HIV-1整合酶单链抗体对整合酶生物学活性抑制作用的研究
作者：张健慧 李南 宋晓国 孟莉 韩保光 凌世淦 马贤凯
单位：军事医学科学院基础医学研究所，北京，100850
关键词：人类免疫缺陷病毒；整合酶；生物活性；单键抗体
细胞与分子免疫学杂志990201摘 要：从抗HIV-1整合酶(integrase,IN)单链抗体(single chain fragment variable,ScFv)的HB2151表达菌中选取3个克隆，进行ScFv的可溶性表达与纯化，并观察ScFv对IN体外生物学活性的影响。结果显示，在ScFv：IN摩尔浓度为8∶1时，3个克隆的ScFv可明显抑制IN的3′端加工、链转移及去整合活性；而相同浓度的BSA及抗人交联纤维的ScFv对IN活性无明显影响。测序结果表明，此3个克隆的ScFv基因序列完全相同，符合鼠抗体可变区序列。完全抑制3′端加工及去整合反应所需ScFv的浓度高于链转移反应。研究结果提示，抗IN的ScFv可抑制IN的体外生物学活性，此结论为进一步研究此类ScFv对HIV在细胞内复制的影响及其机制奠定了基础。
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中国图书资料分类号：392.11
Inhibition of enzymatic activities of HIV-1 integrase(IN)
by the ScFv against IN
Zhang Jianhui, Li Nan, Song Xiaoguo, Meng Li, Han Baoguang, Ling Shigan, Ma Xiankai.
(Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850)
Keywords： HIV integrase biological activity ScFv
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Abstract：From bacteria strain HB2151 expressing ScFv against HIV-1 integrase (IN), three clones were selected and the soluble ScFvs were expressed and purified for testing their effects on biological activities of IN. The results showed that the 3′ end processing, strand transfer and disintegration activities of IN could be abolished by all of the three ScFvs at a ScFv/IN molar ratio of 8∶ 1, whereas BSA and antihuman cross linked fibrin ScFv did not affect any of the enzymatic activities at the same molar concentration. The three strains had the same ScFv sequence which was conformed with the DNA sequence of the variable region of mouse immunoglobulin. It was indicated that the ScFv concentration needed to abolish the 3′ end processing and disintegration reaction was higher than that of strand transfer activity. The study suggested that the in vitro enzymatic activities of IN could be inhibited by the ScFv. This result provided a good basis for further study of the possibility and mechanism of the ScFv in the replication of HIV in cells.
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由于HIV基因极易突变，造成AIDS患者很容易对HIV蛋白酶、逆转录酶等抑制剂产生耐药性。近年来采用的“鸡尾酒”疗法延缓了耐药性的产生，但保持疗效的关键在于不断寻找疾病治疗的新靶位及新途径〔1〕。
HIV整合酶(integrase,IN)为HIVpol基因3′端编码的蛋白质，可介导HIVDNA与宿主细胞染色体DNA的整合过程。由于人体内无该酶的类似物存在，IN成为AIDS治疗的理想靶位〔2〕。为探索艾滋病治疗的新方法，我们曾利用噬菌体抗体库技术，制备了IN的特异性单链抗体(single chain fragment variable,ScFv)〔3〕，并在大肠杆菌中进行了ScFv的可溶性表达，又以免疫亲和层析技术进行了ScFv的纯化〔4〕。本文进一步观察了纯化的ScFv对IN蛋白体外生物学活性的影响。
1 材料和方法
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1.1 主要材料 ①IN蛋白及其单链抗体：重组HIV-1 IN蛋白及鼠源性抗IN的ScFv，由本实验室研制。②同位素：γ-32PATP为中国端辉同位素公司产品。③其它试剂及试剂盒：所用化学试剂均为分子生物纯或分析纯等级。其中T4多核苷酸激酶购自Promega公司；G-25葡聚糖快速离心柱(G-25Sephadex Quick Spin Column)和DNA测序试剂盒均购自Pharmacia公司。④寡核苷酸：模拟的HIV-1基因长末端重复(long terminal repeats,LTR)的U5末端序列及宿主细胞DNA序列的寡核苷酸〔6〕，由上海生工生物工程公司合成，具体序列为：
AE118：5′GTG TGG AAA ATC TCT AGC AGT 3′
AE117：5′ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAC 3′
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AE118S：5′GTG TGG AAA ATC TCT AGC A3′
AE157：5′GAA AGC GAC CGC GCC 3′
AE146：5′GGA CGC CAT AGC CCC GGC GCG GTC GCT TTC 3′
AE156：5′GTG TGG AAA ATC TCT AGC AGG GGC TAT GGC GTC C3′
1.2 ScFv的可溶性表达与纯化 在具有IN结合能力的可溶性ScFv中，挑选3个用ELISA法检测A值较高者，取其HB2151表达菌(S16，S18，S27)，以1L体积进行扩大培养及IPTG诱导。将每个克隆的周质腔萃取物及经硫酸铵沉淀的培养基上清合并，分别以Anti E Tag亲和层析柱(Pharmacia)纯化〔4〕。收集纯化产物，以蔗糖浓缩至原体积的4～6倍，经IN反应缓冲液(20 mmol/L HEPES,pH7.5;10 mmol/LDTT,0.05%N-P40)充分透析，以紫外分光光度计进行蛋白定量，-20℃保存。
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1.3 寡核苷酸的5′端末端标记 以20μl反应体系进行寡核苷酸的5′末端标记，其中含有：20pmol/L寡核苷酸50μCi〔γ-32P〕，2μl10×T4PNKbuffer,10μT4PNK，混匀后，以37℃水浴1h，至70℃加热10min，终止标记反应。
1.4 寡核苷酸的退火及纯化 进行3′端加工反应及链转移(整合)反应时，分别于同位素标记的AE118及AE118S微量离心管中加入等量的AE117；进行去整合反应时，于标记的AE157管中，分别加入60pmol/L的AE117，AE146及A156。将以上反应管中的物质混匀后置100℃5min，逐渐降至室温，上样于G-25SephadexQuickSpincolumn,去除未标记的寡核苷酸，即得到用于酶促反应的底物。
1.5 ScFv对IN体外生物活性的影响 除寡核苷酸外，检测IN3种生物学活性的反应条件一致。先将抗IN蛋白的ScFv、无关蛋白(BSA)及无关ScFv(抗人交联纤维的ScFv)与纯化的IN蛋白(约30pmol/L)按一定摩尔浓度比混合，于15μl体积内(含有HEPES 20 mmol/L,pH7.5，DTT 10 mmol/L，NP-400.05%)，25℃作用30min，分别加入相应的退火、纯化后的寡核苷酸2μl，并将反应体积调节至20μl，使反应液中各成分的终浓度为：HEPES 20 mmol/L,pH 7.5,MnCl2 15mmol/L,NaCl 50 mmol/L(来自IN复性液)，DTT 10 mmol/LNP-40 0.05%。混匀后置37℃水浴1h，立即加入20μl上样缓冲液(98%去离子甲酰胺，10 mmol/L EDTA,pH8.0,0.05%溴酚蓝)终止反应。
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1.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影 将酶促反应管以100℃加热5min后，上样(10 μl)于含有7 mol/L尿素的19%聚丙烯酰胺凝胶中，30mA下电泳4h，揭胶后进行放射自显影。
1.7 ScFvDNA的序列测定 将以上3株ScFv的HB2151菌提取质粒，以Sanger双脱氧核苷酸末端终止法，按试剂盒操作说明进行ScFv DNA的序列分析。
2 结果
2.1 IN蛋白的生物学活性 图1A(见第I页)为IN蛋白的3′端加工活性示意图。寡核苷酸AE118与AE117退火，可模拟HIV-1线性DNALTR序列的U5末端。IN蛋白可特异性地识别该末端，将其正链(AE118)3′端的终末两碱基切除，形成一3′端凹陷的结构。将21bp的AE118 5′端以同位素标记，经切除两碱基后可显示19bp的反应产物(图2A，见第I页)。IN蛋白也可以退火的AE118和AE117作为宿主细胞的靶DNA，将其随机切割，使具有3′端凹陷的HIV-1U5末端可随机整合入内，此即为IN的链转移活性或称为整合活性。寡核苷酸AE118S可代表已切除两碱基的HIV-1基因U5末端。将其5′端进行同位素标记且与AE117退火后，可直接作为IN链转移活性的反应供体，并可以另一对寡核苷酸为受体，进行链转移(整合)反应(图1B，见第I页)。经PAGE电泳显示，在底物上方有数条呈梯状的整合产物存在(图2A，2B，见第I页)。
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图1 3′端加工(A)、链转移(B)及去整合活性(C)(示意图)
Fig1 Diagram showing 3′-end processing (A), strand transfer
(B) and disintegration (C) of IN
Open circles denote the 5′-end. The location of the 5′-32P-labeles are denoted by a filled circle. Filled triangles indicate site of cleavage. The numbers in parentheses indicate the lengths in nucleotides of the oligonucleotides or the reaction product.
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图2 抗IN单链抗体对3′端加工(A)、链转移(B)及去整合活性(C)的抑制作用
Fig2 Inhibition of 3′-end processing (A), strand transfer
(B) and disintegration (C) by ScFv against IN
The filled arrow corresponds to the 5′-end-labeled input substrate. The open arrows indicate the positions of the products. The IN was incubated with BSA (lane3), unrelated ScFv (lane 4) and ScFv against IN (lane 5～7). The oligonucleotide substrate was incubated with IN in the absence of other proteins in lane 2.
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IN蛋白的链转移活性具有可逆性。AE117，AE156，AE157和AE146经退火后形成一Y形结构，可模拟IN蛋白催化的链转移产物。IN蛋白可催化此Y形结构分解，重新形成游离的病毒末端及宿主细胞DNA片段，完成去整合(disintegration)反应。将15 bp AE157的5′端标记，电泳后可显示30 bp的去整合产物(图1C、2C，见第I页)。
2.2 ScFv对IN活性的抑制作用 在与IN蛋白以8∶1摩尔浓度比存在时，S16，S18和S27，3个克隆的ScFv，对IN的3种生物学活性均具有明显地抑制作用；而无关蛋白(BSA)及抗无关蛋白的ScFv(cScFv)，对IN蛋白的3种生物学活性均无明显影响(图2A～C，见第I页)。对S16，S18和S27的DNA序列分析表明，3个菌株的VL和VH区基因序列完全相同，说明此3个克隆同属一个克隆(命名为ScFv A0)。ScFv A0基因全长738bp，共编码246个氨基酸。其中VH由369bp组成，编码123个氨基酸；VL由324bp组成，编码108个氨基酸；在VH和VL之间为编码(Gly4Ser)3连接肽的DNA序列。通过与小鼠免疫球蛋白序列数据库对比，ScFv A0的VH属于小鼠重链可变区家族的V(A)亚型；VL属于小鼠轻链可变区家族κ链的Ⅳ型。ScFv A0的DNA序列及由此推导出的氨基酸序列图3(见第II页)。
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图3 ScFvA0的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of ScFvA0
我们还观察了不同浓度的ScFv AO对IN生物学活性的影响，在与IN蛋白以不同浓度混合(8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，0.5∶1)时，ScFv AO均可完全抑制IN的链转移活性(图4B，见第II页)。在3′端加工及去整合活性中，随着抗体浓度的增高，ScFv A0对IN活性的抑制作用逐渐增强，达到完全抑制时，ScFv A0与IN的摩尔浓度比为4∶1(图4A、4C，见第II页)。
图4 不同浓度的ScFv A0对3′端加工(A)、链转移(B)和去整合活性(C)的抑制作用
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Fig4 Titration of ScFvA0 in 3′-end processing (A), strand transfer (B) and disintegration (C)
1: The filled arrow corresponds to the 5′-end-labeled input substrate. The open arrows indicate the positions of the products; 2: The oligonucleotide substrate was incubated with IN in the absence of ScFv A0; 3～7: ScFv A0 were incubated with IN at different molar ratios to IN.
3 讨论
在宿主细胞胞浆内，HIV的RNA在逆转录酶作用下形成双链cDNA。在IN作用下，病毒的线性DNA与宿主细胞的染色体DNA整合，使得病毒DNA随着宿主细胞染色体DNA一起复制〔2〕。如以IN蛋白抑制剂阻断这一整合过程，势必可干扰HIV在人体内的复制，从而起到治疗AIDS的作用。但IN蛋白的难溶性使其晶体结构及活性位点的天然构象尚未完全明确，IN抑制物的发展及应用也受到限制〔1〕。由于抗体分子可特异性与抗原分子结合而影响其功能，因此，利用IN蛋白特异性的抗体来阻断其生物学活性，可能为AIDS治疗的重要途径。ScFv为近年来出现的基因工程抗体，具有特异性强、分子小、穿透力强、代谢快、对人体免疫源性弱和容易制备等特点〔6〕。研制HIVIN的ScFv，观察其对IN生物学活性的抑制作用，及对HIV在细胞内复制的影响，对探索艾滋病治疗的新方法具有重要意义。
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以人工合成的寡核苷酸为底物，利用同位素或生物素进行选择性标记，在天然或重组的HIV整合酸催化下，可在体外模拟HIV病毒DNA与宿主DNA的整合过程，为研究IN的结构及生物学活性，以及筛选IN的抑制剂提供简易的方法〔5〕。
本研究结果表明，IN蛋白的ScFv可明显抑制IN的3′端加工、链转移及去整合活性。我们推测，ScFv阻断IN活性的原理可能有：①作用于IN分子的DNA结合部位，影响IN与病毒线性底物的结合；②与IN分子的催化活性基团结合，阻断其催化活性；③IN蛋白至少以二聚体的形式发挥其生物学活性〔7〕。ScFv可通过干扰IN蛋白的多聚体形成而抑制其活性；④结合于IN分子某一表位的抗体可影响该表位周围，甚至影响酶分子构象而改变其活性。作用于IN不同表位的ScFv，可能通过以上一种或几种机制来抑制IN生物学活性的发挥。
实验结果还表明，ScFv可完全抑制3′端加工及去整合反应所需ScFv的浓度高于链转移活性。Barsov的研究结果曾表明，IN的3种生物学活性对反应中IN浓度的要求不同。当反应中IN浓度为0.34μmol/L时，链转移活性已不能测出；而3′端加工及去整合活性在0.0425 μmol/L的IN蛋白存在时仍可检出〔8〕。由于ScFv与IN蛋白结合时，不仅可使处于游离状态的IN分子浓度减低，也可能使IN的DNA结合及多聚体形成能力等受到影响。因此，与3′端加工及去整合反应相比，链转移反应中对IN浓度或空间构象的要求可能更高。
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本研究显示，IN蛋白的ScFv可明显抑制IN蛋白的体外生物学活性，此结论为ScFv作为IN抑制剂的可能性提供了依据。目前，我们正在试图获得作用于IN不同表位的ScFv，并努力将ScFv基因在细胞内高效表达，以进一步研究ScFv对HIV在细胞内复制的影响及其作用机制。
作者简介：张健慧,女，34岁，助研，博士。北京市太平路27号，Tel.(010)-66932308
参考文献
[1]Thomas M, Brady L. HIV integrase: a target for AIDS therapeutics. Tibtech,1997; 15:167～171
[2]Katz RA, Skalka AM. The retroviral enzymes. Annu Rev Biochem, 1994;63:133～173
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[3]张健慧，孟莉，韩保光，等.利用噬菌体表面呈现技术制备HIV-1整合酶单链抗体的初步研究.军事医学科学院院刊，1998；22(4):248～252
[4]张健慧，宋晓国，孟莉，等.HIV-1整合酶单链抗体在大肠杆菌中的表达、纯化、鉴定.细胞与分子免疫学杂志，1999；15(1):14～16
[5]Chow SA. In vitro assays for activities of retroviral integrase. Methods, 1997; 12: 306～317
[6]Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE，et al. Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol, 1994; 12:433～455
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[7]Ellison V, Gerton J, Vincent KA， et al.An essential interaction between distinct domains of HIV-1 integrase mediates assembly of the active multimer. J Biol Chem, 1995; 270:3320～3326
[8]Barsov EV, Huber WE, Marcotrigiano J, et al. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 integrase by the Fab fragment of a specific monoclonal antiblody suggested different multimerization states are required for different enzymatic functions. J Virol, 1996; 70:4484～4494
收稿：1998-08-03
修回：1998-09-06, 百拇医药
单位：军事医学科学院基础医学研究所，北京，100850
关键词：人类免疫缺陷病毒；整合酶；生物活性；单键抗体
细胞与分子免疫学杂志990201摘 要：从抗HIV-1整合酶(integrase,IN)单链抗体(single chain fragment variable,ScFv)的HB2151表达菌中选取3个克隆，进行ScFv的可溶性表达与纯化，并观察ScFv对IN体外生物学活性的影响。结果显示，在ScFv：IN摩尔浓度为8∶1时，3个克隆的ScFv可明显抑制IN的3′端加工、链转移及去整合活性；而相同浓度的BSA及抗人交联纤维的ScFv对IN活性无明显影响。测序结果表明，此3个克隆的ScFv基因序列完全相同，符合鼠抗体可变区序列。完全抑制3′端加工及去整合反应所需ScFv的浓度高于链转移反应。研究结果提示，抗IN的ScFv可抑制IN的体外生物学活性，此结论为进一步研究此类ScFv对HIV在细胞内复制的影响及其机制奠定了基础。
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中国图书资料分类号：392.11
Inhibition of enzymatic activities of HIV-1 integrase(IN)
by the ScFv against IN
Zhang Jianhui, Li Nan, Song Xiaoguo, Meng Li, Han Baoguang, Ling Shigan, Ma Xiankai.
(Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850)
Keywords： HIV integrase biological activity ScFv
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Abstract：From bacteria strain HB2151 expressing ScFv against HIV-1 integrase (IN), three clones were selected and the soluble ScFvs were expressed and purified for testing their effects on biological activities of IN. The results showed that the 3′ end processing, strand transfer and disintegration activities of IN could be abolished by all of the three ScFvs at a ScFv/IN molar ratio of 8∶ 1, whereas BSA and antihuman cross linked fibrin ScFv did not affect any of the enzymatic activities at the same molar concentration. The three strains had the same ScFv sequence which was conformed with the DNA sequence of the variable region of mouse immunoglobulin. It was indicated that the ScFv concentration needed to abolish the 3′ end processing and disintegration reaction was higher than that of strand transfer activity. The study suggested that the in vitro enzymatic activities of IN could be inhibited by the ScFv. This result provided a good basis for further study of the possibility and mechanism of the ScFv in the replication of HIV in cells.
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由于HIV基因极易突变，造成AIDS患者很容易对HIV蛋白酶、逆转录酶等抑制剂产生耐药性。近年来采用的“鸡尾酒”疗法延缓了耐药性的产生，但保持疗效的关键在于不断寻找疾病治疗的新靶位及新途径〔1〕。
HIV整合酶(integrase,IN)为HIVpol基因3′端编码的蛋白质，可介导HIVDNA与宿主细胞染色体DNA的整合过程。由于人体内无该酶的类似物存在，IN成为AIDS治疗的理想靶位〔2〕。为探索艾滋病治疗的新方法，我们曾利用噬菌体抗体库技术，制备了IN的特异性单链抗体(single chain fragment variable,ScFv)〔3〕，并在大肠杆菌中进行了ScFv的可溶性表达，又以免疫亲和层析技术进行了ScFv的纯化〔4〕。本文进一步观察了纯化的ScFv对IN蛋白体外生物学活性的影响。
1 材料和方法
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1.1 主要材料 ①IN蛋白及其单链抗体：重组HIV-1 IN蛋白及鼠源性抗IN的ScFv，由本实验室研制。②同位素：γ-32PATP为中国端辉同位素公司产品。③其它试剂及试剂盒：所用化学试剂均为分子生物纯或分析纯等级。其中T4多核苷酸激酶购自Promega公司；G-25葡聚糖快速离心柱(G-25Sephadex Quick Spin Column)和DNA测序试剂盒均购自Pharmacia公司。④寡核苷酸：模拟的HIV-1基因长末端重复(long terminal repeats,LTR)的U5末端序列及宿主细胞DNA序列的寡核苷酸〔6〕，由上海生工生物工程公司合成，具体序列为：
AE118：5′GTG TGG AAA ATC TCT AGC AGT 3′
AE117：5′ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAC 3′
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AE118S：5′GTG TGG AAA ATC TCT AGC A3′
AE157：5′GAA AGC GAC CGC GCC 3′
AE146：5′GGA CGC CAT AGC CCC GGC GCG GTC GCT TTC 3′
AE156：5′GTG TGG AAA ATC TCT AGC AGG GGC TAT GGC GTC C3′
1.2 ScFv的可溶性表达与纯化 在具有IN结合能力的可溶性ScFv中，挑选3个用ELISA法检测A值较高者，取其HB2151表达菌(S16，S18，S27)，以1L体积进行扩大培养及IPTG诱导。将每个克隆的周质腔萃取物及经硫酸铵沉淀的培养基上清合并，分别以Anti E Tag亲和层析柱(Pharmacia)纯化〔4〕。收集纯化产物，以蔗糖浓缩至原体积的4～6倍，经IN反应缓冲液(20 mmol/L HEPES,pH7.5;10 mmol/LDTT,0.05%N-P40)充分透析，以紫外分光光度计进行蛋白定量，-20℃保存。
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1.3 寡核苷酸的5′端末端标记 以20μl反应体系进行寡核苷酸的5′末端标记，其中含有：20pmol/L寡核苷酸50μCi〔γ-32P〕，2μl10×T4PNKbuffer,10μT4PNK，混匀后，以37℃水浴1h，至70℃加热10min，终止标记反应。
1.4 寡核苷酸的退火及纯化 进行3′端加工反应及链转移(整合)反应时，分别于同位素标记的AE118及AE118S微量离心管中加入等量的AE117；进行去整合反应时，于标记的AE157管中，分别加入60pmol/L的AE117，AE146及A156。将以上反应管中的物质混匀后置100℃5min，逐渐降至室温，上样于G-25SephadexQuickSpincolumn,去除未标记的寡核苷酸，即得到用于酶促反应的底物。
1.5 ScFv对IN体外生物活性的影响 除寡核苷酸外，检测IN3种生物学活性的反应条件一致。先将抗IN蛋白的ScFv、无关蛋白(BSA)及无关ScFv(抗人交联纤维的ScFv)与纯化的IN蛋白(约30pmol/L)按一定摩尔浓度比混合，于15μl体积内(含有HEPES 20 mmol/L,pH7.5，DTT 10 mmol/L，NP-400.05%)，25℃作用30min，分别加入相应的退火、纯化后的寡核苷酸2μl，并将反应体积调节至20μl，使反应液中各成分的终浓度为：HEPES 20 mmol/L,pH 7.5,MnCl2 15mmol/L,NaCl 50 mmol/L(来自IN复性液)，DTT 10 mmol/LNP-40 0.05%。混匀后置37℃水浴1h，立即加入20μl上样缓冲液(98%去离子甲酰胺，10 mmol/L EDTA,pH8.0,0.05%溴酚蓝)终止反应。
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1.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影 将酶促反应管以100℃加热5min后，上样(10 μl)于含有7 mol/L尿素的19%聚丙烯酰胺凝胶中，30mA下电泳4h，揭胶后进行放射自显影。
1.7 ScFvDNA的序列测定 将以上3株ScFv的HB2151菌提取质粒，以Sanger双脱氧核苷酸末端终止法，按试剂盒操作说明进行ScFv DNA的序列分析。
2 结果
2.1 IN蛋白的生物学活性 图1A(见第I页)为IN蛋白的3′端加工活性示意图。寡核苷酸AE118与AE117退火，可模拟HIV-1线性DNALTR序列的U5末端。IN蛋白可特异性地识别该末端，将其正链(AE118)3′端的终末两碱基切除，形成一3′端凹陷的结构。将21bp的AE118 5′端以同位素标记，经切除两碱基后可显示19bp的反应产物(图2A，见第I页)。IN蛋白也可以退火的AE118和AE117作为宿主细胞的靶DNA，将其随机切割，使具有3′端凹陷的HIV-1U5末端可随机整合入内，此即为IN的链转移活性或称为整合活性。寡核苷酸AE118S可代表已切除两碱基的HIV-1基因U5末端。将其5′端进行同位素标记且与AE117退火后，可直接作为IN链转移活性的反应供体，并可以另一对寡核苷酸为受体，进行链转移(整合)反应(图1B，见第I页)。经PAGE电泳显示，在底物上方有数条呈梯状的整合产物存在(图2A，2B，见第I页)。
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图1 3′端加工(A)、链转移(B)及去整合活性(C)(示意图)
Fig1 Diagram showing 3′-end processing (A), strand transfer
(B) and disintegration (C) of IN
Open circles denote the 5′-end. The location of the 5′-32P-labeles are denoted by a filled circle. Filled triangles indicate site of cleavage. The numbers in parentheses indicate the lengths in nucleotides of the oligonucleotides or the reaction product.
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图2 抗IN单链抗体对3′端加工(A)、链转移(B)及去整合活性(C)的抑制作用
Fig2 Inhibition of 3′-end processing (A), strand transfer
(B) and disintegration (C) by ScFv against IN
The filled arrow corresponds to the 5′-end-labeled input substrate. The open arrows indicate the positions of the products. The IN was incubated with BSA (lane3), unrelated ScFv (lane 4) and ScFv against IN (lane 5～7). The oligonucleotide substrate was incubated with IN in the absence of other proteins in lane 2.
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IN蛋白的链转移活性具有可逆性。AE117，AE156，AE157和AE146经退火后形成一Y形结构，可模拟IN蛋白催化的链转移产物。IN蛋白可催化此Y形结构分解，重新形成游离的病毒末端及宿主细胞DNA片段，完成去整合(disintegration)反应。将15 bp AE157的5′端标记，电泳后可显示30 bp的去整合产物(图1C、2C，见第I页)。
2.2 ScFv对IN活性的抑制作用 在与IN蛋白以8∶1摩尔浓度比存在时，S16，S18和S27，3个克隆的ScFv，对IN的3种生物学活性均具有明显地抑制作用；而无关蛋白(BSA)及抗无关蛋白的ScFv(cScFv)，对IN蛋白的3种生物学活性均无明显影响(图2A～C，见第I页)。对S16，S18和S27的DNA序列分析表明，3个菌株的VL和VH区基因序列完全相同，说明此3个克隆同属一个克隆(命名为ScFv A0)。ScFv A0基因全长738bp，共编码246个氨基酸。其中VH由369bp组成，编码123个氨基酸；VL由324bp组成，编码108个氨基酸；在VH和VL之间为编码(Gly4Ser)3连接肽的DNA序列。通过与小鼠免疫球蛋白序列数据库对比，ScFv A0的VH属于小鼠重链可变区家族的V(A)亚型；VL属于小鼠轻链可变区家族κ链的Ⅳ型。ScFv A0的DNA序列及由此推导出的氨基酸序列图3(见第II页)。
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图3 ScFvA0的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of ScFvA0
我们还观察了不同浓度的ScFv AO对IN生物学活性的影响，在与IN蛋白以不同浓度混合(8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，0.5∶1)时，ScFv AO均可完全抑制IN的链转移活性(图4B，见第II页)。在3′端加工及去整合活性中，随着抗体浓度的增高，ScFv A0对IN活性的抑制作用逐渐增强，达到完全抑制时，ScFv A0与IN的摩尔浓度比为4∶1(图4A、4C，见第II页)。
图4 不同浓度的ScFv A0对3′端加工(A)、链转移(B)和去整合活性(C)的抑制作用
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Fig4 Titration of ScFvA0 in 3′-end processing (A), strand transfer (B) and disintegration (C)
1: The filled arrow corresponds to the 5′-end-labeled input substrate. The open arrows indicate the positions of the products; 2: The oligonucleotide substrate was incubated with IN in the absence of ScFv A0; 3～7: ScFv A0 were incubated with IN at different molar ratios to IN.
3 讨论
在宿主细胞胞浆内，HIV的RNA在逆转录酶作用下形成双链cDNA。在IN作用下，病毒的线性DNA与宿主细胞的染色体DNA整合，使得病毒DNA随着宿主细胞染色体DNA一起复制〔2〕。如以IN蛋白抑制剂阻断这一整合过程，势必可干扰HIV在人体内的复制，从而起到治疗AIDS的作用。但IN蛋白的难溶性使其晶体结构及活性位点的天然构象尚未完全明确，IN抑制物的发展及应用也受到限制〔1〕。由于抗体分子可特异性与抗原分子结合而影响其功能，因此，利用IN蛋白特异性的抗体来阻断其生物学活性，可能为AIDS治疗的重要途径。ScFv为近年来出现的基因工程抗体，具有特异性强、分子小、穿透力强、代谢快、对人体免疫源性弱和容易制备等特点〔6〕。研制HIVIN的ScFv，观察其对IN生物学活性的抑制作用，及对HIV在细胞内复制的影响，对探索艾滋病治疗的新方法具有重要意义。
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以人工合成的寡核苷酸为底物，利用同位素或生物素进行选择性标记，在天然或重组的HIV整合酸催化下，可在体外模拟HIV病毒DNA与宿主DNA的整合过程，为研究IN的结构及生物学活性，以及筛选IN的抑制剂提供简易的方法〔5〕。
本研究结果表明，IN蛋白的ScFv可明显抑制IN的3′端加工、链转移及去整合活性。我们推测，ScFv阻断IN活性的原理可能有：①作用于IN分子的DNA结合部位，影响IN与病毒线性底物的结合；②与IN分子的催化活性基团结合，阻断其催化活性；③IN蛋白至少以二聚体的形式发挥其生物学活性〔7〕。ScFv可通过干扰IN蛋白的多聚体形成而抑制其活性；④结合于IN分子某一表位的抗体可影响该表位周围，甚至影响酶分子构象而改变其活性。作用于IN不同表位的ScFv，可能通过以上一种或几种机制来抑制IN生物学活性的发挥。
实验结果还表明，ScFv可完全抑制3′端加工及去整合反应所需ScFv的浓度高于链转移活性。Barsov的研究结果曾表明，IN的3种生物学活性对反应中IN浓度的要求不同。当反应中IN浓度为0.34μmol/L时，链转移活性已不能测出；而3′端加工及去整合活性在0.0425 μmol/L的IN蛋白存在时仍可检出〔8〕。由于ScFv与IN蛋白结合时，不仅可使处于游离状态的IN分子浓度减低，也可能使IN的DNA结合及多聚体形成能力等受到影响。因此，与3′端加工及去整合反应相比，链转移反应中对IN浓度或空间构象的要求可能更高。
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本研究显示，IN蛋白的ScFv可明显抑制IN蛋白的体外生物学活性，此结论为ScFv作为IN抑制剂的可能性提供了依据。目前，我们正在试图获得作用于IN不同表位的ScFv，并努力将ScFv基因在细胞内高效表达，以进一步研究ScFv对HIV在细胞内复制的影响及其作用机制。
作者简介：张健慧,女，34岁，助研，博士。北京市太平路27号，Tel.(010)-66932308
参考文献
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收稿：1998-08-03
修回：1998-09-06, 百拇医药