含镧羟基磷灰石涂层材料的细胞相容性研究
作者：张玉梅 傅涛 徐可为 王勤涛
单位：张玉梅(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室 710049)；傅涛(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室 710049)；徐可为(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室 710049)；王勤涛(第四军医大学口腔医学院)
关键词：镧；羟基磷灰石类；涂层；成骨细胞；碱性磷酸酶
实用口腔医学杂志000302〔摘要〕 目的：观察含镧羟基磷灰石作为涂层材料的细胞相容性。 方法：将原代培养的成骨 细胞接种到涂层表面，采用细胞计数观察第1、7、14、21 天细胞在材料表面的附着 、增殖情 况，采用SEM观察细胞在材料表面的形态变化，并且对21 d内细胞的碱性磷酸酶活性进行检 测 。结果：成骨细胞在材料表面的细胞增殖数与对照组间无显著性差 异，细胞在材料表面伸展 良好，粘附牢固，并具有良好的细胞形态及增殖率，碱性磷酸酶活性逐渐增加。 结论：含镧羟基磷灰石涂层材料具有良好的细胞相容性。
, http://www.100md.com
中图分类号：R318.08 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)03-0175-03
Cytocompatibility of implantal material of La-HA coating on titanium
Zhang Yumei, Fu Tao, Xu Kewei, et al.
(State Key Laboratory for Mechanical Be havior of
Metal Materials, Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710049)
〔Abstract〕Objective: To evaluate the cytocompatibility of implant al material o f La-HA coating on titanium in vitro. Methods: Prima ry osteoblast culture was es tablished from rat calvaria. Cell adherence and proliferate on the La-HA coa ting on titanium for 21 d were examined. Morphology of the cells was o bserved by scanning electron microscopy and alkaline phosphatase activity was measured wi th a test kid. Results: Throughout the 21 d period of study, osteoblast proliferate on La-HA coating material was similar to that on tis sue culture polystyrene controls. Osteoblasts could attach, spread and prolifer a te on La-HA coating material. The level of alkaline phosphat ase activity of the cells increased with the pass of culture time. Conclu sions: The coating material of La-HA supports the growth and differe ntiation of osteoblasts in vitro.
, 百拇医药
Key words Lanthanum;Hydroxyapatites; Coats; Osteob last;Alkaline phosphatase▲
钛合金表面的生物陶瓷涂层以其优良的生物学性能已作为种植体材料广泛应用于临床， 目前常用的涂层材料为羟基磷灰石(HA)，但已有文献报道由于涂层工艺及HA稳定性的问题 ，使HA涂层在体内迅速溶解而导致种植体的失败〔1,2〕。本研究在HA中添加了稀土 元素镧 ，使其晶体更加稳定〔3〕，同时采用新的涂层工艺，使其在钛合金表面形成稳定和 牢固的涂 层。在对该涂层材料的细胞毒性进行研究的基础上〔4〕，为进一步观察用含镧羟基 磷灰石涂 层后材料的细胞相容性，本实验在体外研究了该涂层材料与成骨细胞间的相互作用，为进一 步的体内研究提供了理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 含镧羟基磷灰石涂层材料的制备
, 百拇医药
在直径为10 mm，厚1.5 mm的钛表面制备含镧羟基磷灰石 涂层材料La-HA(西安交通大学金属材料强度实验室提供)，将涂层圆片用体积分数(φ)为 75%乙醇超声振荡清洗后，再用三蒸水超声振荡清洗3遍，烘干，60Co辐射灭菌后备 用。
1.2 成骨细胞的培养
本实验应用的成骨细胞来自大鼠颅盖骨，其培养方法见文 献〔4〕。
1.3 细胞在材料表面附着、增殖
将La-HA涂层圆片放入24孔板内，加入1 ml的DMEM培养液 浸泡24 h后，将细胞接种于材料表面，浓度为5×107 /L。无涂层圆片的培养板作为对照 组(Con)；37 ℃，φ(CO2)=5% 的条件下用矿化液(含10 mmol/L β-甘油磷酸钠 、50 mg/L维 生素C的DMEM培养液)培养21 d，细胞分别在接种后第1、7、14和21 天用0.25 g/L胰酶0.3 ml消化 15 min, 再加0.7 ml的DMEM终止消化，充分吹打后，收集消化液。定量后在倒置显微镜下进 行细胞计数，每组重复3次，取平均值。
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1.4 细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性
将上述实验中各时间段的细胞悬液离心、弃上清 ，加入体积分数为0.3% Triton-X100 100 μl，4 ℃过夜，将其移入96孔板内，再加入100 μl 碱性磷酸酶底物液，37 ℃孵育40 min ，加入50 μl 的1 mol/L NaOH终止反应，在酶联免 疫仪上用410 nm波长测吸光度(A)，统计分析。
1.5 细胞在材料表面的形态学观察
将培养至第1、7、14、21 天的涂层圆片分 别取出，用0. 01 mol/L的PBS(pH7.4)洗3遍，体积分数为0.3%戊二醛固定，乙腈梯度脱水，临界点 干燥，喷金，扫描电镜观察。
2 结 果
2.1 细胞在材料表面的附着与增殖
, 百拇医药
图1显示出第1、7、14、21 天成骨细胞在材 料表面附着 及增殖的数量统计。可以看出成骨细胞在材料表面附着及增殖情况良好。第21 天细胞增殖 的数量几乎是第1 天细胞附着数量的6倍。各时间段材料表面的细胞数量与对照组之间无显 著差异(P≥0.05)。
2.2 细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性
通过测量成骨细胞分泌的碱性磷酸酶活性的 相对强弱来表示成骨细胞在材料表面的功能。从第7、14、21 天测试的碱性磷酸酶的吸光度 (A)(图2)可以看出随着培养时间的增加碱性磷酸酶的活性逐渐增强，各时间点与对 照组之间无显著差异(P≥0.05)。
图1 成骨细胞在材料表面附着及增殖数
, 百拇医药
图2 成骨细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性
2.3 成骨细胞在材料表面形态学观察
图3显示扫描电镜下第1、7、14、21 天成 骨细胞在材 料表面的形态。细胞接种在材料表面的第1 天(图3a)伸展良好，多个细胞突起牢固附着在 材 料表面。培养至第7 天(图3b)细胞突起伸展到材料表面的颗粒间，胞浆伸展并包裹材料表 面 的颗粒，在细胞表面也有磷酸钙颗粒形成。第14 天(图3c)细胞分泌基质并连接成网状， 牢 固附着在材料表面及颗粒间。第21 天(图3 d)细胞分泌的细胞外基质更加丰富，贯穿于材 料的颗粒间，材料表面也有再结晶形成。
图3 扫描电镜下成骨细胞在材料表面的形态学观察
3 讨 论
, 百拇医药
含镧的羟基磷灰石是本实验室新研究合成的钙磷陶瓷材料。在对其理化性能及细胞毒性进行 研究的基础上，将其作为涂层材料进行应用基础研究，对发展和完善种植材料具有重要意义 。本实验研究将成骨细胞接种在材料表面，使植入材料与骨组织的主要功能细胞--成骨细 胞相接触，不仅可以考察材料对细胞的影响，而且有助于考察材料与细胞间的相互作用，从 更深层次探讨材料-细胞界面结合机制，使其结果与体内实验更加吻合。
细胞在材料表面的附着是成骨细胞在材料表面发挥功能的前提。体外观察成骨细胞与材料间 的反应是有益的，因为体外实验研究可以较容易观察材料对细胞附着生长的影响，而不易受 到其他系统因素的影响〔5，6〕。 本实验研究即采用体外实验研究的方法，观察到 成骨细胞 可以在含镧羟基磷灰石涂层材料表面附着并增殖良好。扫描电镜观察可以看到成骨细胞在该 涂层材料表面伸展良好并牢固附着在材料表面，细胞突起伸展到材料表面的颗粒间，并且随 着培养时间的延长，细胞分泌大量细胞外基质并连接成网。同时在材料表面及细胞表面有新 的钙磷结晶形成。这说明成骨细胞与该涂层材料间具有良好的相容性。同时本实验还对成骨 细胞在材料表面的功能进行了研究。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的主要特征酶之一，以往常 用检测碱性磷酸酶活性来鉴别成骨细胞〔7〕，观察成骨细胞的功能。本实验结果 表明随着细 胞的增殖，碱性磷酸酶的活性逐渐增强，说明成骨细胞在该涂层材料表面能发挥良好的功能 。通过以上实验研究可以初步认为含镧羟基磷灰石作为涂层材料具有良好的细胞相容性。进 一步的工作需结合体内种植实验观察来综合评价该涂层材料的应用前景。■
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目：59872026
参考文献
[1]Nancollas GH, Tucker BE. Dissolution kinetics characterization of hydr oxyapatite coatings on detal implants. J Oral Implant， 1994，20:221
[2]Lewandowski JA, Johnson CM. Structural failure of osseointegrated implants at the time of restoration. A clinical report. J Prosthet Dent, 1989，62:127
[3]张玉梅，傅涛，徐可为.含镧羟基磷灰石的合成及性能研究.牙体牙髓牙周病学杂志，2000 ,10(3):149
, http://www.100md.com
[4]张玉梅，傅涛，徐可为.含镧羟基磷灰石的细胞毒性研究.牙体牙髓牙周病学杂志,2000,10 (3):152
[5]Matsuda T, Davies JE. The in vitro response of osteoblasts to bioactive glass. Biomaterials， 1987，8:275
[6]Villanueva JE. Nimni ME. Modulation of osteogenesis by isolated calvaria c ells: A model for tissue interactions. Biomaterials， 1990，11:13
[7]Attawia MA. Uhrich KE, Botchwey E. et al Cytotoxicity testing of poly(a nhydride-co-imides) for orthopedic applications， J Biomed Mater Res,1995,2 9:1233
收稿日期：2000-01-25
修稿日期：2000-02-23, http://www.100md.com
单位：张玉梅(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室 710049)；傅涛(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室 710049)；徐可为(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室 710049)；王勤涛(第四军医大学口腔医学院)
关键词：镧；羟基磷灰石类；涂层；成骨细胞；碱性磷酸酶
实用口腔医学杂志000302〔摘要〕 目的：观察含镧羟基磷灰石作为涂层材料的细胞相容性。 方法：将原代培养的成骨 细胞接种到涂层表面，采用细胞计数观察第1、7、14、21 天细胞在材料表面的附着 、增殖情 况，采用SEM观察细胞在材料表面的形态变化，并且对21 d内细胞的碱性磷酸酶活性进行检 测 。结果：成骨细胞在材料表面的细胞增殖数与对照组间无显著性差 异，细胞在材料表面伸展 良好，粘附牢固，并具有良好的细胞形态及增殖率，碱性磷酸酶活性逐渐增加。 结论：含镧羟基磷灰石涂层材料具有良好的细胞相容性。
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中图分类号：R318.08 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)03-0175-03
Cytocompatibility of implantal material of La-HA coating on titanium
Zhang Yumei, Fu Tao, Xu Kewei, et al.
(State Key Laboratory for Mechanical Be havior of
Metal Materials, Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710049)
〔Abstract〕Objective: To evaluate the cytocompatibility of implant al material o f La-HA coating on titanium in vitro. Methods: Prima ry osteoblast culture was es tablished from rat calvaria. Cell adherence and proliferate on the La-HA coa ting on titanium for 21 d were examined. Morphology of the cells was o bserved by scanning electron microscopy and alkaline phosphatase activity was measured wi th a test kid. Results: Throughout the 21 d period of study, osteoblast proliferate on La-HA coating material was similar to that on tis sue culture polystyrene controls. Osteoblasts could attach, spread and prolifer a te on La-HA coating material. The level of alkaline phosphat ase activity of the cells increased with the pass of culture time. Conclu sions: The coating material of La-HA supports the growth and differe ntiation of osteoblasts in vitro.
, 百拇医药
Key words Lanthanum;Hydroxyapatites; Coats; Osteob last;Alkaline phosphatase▲
钛合金表面的生物陶瓷涂层以其优良的生物学性能已作为种植体材料广泛应用于临床， 目前常用的涂层材料为羟基磷灰石(HA)，但已有文献报道由于涂层工艺及HA稳定性的问题 ，使HA涂层在体内迅速溶解而导致种植体的失败〔1,2〕。本研究在HA中添加了稀土 元素镧 ，使其晶体更加稳定〔3〕，同时采用新的涂层工艺，使其在钛合金表面形成稳定和 牢固的涂 层。在对该涂层材料的细胞毒性进行研究的基础上〔4〕，为进一步观察用含镧羟基 磷灰石涂 层后材料的细胞相容性，本实验在体外研究了该涂层材料与成骨细胞间的相互作用，为进一 步的体内研究提供了理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 含镧羟基磷灰石涂层材料的制备
, 百拇医药
在直径为10 mm，厚1.5 mm的钛表面制备含镧羟基磷灰石 涂层材料La-HA(西安交通大学金属材料强度实验室提供)，将涂层圆片用体积分数(φ)为 75%乙醇超声振荡清洗后，再用三蒸水超声振荡清洗3遍，烘干，60Co辐射灭菌后备 用。
1.2 成骨细胞的培养
本实验应用的成骨细胞来自大鼠颅盖骨，其培养方法见文 献〔4〕。
1.3 细胞在材料表面附着、增殖
将La-HA涂层圆片放入24孔板内，加入1 ml的DMEM培养液 浸泡24 h后，将细胞接种于材料表面，浓度为5×107 /L。无涂层圆片的培养板作为对照 组(Con)；37 ℃，φ(CO2)=5% 的条件下用矿化液(含10 mmol/L β-甘油磷酸钠 、50 mg/L维 生素C的DMEM培养液)培养21 d，细胞分别在接种后第1、7、14和21 天用0.25 g/L胰酶0.3 ml消化 15 min, 再加0.7 ml的DMEM终止消化，充分吹打后，收集消化液。定量后在倒置显微镜下进 行细胞计数，每组重复3次，取平均值。
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1.4 细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性
将上述实验中各时间段的细胞悬液离心、弃上清 ，加入体积分数为0.3% Triton-X100 100 μl，4 ℃过夜，将其移入96孔板内，再加入100 μl 碱性磷酸酶底物液，37 ℃孵育40 min ，加入50 μl 的1 mol/L NaOH终止反应，在酶联免 疫仪上用410 nm波长测吸光度(A)，统计分析。
1.5 细胞在材料表面的形态学观察
将培养至第1、7、14、21 天的涂层圆片分 别取出，用0. 01 mol/L的PBS(pH7.4)洗3遍，体积分数为0.3%戊二醛固定，乙腈梯度脱水，临界点 干燥，喷金，扫描电镜观察。
2 结 果
2.1 细胞在材料表面的附着与增殖
, 百拇医药
图1显示出第1、7、14、21 天成骨细胞在材 料表面附着 及增殖的数量统计。可以看出成骨细胞在材料表面附着及增殖情况良好。第21 天细胞增殖 的数量几乎是第1 天细胞附着数量的6倍。各时间段材料表面的细胞数量与对照组之间无显 著差异(P≥0.05)。
2.2 细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性
通过测量成骨细胞分泌的碱性磷酸酶活性的 相对强弱来表示成骨细胞在材料表面的功能。从第7、14、21 天测试的碱性磷酸酶的吸光度 (A)(图2)可以看出随着培养时间的增加碱性磷酸酶的活性逐渐增强，各时间点与对 照组之间无显著差异(P≥0.05)。
图1 成骨细胞在材料表面附着及增殖数
, 百拇医药
图2 成骨细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性
2.3 成骨细胞在材料表面形态学观察
图3显示扫描电镜下第1、7、14、21 天成 骨细胞在材 料表面的形态。细胞接种在材料表面的第1 天(图3a)伸展良好，多个细胞突起牢固附着在 材 料表面。培养至第7 天(图3b)细胞突起伸展到材料表面的颗粒间，胞浆伸展并包裹材料表 面 的颗粒，在细胞表面也有磷酸钙颗粒形成。第14 天(图3c)细胞分泌基质并连接成网状， 牢 固附着在材料表面及颗粒间。第21 天(图3 d)细胞分泌的细胞外基质更加丰富，贯穿于材 料的颗粒间，材料表面也有再结晶形成。
图3 扫描电镜下成骨细胞在材料表面的形态学观察
3 讨 论
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含镧的羟基磷灰石是本实验室新研究合成的钙磷陶瓷材料。在对其理化性能及细胞毒性进行 研究的基础上，将其作为涂层材料进行应用基础研究，对发展和完善种植材料具有重要意义 。本实验研究将成骨细胞接种在材料表面，使植入材料与骨组织的主要功能细胞--成骨细 胞相接触，不仅可以考察材料对细胞的影响，而且有助于考察材料与细胞间的相互作用，从 更深层次探讨材料-细胞界面结合机制，使其结果与体内实验更加吻合。
细胞在材料表面的附着是成骨细胞在材料表面发挥功能的前提。体外观察成骨细胞与材料间 的反应是有益的，因为体外实验研究可以较容易观察材料对细胞附着生长的影响，而不易受 到其他系统因素的影响〔5，6〕。 本实验研究即采用体外实验研究的方法，观察到 成骨细胞 可以在含镧羟基磷灰石涂层材料表面附着并增殖良好。扫描电镜观察可以看到成骨细胞在该 涂层材料表面伸展良好并牢固附着在材料表面，细胞突起伸展到材料表面的颗粒间，并且随 着培养时间的延长，细胞分泌大量细胞外基质并连接成网。同时在材料表面及细胞表面有新 的钙磷结晶形成。这说明成骨细胞与该涂层材料间具有良好的相容性。同时本实验还对成骨 细胞在材料表面的功能进行了研究。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的主要特征酶之一，以往常 用检测碱性磷酸酶活性来鉴别成骨细胞〔7〕，观察成骨细胞的功能。本实验结果 表明随着细 胞的增殖，碱性磷酸酶的活性逐渐增强，说明成骨细胞在该涂层材料表面能发挥良好的功能 。通过以上实验研究可以初步认为含镧羟基磷灰石作为涂层材料具有良好的细胞相容性。进 一步的工作需结合体内种植实验观察来综合评价该涂层材料的应用前景。■
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目：59872026
参考文献
[1]Nancollas GH, Tucker BE. Dissolution kinetics characterization of hydr oxyapatite coatings on detal implants. J Oral Implant， 1994，20:221
[2]Lewandowski JA, Johnson CM. Structural failure of osseointegrated implants at the time of restoration. A clinical report. J Prosthet Dent, 1989，62:127
[3]张玉梅，傅涛，徐可为.含镧羟基磷灰石的合成及性能研究.牙体牙髓牙周病学杂志，2000 ,10(3):149
, http://www.100md.com
[4]张玉梅，傅涛，徐可为.含镧羟基磷灰石的细胞毒性研究.牙体牙髓牙周病学杂志,2000,10 (3):152
[5]Matsuda T, Davies JE. The in vitro response of osteoblasts to bioactive glass. Biomaterials， 1987，8:275
[6]Villanueva JE. Nimni ME. Modulation of osteogenesis by isolated calvaria c ells: A model for tissue interactions. Biomaterials， 1990，11:13
[7]Attawia MA. Uhrich KE, Botchwey E. et al Cytotoxicity testing of poly(a nhydride-co-imides) for orthopedic applications， J Biomed Mater Res,1995,2 9:1233
收稿日期：2000-01-25
修稿日期：2000-02-23, http://www.100md.com