rhTPO/GM-CSF融合蛋白对60Coγ射线照射小鼠造血功能的影响
作者：曹华 葛忠良 张群伟 刘秀珍
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：血小板生长因子；粒-巨噬细胞集落刺激因子；融合蛋白；造血活性
中华放射医学与防护杂志/990413
【摘要】 目的 探索一个新的、具有能同时促进机体红、粒及巨核细胞系造血的细胞因子，以便治疗由化疗和放疗等各种原因引起全血细胞损伤的综合征。方法 所用的细胞因子是本实验室重组的产品，以照射小鼠为模型，给小鼠注射细胞因子后，观察红、粒及巨核细胞的变化。结果rhTPO/GM-CSF融合蛋白对受照射小鼠血象有恢复作用。结论 融合蛋白具有TPO与GM-CSF双重的生物活性。
Influence of rhTPO/GM-CSF fusion protein on hemopoiesis in mice irradiated with 60Co γ-rays
, http://www.100md.com
CAO Hua,GE Zhongliang,ZHANG Qunwei,et al.
Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.
【Abstract】 Objective To find a new biological therapy for secondary hematopoietic failure including anemia,infection and hemorrhage after administration of chemotherapeutic drugs etc. Methods hGM-CSF gene was ligated with hTPO gene isolated from human fetal liver mRNA and a new fusion protein rhTPO/GM-CSF obtained. Results The new fusion protein could promote recovery of peripheral WBC and PLT of 5.0 Gy irradiated mice.BFU-E,CFU-Meg and CFU-GM in bone marrow of mice after irradiation recovered significantly by treatment with rhTPO/GM-CSF fusion protein for 10 days. Conclusion These results suggest that the new fusion protein has the biological activity of both hTPO and hGM-CSF simultaneously and can stimulate the proliferation of megakaryocyte and granulocyte progenitors.
, 百拇医药
【Key words】 TPO GM-CSF rhTPO/GM-CSF Fusion protein Hematopoietic activity
目前，对恶性肿瘤的治疗常用化疗和放疗，但常常引起多种血细胞的减少，虽然已有红细胞生长因子(EPO)、粒-巨噬细胞生长因子(GM-CSF)及血小板生长因子(TPO)等生物因子[1]分别治疗单一的血细胞缺乏症，但对全血细胞减少症的治疗尚有一定的不便。近年来随着分子生物学与基因工程技术的发展，人们不但研究单一的天然生物因子，也已开始构建新的生物因子和融合蛋白，如人干扰素/白细胞介素-2(rIFN-γ/IL-2)、IL-3/GM-CSF(PLXY321)、IFN-γ/肿瘤坏死因子(TNF)、IL-2/IL-6、IL-3/EPO及CH925等具有不同作用的融合蛋白因子的报道[2]。为了获得一个同时具有能促进机体红、粒及巨核细胞系造血的细胞因子，本实验构建了TPO与GM-CSF基因，并获得了TPO/GM-CSF融合蛋白[3]，现就其对60Co γ射线照射小鼠所致造血损伤的影响进行了研究。
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材料和方法
1.材料：①生化试剂购于华美生物试剂公司；②马血清购于天津血液病研究所；③实验动物为上海种小白鼠，雄性，体重18～20 g，购于本院动物中心；④rhTPO/GM-CSF，由本实验室构建与纯化[3]。
2.方法：①rhTPO/GM-CSF融合蛋白生物活性测定。②小鼠造血细胞损伤模型的建立：60Co γ射线一次性照射上海种正常雄性小鼠，吸收剂量为5.0 Gy，造成造血细胞损伤模型。③动物分组及给药方法：实验动物分为3个组，1组为照射对照组，腹腔注射生理盐水；2组为融合蛋白组，腹腔注射200 μg.kg-1.d-1；3组为混合给药组，腹腔注射TPO 200 μg.kg-1.d-1和GM-CSF 50 μg.kg-1.d-1。观察小鼠外周血象及受照射后10天取骨髓培养造血祖细胞。④外周血象的测定：应用F-800微细胞计数仪检测小鼠尾静脉的血红蛋白(Hb)浓度，白细胞(WBC)及血小板(PLT)计数。⑤造血祖细胞的体外培养：取小鼠骨髓有核细胞，按每毫升体系1×105个有核细胞接种于含有10-4mol/L β-巯基乙醇，3%L-谷氨酰胺，10%马血清及0.7 ml 2.7%甲基纤维素的McCoy’s培养体系中，37℃，5%CO2及饱和湿度下培养7天，在光学显微镜下计数BFU-E，CFU-Meg及CFU-GM的集落形成数[4]。⑥数据统计学处理方法：应用单因素的方差分析，以t检验对各组外周血细胞计数及造血祖细胞的形成数进行多个均值间的两两比较[5]。
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结果
1.rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射小鼠外周血血象的影响
(1)rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射小鼠外周血血红蛋白的影响：由于红细胞寿命长，小鼠受照射后Hb浓度基本处于稳定水平。但于照射后第3周可见对照组小鼠的Hb水平下降时，融合蛋白组小鼠的Hb水平维持正常水平(P<0.05)，混合给药组的Hb与对照组差异无显著性，见图1。
图1 rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射损伤小鼠外周血血红蛋白的影响(n=3)
(2)rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射小鼠外周血白细胞数的影响：如图2所示，融合蛋白组并没有预防外周血WBC的下降，但在照射后第3周可促进WBC数的提前恢复，而混合给药组则没有此种作用。
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图2 rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射损伤小鼠外周血白细胞计数的影响(n=3)
(3)rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射小鼠外周血血小板数的影响：PLT计数可见，混合给药组能防止PLT的下降，表示能动员血小板的释放，使血小板升高。但融合蛋白给药组没有像混合给药组那样防止PLT下降，但能促进PLT的恢复(P<0.05)，且能保持血小板于稳定的水平，见图3。
图3 rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射损伤小鼠外周血血小板计数的影响(n=3)
2.rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射小鼠骨髓造血祖细胞数的影响
于60Co γ射线照射后第10天取小鼠骨髓，进行造血祖细胞的体外培养，计数BFU-E,CFU-Meg及CFU-GM集落形成数。混合给药能促进受照射小鼠骨髓BFU-E，CFU-Meg及CFU-GM的早期恢复，融合蛋白对BFU-E和CFU-Meg也有刺激作用(P<0.05)。从照射后第10天骨髓祖细胞培养的角度看，混合给药组较融合蛋白组对红、粒及巨核祖细胞系，具有更高的刺激作用，见图4。
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图4 rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射损伤小鼠骨髓造血祖细胞的影响(n=3)
讨论
文献及本实验室既往的研究结果均可见rhTPO生物学功能是诱导巨核细胞的增殖和分化，促进巨核细胞的发育和成熟及血小板的释放，同时还具有对红细胞系造血的刺激作用[6，7]；rhGM-CSF的生物学功能是诱导和刺激骨髓粒、单系造血，使外周血粒、单核细胞增加[8]。本实验为了获得TPO对红细胞系及巨核细胞系的刺激活性及GM-CSF对粒、单核细胞系的刺激活性，探索治疗临床放、化疗等各种原因的造血组织损伤综合征，利用分子生物学和基因工程技术将TPO基因与GM-CSF基因融合，构建了新的rhTPO/GM-CSF融合蛋白。体外的实验已证明，rhTPO/GM-CSF融合蛋白具有对正常小鼠骨髓的红、粒及巨核细胞3系都有刺激作用[3]。本实验结果可见，rhTPO/GM-CSF融合蛋白能促使受照射小鼠Hb的水平维持正常，促进WBC的早期恢复，能于照射后早期促进PLT的恢复，具有与TPO基本相同的生物活性。TPO与GM-CSF混合给药能更有效地防止照射后PLT的下降，并动员机体内PLT的释放，使小鼠外周血PLT水平升高，考虑与TPO的单药剂量有关。骨髓造血祖细胞的体外培养所见，TPO与GM-CSF混合给药能促进受照射小鼠骨髓BFU-E，CFU-Meg及CFU-GM的早期恢复，rhTPO/GM-CSF融合蛋白对红细胞系及巨核细胞系的造血祖细胞有恢复作用，但未见对粒系祖细胞有作用。需要讨论的是融合蛋白对照射小鼠白细胞的恢复有促进作用(见图2)，混合给药组对外周血白细胞的恢复作用很不明显；而照射后第10天骨髓内造血粒系祖细胞的数量却增加显著，这似乎显示这组的粒系造血祖细胞分化成外周血白细胞有困难，从而使粒系造血祖细胞堆积在骨髓内；而融合蛋白组骨髓内的粒系造血祖细胞不多，而外周血白细胞显著增加，这表明融合蛋白不仅能促进粒系造血祖细胞增加，而且还能促使祖细胞分化成白细胞释放入外周血，这些分析是否正确，尚需今后进一步实验才能得到验证。
, 百拇医药
总之，我们认为rhTPO/GM-CSF融合蛋白在60Co γ射线照射的小鼠动物模型上，对红、巨核及粒细胞系的恢复都有一定的作用，既保留了TPO对红和巨核细胞系造血的刺激作用，又增加了GM-CSF对粒、单细胞系造血的刺激作用，具有TPO与GM-CSF双重的生物活性。rhTPO/GM-CSF融合蛋白的构建为电离辐射、化学药物及生物病源体等因素造成的红细胞、白细胞及血小板减少和缺乏引起的贫血、感染和出血等临床病人的治疗，提供了新的研究方向。
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39670237)
参考文献
1 Ketley NJ,Newland AC.Haemopoietic growth factors.Postgrad Med J,1977,73:215-221.
2 张雪峰，葛忠良.细胞因子融合蛋白的研究进展.国外医学遗传学分册，1996，18：61-64.
, 百拇医药
3 曹华，崔立斌，葛忠良，等.rhTPO/GM-CSF融合蛋白的构建、表达及活性测定.中国实验血液学杂志，1998，6：19-23.
4 刘秀珍.造血祖细胞培养手册，北京：北京科学技术出版社，1992.
5 胡良平.医学统计学方法与SAS应用技巧.北京：中国科学技术出版社，1991.
6 Kaushansky K,Brounely VC,Grossmann A,et al.Thrombopoietin expands erythroid progenitors,increases red cell production,and enhances erythroid recovery after myelosuppressive therapy.J Clin Invest,1995,96:1638-1687.
7 Cao H,Ge ZL,Hu LP,et al.Recombinant human thrombopoietin enhances megakaryocytopoietic and erythropoietin restoration in irradiated mice.J Exp Hematol,1997,5:202-205.
8 Molineux G,Harley C,McElroy P,et al.An analysis of the effects of combined treatment with mGM-CSF and PEG-rHuMGDF in murine bone marrow transplant recipient.Stem Cells,1997,15:43-49.
(收稿:1999-02-24 修回:1999-05-25), 百拇医药
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：血小板生长因子；粒-巨噬细胞集落刺激因子；融合蛋白；造血活性
中华放射医学与防护杂志/990413
【摘要】 目的 探索一个新的、具有能同时促进机体红、粒及巨核细胞系造血的细胞因子，以便治疗由化疗和放疗等各种原因引起全血细胞损伤的综合征。方法 所用的细胞因子是本实验室重组的产品，以照射小鼠为模型，给小鼠注射细胞因子后，观察红、粒及巨核细胞的变化。结果rhTPO/GM-CSF融合蛋白对受照射小鼠血象有恢复作用。结论 融合蛋白具有TPO与GM-CSF双重的生物活性。
Influence of rhTPO/GM-CSF fusion protein on hemopoiesis in mice irradiated with 60Co γ-rays
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CAO Hua,GE Zhongliang,ZHANG Qunwei,et al.
Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.
【Abstract】 Objective To find a new biological therapy for secondary hematopoietic failure including anemia,infection and hemorrhage after administration of chemotherapeutic drugs etc. Methods hGM-CSF gene was ligated with hTPO gene isolated from human fetal liver mRNA and a new fusion protein rhTPO/GM-CSF obtained. Results The new fusion protein could promote recovery of peripheral WBC and PLT of 5.0 Gy irradiated mice.BFU-E,CFU-Meg and CFU-GM in bone marrow of mice after irradiation recovered significantly by treatment with rhTPO/GM-CSF fusion protein for 10 days. Conclusion These results suggest that the new fusion protein has the biological activity of both hTPO and hGM-CSF simultaneously and can stimulate the proliferation of megakaryocyte and granulocyte progenitors.
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【Key words】 TPO GM-CSF rhTPO/GM-CSF Fusion protein Hematopoietic activity
目前，对恶性肿瘤的治疗常用化疗和放疗，但常常引起多种血细胞的减少，虽然已有红细胞生长因子(EPO)、粒-巨噬细胞生长因子(GM-CSF)及血小板生长因子(TPO)等生物因子[1]分别治疗单一的血细胞缺乏症，但对全血细胞减少症的治疗尚有一定的不便。近年来随着分子生物学与基因工程技术的发展，人们不但研究单一的天然生物因子，也已开始构建新的生物因子和融合蛋白，如人干扰素/白细胞介素-2(rIFN-γ/IL-2)、IL-3/GM-CSF(PLXY321)、IFN-γ/肿瘤坏死因子(TNF)、IL-2/IL-6、IL-3/EPO及CH925等具有不同作用的融合蛋白因子的报道[2]。为了获得一个同时具有能促进机体红、粒及巨核细胞系造血的细胞因子，本实验构建了TPO与GM-CSF基因，并获得了TPO/GM-CSF融合蛋白[3]，现就其对60Co γ射线照射小鼠所致造血损伤的影响进行了研究。
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材料和方法
1.材料：①生化试剂购于华美生物试剂公司；②马血清购于天津血液病研究所；③实验动物为上海种小白鼠，雄性，体重18～20 g，购于本院动物中心；④rhTPO/GM-CSF，由本实验室构建与纯化[3]。
2.方法：①rhTPO/GM-CSF融合蛋白生物活性测定。②小鼠造血细胞损伤模型的建立：60Co γ射线一次性照射上海种正常雄性小鼠，吸收剂量为5.0 Gy，造成造血细胞损伤模型。③动物分组及给药方法：实验动物分为3个组，1组为照射对照组，腹腔注射生理盐水；2组为融合蛋白组，腹腔注射200 μg.kg-1.d-1；3组为混合给药组，腹腔注射TPO 200 μg.kg-1.d-1和GM-CSF 50 μg.kg-1.d-1。观察小鼠外周血象及受照射后10天取骨髓培养造血祖细胞。④外周血象的测定：应用F-800微细胞计数仪检测小鼠尾静脉的血红蛋白(Hb)浓度，白细胞(WBC)及血小板(PLT)计数。⑤造血祖细胞的体外培养：取小鼠骨髓有核细胞，按每毫升体系1×105个有核细胞接种于含有10-4mol/L β-巯基乙醇，3%L-谷氨酰胺，10%马血清及0.7 ml 2.7%甲基纤维素的McCoy’s培养体系中，37℃，5%CO2及饱和湿度下培养7天，在光学显微镜下计数BFU-E，CFU-Meg及CFU-GM的集落形成数[4]。⑥数据统计学处理方法：应用单因素的方差分析，以t检验对各组外周血细胞计数及造血祖细胞的形成数进行多个均值间的两两比较[5]。
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结果
1.rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射小鼠外周血血象的影响
(1)rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射小鼠外周血血红蛋白的影响：由于红细胞寿命长，小鼠受照射后Hb浓度基本处于稳定水平。但于照射后第3周可见对照组小鼠的Hb水平下降时，融合蛋白组小鼠的Hb水平维持正常水平(P<0.05)，混合给药组的Hb与对照组差异无显著性，见图1。
图1 rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射损伤小鼠外周血血红蛋白的影响(n=3)
(2)rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射小鼠外周血白细胞数的影响：如图2所示，融合蛋白组并没有预防外周血WBC的下降，但在照射后第3周可促进WBC数的提前恢复，而混合给药组则没有此种作用。
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图2 rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射损伤小鼠外周血白细胞计数的影响(n=3)
(3)rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射小鼠外周血血小板数的影响：PLT计数可见，混合给药组能防止PLT的下降，表示能动员血小板的释放，使血小板升高。但融合蛋白给药组没有像混合给药组那样防止PLT下降，但能促进PLT的恢复(P<0.05)，且能保持血小板于稳定的水平，见图3。
图3 rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射损伤小鼠外周血血小板计数的影响(n=3)
2.rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射小鼠骨髓造血祖细胞数的影响
于60Co γ射线照射后第10天取小鼠骨髓，进行造血祖细胞的体外培养，计数BFU-E,CFU-Meg及CFU-GM集落形成数。混合给药能促进受照射小鼠骨髓BFU-E，CFU-Meg及CFU-GM的早期恢复，融合蛋白对BFU-E和CFU-Meg也有刺激作用(P<0.05)。从照射后第10天骨髓祖细胞培养的角度看，混合给药组较融合蛋白组对红、粒及巨核祖细胞系，具有更高的刺激作用，见图4。
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图4 rhTPO/GM-CSF融合蛋白对照射损伤小鼠骨髓造血祖细胞的影响(n=3)
讨论
文献及本实验室既往的研究结果均可见rhTPO生物学功能是诱导巨核细胞的增殖和分化，促进巨核细胞的发育和成熟及血小板的释放，同时还具有对红细胞系造血的刺激作用[6，7]；rhGM-CSF的生物学功能是诱导和刺激骨髓粒、单系造血，使外周血粒、单核细胞增加[8]。本实验为了获得TPO对红细胞系及巨核细胞系的刺激活性及GM-CSF对粒、单核细胞系的刺激活性，探索治疗临床放、化疗等各种原因的造血组织损伤综合征，利用分子生物学和基因工程技术将TPO基因与GM-CSF基因融合，构建了新的rhTPO/GM-CSF融合蛋白。体外的实验已证明，rhTPO/GM-CSF融合蛋白具有对正常小鼠骨髓的红、粒及巨核细胞3系都有刺激作用[3]。本实验结果可见，rhTPO/GM-CSF融合蛋白能促使受照射小鼠Hb的水平维持正常，促进WBC的早期恢复，能于照射后早期促进PLT的恢复，具有与TPO基本相同的生物活性。TPO与GM-CSF混合给药能更有效地防止照射后PLT的下降，并动员机体内PLT的释放，使小鼠外周血PLT水平升高，考虑与TPO的单药剂量有关。骨髓造血祖细胞的体外培养所见，TPO与GM-CSF混合给药能促进受照射小鼠骨髓BFU-E，CFU-Meg及CFU-GM的早期恢复，rhTPO/GM-CSF融合蛋白对红细胞系及巨核细胞系的造血祖细胞有恢复作用，但未见对粒系祖细胞有作用。需要讨论的是融合蛋白对照射小鼠白细胞的恢复有促进作用(见图2)，混合给药组对外周血白细胞的恢复作用很不明显；而照射后第10天骨髓内造血粒系祖细胞的数量却增加显著，这似乎显示这组的粒系造血祖细胞分化成外周血白细胞有困难，从而使粒系造血祖细胞堆积在骨髓内；而融合蛋白组骨髓内的粒系造血祖细胞不多，而外周血白细胞显著增加，这表明融合蛋白不仅能促进粒系造血祖细胞增加，而且还能促使祖细胞分化成白细胞释放入外周血，这些分析是否正确，尚需今后进一步实验才能得到验证。
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总之，我们认为rhTPO/GM-CSF融合蛋白在60Co γ射线照射的小鼠动物模型上，对红、巨核及粒细胞系的恢复都有一定的作用，既保留了TPO对红和巨核细胞系造血的刺激作用，又增加了GM-CSF对粒、单细胞系造血的刺激作用，具有TPO与GM-CSF双重的生物活性。rhTPO/GM-CSF融合蛋白的构建为电离辐射、化学药物及生物病源体等因素造成的红细胞、白细胞及血小板减少和缺乏引起的贫血、感染和出血等临床病人的治疗，提供了新的研究方向。
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39670237)
参考文献
1 Ketley NJ,Newland AC.Haemopoietic growth factors.Postgrad Med J,1977,73:215-221.
2 张雪峰，葛忠良.细胞因子融合蛋白的研究进展.国外医学遗传学分册，1996，18：61-64.
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3 曹华，崔立斌，葛忠良，等.rhTPO/GM-CSF融合蛋白的构建、表达及活性测定.中国实验血液学杂志，1998，6：19-23.
4 刘秀珍.造血祖细胞培养手册，北京：北京科学技术出版社，1992.
5 胡良平.医学统计学方法与SAS应用技巧.北京：中国科学技术出版社，1991.
6 Kaushansky K,Brounely VC,Grossmann A,et al.Thrombopoietin expands erythroid progenitors,increases red cell production,and enhances erythroid recovery after myelosuppressive therapy.J Clin Invest,1995,96:1638-1687.
7 Cao H,Ge ZL,Hu LP,et al.Recombinant human thrombopoietin enhances megakaryocytopoietic and erythropoietin restoration in irradiated mice.J Exp Hematol,1997,5:202-205.
8 Molineux G,Harley C,McElroy P,et al.An analysis of the effects of combined treatment with mGM-CSF and PEG-rHuMGDF in murine bone marrow transplant recipient.Stem Cells,1997,15:43-49.
(收稿:1999-02-24 修回:1999-05-25), 百拇医药