hCG嵌合肽(CP1)基因的化学合成和原核系统表达
作者：徐万祥 邱德义 顾少华 应康 廖矛川 申庆祥 谢毅
单位：徐万祥 邱德义 廖矛川 申庆祥(200032 上海市计划生育科学研究所)；顾少华 应康 谢毅(复旦大学生命科学院遗传所遗传工程国家重点实验室)
关键词：
中华微生物学和免疫学杂志000433 鉴于人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗研究的现状和现代疫苗发展的趋势，我们提出了研制hCG嵌合肽免疫原的生物工程路线，其优点是可以任意组合多种广谱T细胞表位(TCE)和靶抗原的三个线性B细胞表位(BCE)，从而在无需特殊佐剂的情况下达到抗体生成水平高、中和性及亲和性强、无MHC限制的目的。通过生物合成所设计hCG嵌合肽，也便于工厂化生产并降低疫苗成本。
hCG嵌合肽设计：选用外源HBsAg19-33和TT580-599两种TCE(两者间用一段无BCE肽间隔)，进而在此TCE载体肽的C端拼接hCGβ的β5、β9和β8三个线性BCE。编码基因设计：选用编码以上肽的原cDNA片段，并在其串联分子的5′端引入EcoRⅠ位点和起始密码子ATG以及在3′端设置双终止密码子和SalⅠ位点，最后对此hCG嵌合cDNA中的一些非大肠杆菌偏爱密码子作适当碱基调整。
hCG嵌合肽基因合成和表达：首先将正负链各9个合成寡聚核苷酸片段磷酸化(不包括正负链5′端两个片段)，然后分别使正负链对应片段退火复性，再通过酶促反应让相邻的DNA片段分级两两相连。最后一次全基因连接反应液经5%非变性PAGE分离后，割胶回收目的基因。通过合成时预留的5′端EcoRⅠ和3′端SalⅠ粘性末端，使此全长合成基因重组插入pBluescript质粒，转化E.coli TG1后在含X-gal和IPTG的平板上挑取白色菌落。酶切鉴定抽提重组质粒后进行正负链双向DNA测序，结果从8个阳性克隆中筛选出1个插入目的基因无碱基突变的重组子(CP1)。随后将双酶切回收的目的基因片段定向插入pBV221的PRPL启动子下游多克隆区，进而构建了和TG1/pBV221-CP1工程菌。工程菌经42℃热诱导表达后的SDS-PAGE分析表明，CP1嵌合肽在E.coli中获得约占菌体总蛋白10%的表达，特异表达蛋白的相对分子质量为16.5×103，与其推断的理论值相符。而且在Western blot实验中特异表达蛋白能被抗hCGβ多克隆抗体识别。这些结果将为研制hCG疫苗提供有用的资料。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870856)
(收稿日期：2000-02-29), 百拇医药
单位：徐万祥 邱德义 廖矛川 申庆祥(200032 上海市计划生育科学研究所)；顾少华 应康 谢毅(复旦大学生命科学院遗传所遗传工程国家重点实验室)
关键词：
中华微生物学和免疫学杂志000433 鉴于人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗研究的现状和现代疫苗发展的趋势，我们提出了研制hCG嵌合肽免疫原的生物工程路线，其优点是可以任意组合多种广谱T细胞表位(TCE)和靶抗原的三个线性B细胞表位(BCE)，从而在无需特殊佐剂的情况下达到抗体生成水平高、中和性及亲和性强、无MHC限制的目的。通过生物合成所设计hCG嵌合肽，也便于工厂化生产并降低疫苗成本。
hCG嵌合肽设计：选用外源HBsAg19-33和TT580-599两种TCE(两者间用一段无BCE肽间隔)，进而在此TCE载体肽的C端拼接hCGβ的β5、β9和β8三个线性BCE。编码基因设计：选用编码以上肽的原cDNA片段，并在其串联分子的5′端引入EcoRⅠ位点和起始密码子ATG以及在3′端设置双终止密码子和SalⅠ位点，最后对此hCG嵌合cDNA中的一些非大肠杆菌偏爱密码子作适当碱基调整。
hCG嵌合肽基因合成和表达：首先将正负链各9个合成寡聚核苷酸片段磷酸化(不包括正负链5′端两个片段)，然后分别使正负链对应片段退火复性，再通过酶促反应让相邻的DNA片段分级两两相连。最后一次全基因连接反应液经5%非变性PAGE分离后，割胶回收目的基因。通过合成时预留的5′端EcoRⅠ和3′端SalⅠ粘性末端，使此全长合成基因重组插入pBluescript质粒，转化E.coli TG1后在含X-gal和IPTG的平板上挑取白色菌落。酶切鉴定抽提重组质粒后进行正负链双向DNA测序，结果从8个阳性克隆中筛选出1个插入目的基因无碱基突变的重组子(CP1)。随后将双酶切回收的目的基因片段定向插入pBV221的PRPL启动子下游多克隆区，进而构建了和TG1/pBV221-CP1工程菌。工程菌经42℃热诱导表达后的SDS-PAGE分析表明，CP1嵌合肽在E.coli中获得约占菌体总蛋白10%的表达，特异表达蛋白的相对分子质量为16.5×103，与其推断的理论值相符。而且在Western blot实验中特异表达蛋白能被抗hCGβ多克隆抗体识别。这些结果将为研制hCG疫苗提供有用的资料。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870856)
(收稿日期：2000-02-29), 百拇医药