丙型肝炎病毒非结构蛋白3人源单链抗体的筛选与鉴定
作者：钟彦伟 成军 刘妍 董菁 杨继珍 张玲霞
单位：100039 北京，解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心
关键词：噬菌体展示技术；丙型肝炎病毒非结构蛋白3；亲和筛选；单链噬菌体抗体
中华传染病杂志000203 【摘要】 目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白(NS)3的人单链抗体(ScFv)，以解决鼠单抗的免疫原性问题，为HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组的HCV NS3为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的HCV NS3人单链抗体(ScFv片段)阳性克隆，并对其进行免疫及序列测定。结果 筛选出来的ScFv片段具有抗NS3的特异性。结论 利用噬菌体抗体库技术，成功获得HCV NS3人单链抗体ScFv片段。
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Screening and characterization of human phage antibody with single-chain variable fragment specific to hepatitis C nonstructural 3 protein
ZHONG Yanwei, CHENG Jun, LIU Yan, et al.
(Gene Therapy Research Centre, Institute of Infectious Diseases, The 302nd Hospital of PLA, Beijing 100039, China)
【Abstract】 Objective Screening and characterization of human phage antibody with single-chain variable fragment (ScFv) specific to hepatitis C nonstructural 3 protein( NS3). Methods The recombinant phages were panned by NS3 coated in a microtiter plate and 66 clones were determined specific to NS3 after five rounds of biopanning. The specificity of single-chain variable fragment(ScFv) from the monoclonal antibody was determined by ELISA. Results NS3 phage antibody with ScFv has a specific combination character with hepatitis C virus NS3 antigen. Conclusion Human single chain antibody with ScFv specific to hepatitis C NS3 has been identified by means of the phage display technology.
, 百拇医药
【Key words】Phage display; Hepatitis C virus nonstructural 3 protein; Biopanning; Single-chain variable fragment phage antibody
丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白(NS)3是HCV基因组编码的一种最为重要的具有多种生物学活性的非结构蛋白质[1-3]。噬菌体展示技术，是近年来出现的一种新技术，它是将外源蛋白基因通过与丝状噬菌体外壳蛋白基因融合而将外源蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，该技术将表型和基因型联系在一起，将识别相应抗原和进行再扩增的能力结合起来，不经人体免疫，绕过杂交瘤，仅仅通过几轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选富集过程，即可得到人源化的单链抗体[4，5]。
我们利用重组的HCV NS3为包被抗原，从噬菌体抗体库中筛选出了结合活性较强的HCV NS3人源单链噬菌体抗体，并对其进行了DNA序列测定。
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材料和方法
一、材料
HCV NS3抗原为大肠杆菌表达的重组纯化抗原蛋白，纯度在95%以上。人噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接的抗体文库[5]。M13K07购于Pharmacia公司，Wizard质粒DNA提取纯化试剂盒购于Promega公司。其他试剂均为国产分析纯。
二、特异性HCV NS3人源单链噬菌体抗体的筛选
首先将抗体库扩增活化，用噬菌体M13K07侵染后37℃培养12 h，浓缩噬菌体。用HCV NS3抗原(80 μg/ml)包被Nunc培养板，包被液为0.05 mol NaHCO3,pH9.6缓冲液，以小牛血清白蛋白37℃封闭2 h后加入浓缩的噬菌体，室温90 min，用PBST和PBS各快速洗涤20次，以0.1 mol三乙胺洗脱已吸附在平皿上的噬菌体，然后用1 mol Tris(pH7.4)中和，再感染对数生长期的大肠杆菌TG1，培养扩增使噬菌体抗体得到富集。继续重复5次上述“吸附、洗脱、扩增”过程。
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三、单链噬菌体抗体阳性克隆的筛选及鉴定
将最后一轮筛选得到的重组菌涂平皿，从中挑选66株单克隆菌株。置于2×TY(氨苄西林100 mg/L)中，37℃培养过夜。加入辅助噬菌体侵染后，30℃培养过夜。上清液用于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。对筛选得到的阳性克隆重复ELISA检测过程。由于纯化的HCV NS3蛋白保存于含有小牛血清白蛋白中，因而从理论上来讲有可能筛选到小牛血清白蛋白特异性的单链噬菌体抗体。以小牛血清白蛋白作为包被抗原，结合交叉反应情况，最后确定2株识别NS3的特异性克隆。
四、阳性克隆株DNA序列测定
对筛选得到的阳性克隆菌株按照Wizard质粒DNA纯化试剂盒方法提取质粒，由赛百盛生物工程公司采用双脱氧末端终止法，用PE公司ABI 377型仪器进行DNA序列测定。
结果
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一、噬菌体抗体库的筛选
以固相化的重组HCV NS3作为抗原，对噬菌体抗体库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选。噬菌体抗体的富集结果见表1。从固相平板洗脱下来的噬菌体数显示了明显的增加趋势，在第5轮筛选后结合到包被NS3抗原平皿的噬菌体与第1轮相比，富集了300倍(富集倍数=第5轮产出率/第1轮产出率)。
表1 亲和吸附筛选对噬菌体抗体的富集 筛选次数
噬菌体数
产出率
投入
捕获
第1轮
2.0×1013
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3.0×108
1.5×10-5
第2轮
2.0×1013
2.4×109
1.2×10-4
第3轮
2.5×1012
2.6×109
1.1×10-3
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第4轮
3.0×1012
7.0×109
2.3×10-3
第5轮
2.0×1012
9.1×109
4.5×10-3
注：产出率=洗脱的噬菌体数量/所用的噬菌体数量 二、对噬菌体抗体的鉴定
从第5轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选66个克隆，用ELISA测定上清液中噬菌体抗体与NS3抗原结合活性。其中有19株ELISA的A值较高。对这些噬菌体抗体进行交叉反应试验后，确定有6株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复试验的A值，最后确定2株阳性克隆。如图1所示。
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1～6 噬菌体抗体；7 阳性对照；8 阴性对照
图1 6株HCV NS3噬菌体单链抗体的ELISA法鉴定结果
三、阳性克隆株DNA序列测定
对筛选得到的阳性克隆菌株提取质粒，由赛百盛生物工程公司进行DNA序列测定。结果如图2所示。
图2 HCV NS3特异性ScFv基因序列及编码产物
讨论
HCV NS3是HCV基因组编码的一种最为重要的具有多种生物学活性的非结构蛋白质。其丝氨酸蛋白酶的生物学作用在HCV蛋白的成熟过程中具有重要作用，而且还推测与肝细胞内原癌基因蛋白的裂解激活有关。HCV NS3蛋白还具有RNA解旋酶(helicase)的生物学活性，因而在RNA的复制过程中也具有十分重要的作用[1]。除此之外，NS3在HCV的致病过程中也是重要的调节因素，最近发现NS3在肝细胞恶性转化中起重要作用[6]。因此，抗HCV治疗研究中靶向NS3的抗体研究具有十分重要的意义。近年来，随着噬菌体展示技术研究的不断发展，人们正广泛应用该技术研制各种人源噬菌体单链抗体。单链抗体仅为完整抗体的六分之一，因其具有分子小，容易进入病灶周围的微循环及在肾脏内清除快等优点，在疾病的治疗方面引起广泛重视。我们以NS3包被为固相抗原在第5轮筛选后，使结合NS3的噬菌体富集了300倍。实验表明从噬菌体抗体库中筛选出的HCV NS3人源单链可变区抗体，具有较强的结合活性，且该方法具有简便、快速、经济等特点，避免了利用杂交瘤技术制备该抗体周期长、尤其是存在鼠源性蛋白反应的问题[7]。ELSIA和免疫组化鉴定，筛选得到的NS3单克隆抗体具有较高的抗原结合活性和较好的特异性。
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蛋白酶的抑制剂在抗人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染的治疗中具有十分重要的作用和地位[8]。因而人们推测通过寻找HCV NS3丝氨酸蛋白酶的抑制剂，可能是探索抗HCV治疗方法的重要途径。在HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究中，Dimasi等[9]应用噬菌体展示肽库技术，筛选到了最小抗体样蛋白，又称微抗体(minibody)，对HCV NS3的丝氨酸蛋白酶活性具有很强的阻断作用。这些微抗体在微摩尔浓度的条件下即表现出很强的NS3丝氨酸蛋白酶的特异性抑制作用。Martin等[10]从噬菌体展示肽库中筛选到了可变区抗体片段，对于NS3丝氨酸蛋白酶活性也具有很强的特异性抑制作用。因此，噬菌体展示肽库的亲和筛选程序，在NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的筛选过程中具有重要的应用前景。通过逆转录病毒载体和腺病毒载体，可以将这种单链抗体的编码基因导入到细胞中进行抗HCV的基因治疗。关于HCV NS3单链抗体基因的抗HCV基因治疗研究正在进行之中。
参考文献
, 百拇医药
1，成军，杨守纯，主编.现代肝炎病毒分子生物学.第1版.北京：人民军医出版社，1997.44-76.
2，Urvil PT, Kakiuchi N, Zhou DM, et al. Selection of RNA aptamers that bind specifically to the NS3 protease of hepatitis C virus. Eur J Biochem, 1997,248:130-138.
3，Kumar PK, Machida K, Urvil PT, et al. Isolation of RNA aptamers specific to the NS3 protein of hepatitis C virus from a pool of completely random RNA. Virology, 1997,237:270-282.
, http://www.100md.com 4，Lamarre A, Talbot PJ. Characterization of phage-displayed recombinant anti-idiotypic antibody fragments against coronavirus neutralizing monoclonal antibodies. Viral Immunol, 1997,10:175-182.
5，Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, et al. By-passing immunization, human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol, 1991,222:581-597.
6，Moriya K, Fujie H, Shintani Y, et al. The core protein of hepatitis C virus induces hepatocellular carcinoma in transgenic mice. Nat Med, 1998,4:1065-1067.
, 百拇医药
7，Hoogenboom HR, Brue AP, Hufton SE, et al. Antibody phage display technology and its application. Immunotechnology, 1998,4:1-20.
8，Rondon IJ, Marasco WA. Intracellular antibodies (intrabodies) for gene therapy of infectious diseases. Ann Rev Microbiol, 1997,51:257-283.
9，Dimasi N, Martin F, Volpari C, et al. Characterization of engineered hepatitis C virus NS3 protease inhibitors affinity selected from human pancreatic secretory trypsin inhibitor and minibody repertoires. J Virol, 1997,71:7461-7469.
10，Martin F, Volpari C, Steinkuhler C, et al. Affinity selection of a camelized V(H) domain antibody inhibitor of hepatitis C virus NS3 protease. Protein Eng, 1997,10:607-614.
收稿日期：1999-10-25, 百拇医药
单位：100039 北京，解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心
关键词：噬菌体展示技术；丙型肝炎病毒非结构蛋白3；亲和筛选；单链噬菌体抗体
中华传染病杂志000203 【摘要】 目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白(NS)3的人单链抗体(ScFv)，以解决鼠单抗的免疫原性问题，为HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组的HCV NS3为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的HCV NS3人单链抗体(ScFv片段)阳性克隆，并对其进行免疫及序列测定。结果 筛选出来的ScFv片段具有抗NS3的特异性。结论 利用噬菌体抗体库技术，成功获得HCV NS3人单链抗体ScFv片段。
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Screening and characterization of human phage antibody with single-chain variable fragment specific to hepatitis C nonstructural 3 protein
ZHONG Yanwei, CHENG Jun, LIU Yan, et al.
(Gene Therapy Research Centre, Institute of Infectious Diseases, The 302nd Hospital of PLA, Beijing 100039, China)
【Abstract】 Objective Screening and characterization of human phage antibody with single-chain variable fragment (ScFv) specific to hepatitis C nonstructural 3 protein( NS3). Methods The recombinant phages were panned by NS3 coated in a microtiter plate and 66 clones were determined specific to NS3 after five rounds of biopanning. The specificity of single-chain variable fragment(ScFv) from the monoclonal antibody was determined by ELISA. Results NS3 phage antibody with ScFv has a specific combination character with hepatitis C virus NS3 antigen. Conclusion Human single chain antibody with ScFv specific to hepatitis C NS3 has been identified by means of the phage display technology.
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【Key words】Phage display; Hepatitis C virus nonstructural 3 protein; Biopanning; Single-chain variable fragment phage antibody
丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白(NS)3是HCV基因组编码的一种最为重要的具有多种生物学活性的非结构蛋白质[1-3]。噬菌体展示技术，是近年来出现的一种新技术，它是将外源蛋白基因通过与丝状噬菌体外壳蛋白基因融合而将外源蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，该技术将表型和基因型联系在一起，将识别相应抗原和进行再扩增的能力结合起来，不经人体免疫，绕过杂交瘤，仅仅通过几轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选富集过程，即可得到人源化的单链抗体[4，5]。
我们利用重组的HCV NS3为包被抗原，从噬菌体抗体库中筛选出了结合活性较强的HCV NS3人源单链噬菌体抗体，并对其进行了DNA序列测定。
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材料和方法
一、材料
HCV NS3抗原为大肠杆菌表达的重组纯化抗原蛋白，纯度在95%以上。人噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接的抗体文库[5]。M13K07购于Pharmacia公司，Wizard质粒DNA提取纯化试剂盒购于Promega公司。其他试剂均为国产分析纯。
二、特异性HCV NS3人源单链噬菌体抗体的筛选
首先将抗体库扩增活化，用噬菌体M13K07侵染后37℃培养12 h，浓缩噬菌体。用HCV NS3抗原(80 μg/ml)包被Nunc培养板，包被液为0.05 mol NaHCO3,pH9.6缓冲液，以小牛血清白蛋白37℃封闭2 h后加入浓缩的噬菌体，室温90 min，用PBST和PBS各快速洗涤20次，以0.1 mol三乙胺洗脱已吸附在平皿上的噬菌体，然后用1 mol Tris(pH7.4)中和，再感染对数生长期的大肠杆菌TG1，培养扩增使噬菌体抗体得到富集。继续重复5次上述“吸附、洗脱、扩增”过程。
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三、单链噬菌体抗体阳性克隆的筛选及鉴定
将最后一轮筛选得到的重组菌涂平皿，从中挑选66株单克隆菌株。置于2×TY(氨苄西林100 mg/L)中，37℃培养过夜。加入辅助噬菌体侵染后，30℃培养过夜。上清液用于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。对筛选得到的阳性克隆重复ELISA检测过程。由于纯化的HCV NS3蛋白保存于含有小牛血清白蛋白中，因而从理论上来讲有可能筛选到小牛血清白蛋白特异性的单链噬菌体抗体。以小牛血清白蛋白作为包被抗原，结合交叉反应情况，最后确定2株识别NS3的特异性克隆。
四、阳性克隆株DNA序列测定
对筛选得到的阳性克隆菌株按照Wizard质粒DNA纯化试剂盒方法提取质粒，由赛百盛生物工程公司采用双脱氧末端终止法，用PE公司ABI 377型仪器进行DNA序列测定。
结果
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一、噬菌体抗体库的筛选
以固相化的重组HCV NS3作为抗原，对噬菌体抗体库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选。噬菌体抗体的富集结果见表1。从固相平板洗脱下来的噬菌体数显示了明显的增加趋势，在第5轮筛选后结合到包被NS3抗原平皿的噬菌体与第1轮相比，富集了300倍(富集倍数=第5轮产出率/第1轮产出率)。
表1 亲和吸附筛选对噬菌体抗体的富集 筛选次数
噬菌体数
产出率
投入
捕获
第1轮
2.0×1013
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3.0×108
1.5×10-5
第2轮
2.0×1013
2.4×109
1.2×10-4
第3轮
2.5×1012
2.6×109
1.1×10-3
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第4轮
3.0×1012
7.0×109
2.3×10-3
第5轮
2.0×1012
9.1×109
4.5×10-3
注：产出率=洗脱的噬菌体数量/所用的噬菌体数量 二、对噬菌体抗体的鉴定
从第5轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选66个克隆，用ELISA测定上清液中噬菌体抗体与NS3抗原结合活性。其中有19株ELISA的A值较高。对这些噬菌体抗体进行交叉反应试验后，确定有6株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复试验的A值，最后确定2株阳性克隆。如图1所示。
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1～6 噬菌体抗体；7 阳性对照；8 阴性对照
图1 6株HCV NS3噬菌体单链抗体的ELISA法鉴定结果
三、阳性克隆株DNA序列测定
对筛选得到的阳性克隆菌株提取质粒，由赛百盛生物工程公司进行DNA序列测定。结果如图2所示。
图2 HCV NS3特异性ScFv基因序列及编码产物
讨论
HCV NS3是HCV基因组编码的一种最为重要的具有多种生物学活性的非结构蛋白质。其丝氨酸蛋白酶的生物学作用在HCV蛋白的成熟过程中具有重要作用，而且还推测与肝细胞内原癌基因蛋白的裂解激活有关。HCV NS3蛋白还具有RNA解旋酶(helicase)的生物学活性，因而在RNA的复制过程中也具有十分重要的作用[1]。除此之外，NS3在HCV的致病过程中也是重要的调节因素，最近发现NS3在肝细胞恶性转化中起重要作用[6]。因此，抗HCV治疗研究中靶向NS3的抗体研究具有十分重要的意义。近年来，随着噬菌体展示技术研究的不断发展，人们正广泛应用该技术研制各种人源噬菌体单链抗体。单链抗体仅为完整抗体的六分之一，因其具有分子小，容易进入病灶周围的微循环及在肾脏内清除快等优点，在疾病的治疗方面引起广泛重视。我们以NS3包被为固相抗原在第5轮筛选后，使结合NS3的噬菌体富集了300倍。实验表明从噬菌体抗体库中筛选出的HCV NS3人源单链可变区抗体，具有较强的结合活性，且该方法具有简便、快速、经济等特点，避免了利用杂交瘤技术制备该抗体周期长、尤其是存在鼠源性蛋白反应的问题[7]。ELSIA和免疫组化鉴定，筛选得到的NS3单克隆抗体具有较高的抗原结合活性和较好的特异性。
, http://www.100md.com
蛋白酶的抑制剂在抗人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染的治疗中具有十分重要的作用和地位[8]。因而人们推测通过寻找HCV NS3丝氨酸蛋白酶的抑制剂，可能是探索抗HCV治疗方法的重要途径。在HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究中，Dimasi等[9]应用噬菌体展示肽库技术，筛选到了最小抗体样蛋白，又称微抗体(minibody)，对HCV NS3的丝氨酸蛋白酶活性具有很强的阻断作用。这些微抗体在微摩尔浓度的条件下即表现出很强的NS3丝氨酸蛋白酶的特异性抑制作用。Martin等[10]从噬菌体展示肽库中筛选到了可变区抗体片段，对于NS3丝氨酸蛋白酶活性也具有很强的特异性抑制作用。因此，噬菌体展示肽库的亲和筛选程序，在NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的筛选过程中具有重要的应用前景。通过逆转录病毒载体和腺病毒载体，可以将这种单链抗体的编码基因导入到细胞中进行抗HCV的基因治疗。关于HCV NS3单链抗体基因的抗HCV基因治疗研究正在进行之中。
参考文献
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1，成军，杨守纯，主编.现代肝炎病毒分子生物学.第1版.北京：人民军医出版社，1997.44-76.
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, http://www.100md.com 4，Lamarre A, Talbot PJ. Characterization of phage-displayed recombinant anti-idiotypic antibody fragments against coronavirus neutralizing monoclonal antibodies. Viral Immunol, 1997,10:175-182.
5，Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, et al. By-passing immunization, human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol, 1991,222:581-597.
6，Moriya K, Fujie H, Shintani Y, et al. The core protein of hepatitis C virus induces hepatocellular carcinoma in transgenic mice. Nat Med, 1998,4:1065-1067.
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7，Hoogenboom HR, Brue AP, Hufton SE, et al. Antibody phage display technology and its application. Immunotechnology, 1998,4:1-20.
8，Rondon IJ, Marasco WA. Intracellular antibodies (intrabodies) for gene therapy of infectious diseases. Ann Rev Microbiol, 1997,51:257-283.
9，Dimasi N, Martin F, Volpari C, et al. Characterization of engineered hepatitis C virus NS3 protease inhibitors affinity selected from human pancreatic secretory trypsin inhibitor and minibody repertoires. J Virol, 1997,71:7461-7469.
10，Martin F, Volpari C, Steinkuhler C, et al. Affinity selection of a camelized V(H) domain antibody inhibitor of hepatitis C virus NS3 protease. Protein Eng, 1997,10:607-614.
收稿日期：1999-10-25, 百拇医药