胞增殖能力的丧失或抑制，而造血微环境是造血调控的关 键，造血微环境主要由基质细胞、细胞外基质和造血因子组成。GM-CSF是一种具有广谱活 性的造血生长因子，它不仅对多系造血祖细胞的增殖与分化是必需的，而且对多种成熟血细 胞的生存和发挥其功能也必不可少，临床研究证明GM-CSF可提高受照患者的存活率、减轻 造血组织辐射损伤，并使感染和出血易于控制。FL(FLT3 Ligand)是最近发现的一种主要促 进早期造血干/祖细胞增殖的细胞因子，是一种早期造血的关键性调节因子，与GM-CSF协同 ，效果更佳，随后发现FL与其它细胞因子相比具有更强的辐射后造血保护作用及更广阔的临 床应用前景[2]。然而它们均存在半衰期短，需大量、反复、长期应用才有效，且 有一定的副作用，而造血因子基因疗法具有促进造血重建的作用且克服上述缺点。选择基因 转移的靶细胞也非常重要，基质细胞是造血微环境的中心，在相当一段时间内造血微环境被 认为是辐射抗性组织，而现在发现造血微环境的辐射敏感性虽低于CFU-S，但较大剂量辐照 后也足以造成造血微环境的损伤，且损伤恢复较慢[7]。基质细胞生长期长，表达 时间亦长，而且一般表达载体的启动子诱导的基因表达呈组成性表达，而非依据造血需求调 控表达，体内长期过量的造血生长因子表达，尤其是早期造血生长因子，则会出现多种限 制使用的副作用，将辐射诱导基因调控机制与造血调控结合起来为造血系统基因调控性治疗 开辟了一条新思路[8]。
, 百拇医药
Egr-1基因是辐射早期对细胞起调控作用的转录因子，其调控序列可直接感受电离辐射 等刺激而诱导下游基因表达。Manome等[9]研究发现在靶细胞或靶组织中的Egr-1 启动子当扳动开关(即辐射)时，基因产物呈空间和时间性表达，这种时间上的基因表达调控 是指Egr-1启动子可以通过辐射诱导，空间调控实际上是指在某种特定组织范围内用外来一 精确地传递电离辐射[10]。根据Egr-1基因调控元件的特性，可以看出首先Eg r-1启动子的诱导因素即辐射本身具有治疗肿瘤作用，但对机体造血组织是损伤因素，然而 ，Egr-1调控元件启动的基因表达产物则是利用辐射诱导敏感性针对辐射对造血的损伤因素 起作用的；另外，Egr-1启动子与一般启动子包括组织特异性启动子不同，一般启动子诱导 的基因表达呈组成性表达，常呈持续性表达，而Egr-1启动子受到辐射后诱导的表达为超强 表达，表达量多而作用强，当辐射反应结束，基因的超强表达又随之减弱或终止，由此可消 除这种过表达带来的副作用。这种基因调控的完成有望使人们一直疑虑的辐射保护作用很强 的早期造血生长因子的临床应用变成现实。
, 百拇医药
本实验将双顺反子GM-CSF/FL cDNA插入携带Egr-1启动子的真核表达载体pCIneo的多 克隆酶切位点上。利用微小RNA病毒的内核糖体进入位点(IRES)构建的多顺反子载体则能将 多个基因在单一启动子控制下转录形成单一mRNA，因而避免了在转录调控水平对基因表达的 影响，该实验将Egr-FG导入骨髓基质细胞系HFCL，从RT-PCR及细胞因子含量检测证明双顺 反子能很好地表达两个基因，其表达水平并不低于单个基因的载体，而且它将为研究多个因 子协同作用有不同亚基组成的蛋白质提供一个简单而有效的载体。在体外HFCL/EFG经 辐射后GM-CSF和FL水平均明显升高， 未转染的HFCL基质细胞系RT-PCR未 扩出FL和GM-CSF mRNA扩增产物，原因不清；用HFCL/EFG细胞培养上清结合其它因子对CD34 +细胞有明显扩增作用，提示Egr-1启动子的确可诱导FL超表达，为进一步摸拟造血微环 境，将转染双顺反子的基质细胞与共培养的骨髓有核细胞同时照射，表明超表达细胞因子的 基质细胞对造血细胞具有保护作用，由此 提示Egr-1启动的造血因子基因疗法具有抗辐射 促进造血恢复的作用。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900040)；国家杰出青年自然科学基金资助项目(39825111)
作者简介：杜 楠(1962-)，男，河北省石家庄市人，博士， 副教授，主要从事血液学和放射医学方面的研究，发表论文20篇。电话：(023)68771552
作者单位：冯凯(军事医学科学院二所实验血液学研究室，北京 100850)
白慈贤(军事医学科学院二所实验血液学研究室，北京 100850)
孙兵(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研 究所，重庆 400038)
参考文献：
[1] Weichselbaum R R, Hallahan D E, Beckett M A, et al. Gen e therapy targeting by radiation preferentially radiosensitizes tumor cells[J] . Cancer Res,1994,54(7):4 266-4 269.
, 百拇医药
[2] Gratwohl A, Johm L, Baldomero H, et al. FLT3 ligand provi des he matopoietic protection from total body irradiation in rabbits[J]. Blood,1998,9 2(3):765-769.
[3] 吕 星，邢瑞云，孙志贤，等.小鼠Egr-1基因调控序列的克隆及其辐射诱导 特性的鉴定[J].中国肿瘤生物治疗杂志，1998，5(1)：16-19.
[4] 姜学英，苏月来，杨少光，等.人骨髓基质细胞系的建立、生物学特征和功能 研究[J].中华血液学杂志，1988，9(11)：661-664.
[5] 裴雪涛，王立生，徐 黎，等.CD34+造血祖细胞的定向诱导分化研究[J] .中华血液学杂志，1998，19(6)：289-293.
, 百拇医药
[6] F.奥斯伯 著.颜子颖，王海林 译.精编分子生物学实验指南[M].北京：科 学出版社，1998.587-601.
[7] 罗成基.造血微环境基质细胞的研究概况及前景[J].解放军医学杂志，1999 ,24(1):1-3.
[8] Keating A. A phage I study of the transplantation of genetically ma rked autologous bone marrow stromal cells[J]. Hum Gene Ther,1998,9(7):519-600.
[9] Manome Y, Kunieda T, Wen P Y, et al. Transgene expression in ma lignant glioma using a replicative adenoviral vector containing the Egr-1 promo ter: Activation by ionizing radiation or uptake of radioactive iododeoxyuidine[ J]. Hum Gene Ther,1998,9(7):1 409-1 417.
[10] Paillard F. The control of transgene expression with radiat ion[J]. Hum Gene Ther,1998,9(7):1 393-1 394.
收稿日期：1999-10-08；修回日期：1999-12-22, http://www.100md.com