应用干涉相差显微镜观察细菌潜生体繁殖方式的研究
作者：刘俊康 丛延广 王 源 邓国宏 徐启旺
单位：第三军医大学生物波研究中心 重庆，400038
关键词：绿脓杆菌；奇异变形杆菌；细菌繁殖
第三军医大学学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE1999年 第21卷 第1期 VOL 提 要：目的探讨细菌潜生体新的繁殖方式。方法：采用特制的干涉相差显微镜结合显微培养方法，动态观察绿脓杆菌和奇异变形杆菌潜生体的繁殖过程。结果：这两种细菌的潜生体表现出多位断裂、自旋端位断裂、出芽生长、梳状繁殖等新的繁殖方式。结论：细菌潜生体繁殖方式的多样性可能有助于种系稳定。
中图法分类号：Q935；R378.991
Observation on multiplication pattern of bacterial cryptic growth cells with interference phase-contrast microscope
, http://www.100md.com
Liu Junkang, Cong Yangguang, Wang Yuan, Deng Guohong, Xu Qiwang
(Research Center of Biological Wave, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To explore the new multiplication pattern of bacterial cryptic growth cells (CGCs). Methods: The interference phase-contrast microscope and special culture plate were employed in the dynamic observation on the multiplicational process of CGCs of pseudomonas aeruginosa (PA) and proteus mirabilis (PM). Results: The CGCs of PA and PM multiplied in form of multi-point blast, rotating end blast, schizogenesis and comb-shaped growth. Conclusion: The interference phase-contrast microscope is very helpful to the dynamic study on bacterial growth and the diversifying of bacterial multiplication might contribute to the stability of species.
, http://www.100md.com
Key words Pseudomonas aeruginosa; Proteus mirabilis; bacterial multiplication
细菌主要以二分裂方式进行增殖，据此Pritchard[1]提出群体细菌生长的四个生长阶段划分，即：延缓期、对数期、稳定期、衰退期，这对研究微生物生长特别是对微生物生理学研究有重要作用。林特夫[2]认为L型细菌可以出芽生长；也有报道白喉杆菌表现节段性生长。这些工作为探索细菌特殊的繁殖方式提供了思路。本文作者所在实验室观察到群体细菌节律性波动生长过程中表现潜-生序变化[3],潜生体(Cryptic growth cell,CGC)可以回复到繁殖体,并表现新的繁殖方式，本文改进方法对此进行了实验观察。
1 材料与方法
1.1 菌种
, http://www.100md.com
PA血清8型，成都生物制品研究所提供，奇异变形杆菌为本实验室分离保存菌种，生化特点为：乳糖(-),葡萄糖(+)，H2S(±)，尿素酶(+),靛基质(-)，动力(+)，苯丙氨酸酶(+)，氧化酶(-)。
1.2 显微镜
重庆光学仪器厂研制改造的干涉相差显微镜，配制25倍及40倍相差盘及相应相差镜头和倒置显微镜落射光源。
1.3 特制培养皿制备及培养基
选取薄底培养皿,平皿底厚度小于1.5 mm,平皿直径约4.0 cm。平皿盖内壁加入1.5 ml含30%丙烯酰胺和0.8%双丙烯酰胺的胶母液,并加入10%TEMED、10%AP各10 μl上面轻轻覆盖蒸馏水，以隔绝氧气，待凝胶形成后，倒去上层水液，倒置，使表面无多余水份，备用。培养基采用0.5%琼脂糖的波动Ⅰ号培养基。
, http://www.100md.com
1.4 观察方法
采用郭刚等[4]的方法制备CGCs。将CGCs稀释后涂布于制备好的培养基上，加含有薄层聚丙烯胺凝胶的培养皿盖，37℃保温观察，并作记录。
2 结果
2.1 多位断裂
纤细状绿脓杆菌CGCs 37℃显微培养4h，可表现出多位点断裂生长方式，即菌体多个位点相继断裂，生成众多的断裂细菌个体，见图1。
图1 绿脓杆菌潜生体多位断裂生长 (×250)
Fig 1 Multi-point blast growth of PA CGCs (×250)
, 百拇医药
2.2 自旋端位断裂
奇异变形杆菌CGCs在显微培养约2～3h后,可出现较多的自旋小体。在其持续旋转运动过程中，可以从菌体末端开始断裂生成短杆菌,后者可离开自旋小体或停留在自旋小体中心，见图2。
图2 奇异变形杆菌自旋端位断裂生长 (×400)
Fig 2 The rotating end-blast growth of
proteus mirabilis (×400)
2.3 出芽
奇异变形杆菌CGCs在菌体侧面生出小的突起，并逐渐长大，最后也可通过断裂方式形成小群集结构。绿脓杆菌潜生体的繁殖过程也观察到出芽、分枝生长的方式，见图3、4。
, 百拇医药
图3 绿脓杆菌潜生体出芽生长初期 (×250)
Fig 3 The early stage of schizogenesis growth of PA CGCs (×250)
图4 绿脓杆菌潜生体出芽生长后期 (×250)
Fig4 The final stage of schizogenesis growth of PA CGCs (×250)
2.4 梳状繁殖
奇异变形杆菌CGCs与绿脓杆菌(GCs)繁殖的子代均可迅速地生成纤细状CGCs，往往排列成梳状结构。
3 讨论
, 百拇医药
采用干涉相差显微镜倒置光源观察CGCs的繁殖方式，光源充足，分辨率高，有助于详细观察繁殖方式及其过程。采用固体培养皿方法，既有助于观察也固定了细菌繁殖后的菌落位置，又能清楚分析繁殖过程和特点。用倒置显微镜可以在培养基上加盖观察，有利于保湿保温，特制培养皿盖内壁因加有透明的聚丙烯酰胺凝胶，使观察过程中培养皿中水汽蒸发较少，且不在培养皿盖上冷凝形成水雾，故有利于持续动态观察。实验时间内生态条件稳定不会影响实验结果。
细菌CGC的繁殖方式展示出生物繁殖多样性的特点。这种多样性可能有利于细菌在不利环境中采取相应特殊增殖方式，保存自身、保存种系，是生物种系稳定的一种方式。近年来，我们在人体感染组织标本中检测出细菌的CGC，也看到了CGC在体外形成CGC的稳定性传代特点，这种方式可能与致病关系密切。随着研究深入，对CGC繁殖方式的研究将显示重要意义。
国家自然科学基金资助项目，NO.39370008
, http://www.100md.com
作者简介：刘俊康，男，30岁，讲师，博士研究生
参考文献
[1] Pritchard R H. Growth: cells and population. in Biochemistry of Bacterial Growth by Joel Mandelstam, Kenneth Mcquillen, I an Dawes. 3 ed. London: Blackwell scientific publications,1982.99～123
[2] 林特夫.细菌的非典型形态与结构.见李影林 主编.临床微生物学及检验.长春：吉林科学技术出版社，1991.21～25
[3] 邓国宏，高强国，王 源，等.绿脓杆菌水中生存复杂性变化观察.第三军医大学学报，1997，19(3):197
[4] 郭 刚，黄春基，王 源，等.抗生素Sub-MICs诱导的纤细菌与潜生体的比较研究.中华流行病学杂志，1997，17(3-C):120
收稿：1998-06-11；修回：1998-12-07, 百拇医药
单位：第三军医大学生物波研究中心 重庆，400038
关键词：绿脓杆菌；奇异变形杆菌；细菌繁殖
第三军医大学学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE1999年 第21卷 第1期 VOL 提 要：目的探讨细菌潜生体新的繁殖方式。方法：采用特制的干涉相差显微镜结合显微培养方法，动态观察绿脓杆菌和奇异变形杆菌潜生体的繁殖过程。结果：这两种细菌的潜生体表现出多位断裂、自旋端位断裂、出芽生长、梳状繁殖等新的繁殖方式。结论：细菌潜生体繁殖方式的多样性可能有助于种系稳定。
中图法分类号：Q935；R378.991
Observation on multiplication pattern of bacterial cryptic growth cells with interference phase-contrast microscope
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Liu Junkang, Cong Yangguang, Wang Yuan, Deng Guohong, Xu Qiwang
(Research Center of Biological Wave, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To explore the new multiplication pattern of bacterial cryptic growth cells (CGCs). Methods: The interference phase-contrast microscope and special culture plate were employed in the dynamic observation on the multiplicational process of CGCs of pseudomonas aeruginosa (PA) and proteus mirabilis (PM). Results: The CGCs of PA and PM multiplied in form of multi-point blast, rotating end blast, schizogenesis and comb-shaped growth. Conclusion: The interference phase-contrast microscope is very helpful to the dynamic study on bacterial growth and the diversifying of bacterial multiplication might contribute to the stability of species.
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Key words Pseudomonas aeruginosa; Proteus mirabilis; bacterial multiplication
细菌主要以二分裂方式进行增殖，据此Pritchard[1]提出群体细菌生长的四个生长阶段划分，即：延缓期、对数期、稳定期、衰退期，这对研究微生物生长特别是对微生物生理学研究有重要作用。林特夫[2]认为L型细菌可以出芽生长；也有报道白喉杆菌表现节段性生长。这些工作为探索细菌特殊的繁殖方式提供了思路。本文作者所在实验室观察到群体细菌节律性波动生长过程中表现潜-生序变化[3],潜生体(Cryptic growth cell,CGC)可以回复到繁殖体,并表现新的繁殖方式，本文改进方法对此进行了实验观察。
1 材料与方法
1.1 菌种
, http://www.100md.com
PA血清8型，成都生物制品研究所提供，奇异变形杆菌为本实验室分离保存菌种，生化特点为：乳糖(-),葡萄糖(+)，H2S(±)，尿素酶(+),靛基质(-)，动力(+)，苯丙氨酸酶(+)，氧化酶(-)。
1.2 显微镜
重庆光学仪器厂研制改造的干涉相差显微镜，配制25倍及40倍相差盘及相应相差镜头和倒置显微镜落射光源。
1.3 特制培养皿制备及培养基
选取薄底培养皿,平皿底厚度小于1.5 mm,平皿直径约4.0 cm。平皿盖内壁加入1.5 ml含30%丙烯酰胺和0.8%双丙烯酰胺的胶母液,并加入10%TEMED、10%AP各10 μl上面轻轻覆盖蒸馏水，以隔绝氧气，待凝胶形成后，倒去上层水液，倒置，使表面无多余水份，备用。培养基采用0.5%琼脂糖的波动Ⅰ号培养基。
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1.4 观察方法
采用郭刚等[4]的方法制备CGCs。将CGCs稀释后涂布于制备好的培养基上，加含有薄层聚丙烯胺凝胶的培养皿盖，37℃保温观察，并作记录。
2 结果
2.1 多位断裂
纤细状绿脓杆菌CGCs 37℃显微培养4h，可表现出多位点断裂生长方式，即菌体多个位点相继断裂，生成众多的断裂细菌个体，见图1。
图1 绿脓杆菌潜生体多位断裂生长 (×250)
Fig 1 Multi-point blast growth of PA CGCs (×250)
, 百拇医药
2.2 自旋端位断裂
奇异变形杆菌CGCs在显微培养约2～3h后,可出现较多的自旋小体。在其持续旋转运动过程中，可以从菌体末端开始断裂生成短杆菌,后者可离开自旋小体或停留在自旋小体中心，见图2。
图2 奇异变形杆菌自旋端位断裂生长 (×400)
Fig 2 The rotating end-blast growth of
proteus mirabilis (×400)
2.3 出芽
奇异变形杆菌CGCs在菌体侧面生出小的突起，并逐渐长大，最后也可通过断裂方式形成小群集结构。绿脓杆菌潜生体的繁殖过程也观察到出芽、分枝生长的方式，见图3、4。
, 百拇医药
图3 绿脓杆菌潜生体出芽生长初期 (×250)
Fig 3 The early stage of schizogenesis growth of PA CGCs (×250)
图4 绿脓杆菌潜生体出芽生长后期 (×250)
Fig4 The final stage of schizogenesis growth of PA CGCs (×250)
2.4 梳状繁殖
奇异变形杆菌CGCs与绿脓杆菌(GCs)繁殖的子代均可迅速地生成纤细状CGCs，往往排列成梳状结构。
3 讨论
, 百拇医药
采用干涉相差显微镜倒置光源观察CGCs的繁殖方式，光源充足，分辨率高，有助于详细观察繁殖方式及其过程。采用固体培养皿方法，既有助于观察也固定了细菌繁殖后的菌落位置，又能清楚分析繁殖过程和特点。用倒置显微镜可以在培养基上加盖观察，有利于保湿保温，特制培养皿盖内壁因加有透明的聚丙烯酰胺凝胶，使观察过程中培养皿中水汽蒸发较少，且不在培养皿盖上冷凝形成水雾，故有利于持续动态观察。实验时间内生态条件稳定不会影响实验结果。
细菌CGC的繁殖方式展示出生物繁殖多样性的特点。这种多样性可能有利于细菌在不利环境中采取相应特殊增殖方式，保存自身、保存种系，是生物种系稳定的一种方式。近年来，我们在人体感染组织标本中检测出细菌的CGC，也看到了CGC在体外形成CGC的稳定性传代特点，这种方式可能与致病关系密切。随着研究深入，对CGC繁殖方式的研究将显示重要意义。
国家自然科学基金资助项目，NO.39370008
, http://www.100md.com
作者简介：刘俊康，男，30岁，讲师，博士研究生
参考文献
[1] Pritchard R H. Growth: cells and population. in Biochemistry of Bacterial Growth by Joel Mandelstam, Kenneth Mcquillen, I an Dawes. 3 ed. London: Blackwell scientific publications,1982.99～123
[2] 林特夫.细菌的非典型形态与结构.见李影林 主编.临床微生物学及检验.长春：吉林科学技术出版社，1991.21～25
[3] 邓国宏，高强国，王 源，等.绿脓杆菌水中生存复杂性变化观察.第三军医大学学报，1997，19(3):197
[4] 郭 刚，黄春基，王 源，等.抗生素Sub-MICs诱导的纤细菌与潜生体的比较研究.中华流行病学杂志，1997，17(3-C):120
收稿：1998-06-11；修回：1998-12-07, 百拇医药