细菌防护液对60Co γ射线照射小鼠骨髓细胞生物学效应的影响
作者：徐书显 张凤云 王常有 王忠海 赵进沛 赵娟
单位：张凤云 王忠海 赵娟(河北医科大学生物学教研室)；徐书显 王常有 赵进沛(北京军区军事医学研究所，石家庄 050081)
关键词：细菌防护液；γ射线照射；骨髓细胞；流式细胞仪
卫生研究000406 摘要：探讨细菌防护液(BPL)与受60Co γ射线照射小鼠骨髓细胞生物学效应的关系。应用流式细胞仪(FCM)检测细胞的凋亡指数和免疫参数(CD4+,CD8+,NK)。结果显示BPL能够降低细胞凋亡率，同时提高细胞的增殖率(P<0.01)。其作用机制可能与提高NK细胞活性和CD4+、CD8+数量有关。进一步证实，BPL对辐射损伤细胞有一定的保护作用。
中图分类号：R818.74 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-8020(2000)04-0207-02
Effects of bacterial protective liquid on radiation biology effect
of mouse bone marrow cells
Xu Shuxian, Zhang Fengyun,Wang Changyou, Wang Zhonghai, et al.
(Institute of Military Medicine Chinese PLA,Shijiazhuang 050081,China)
Abstract：To study the relationship between bacterial protective liquid (BPL) and the biological effect of mouse bone marrow cells by γ-ray irradiation, apoptosis and the number of CD4+,CD8+and NK cells were analyzed by flow cytometry(FCM).the results showed that BPL decreased the apoptosis and increased the proliferation of cells(P<0.01).The theorem of action was related with raising the percentage vitality of NK cells and the quantity of CD4+ and CD8+.This study proved that BPL might have protective effect against radiation injuriy.
, 百拇医药
Key words:bacterial protective liquid, γ-ray irradiation, bone marrow cells,flow cytometry
随着医疗保健事业的发展，电离辐射源和放射性核素在医疗中的应用日益广泛，放射诊断与治疗的新技术、新设备不断出现，在提高疾病诊治水平的同时，也增加了人类受电离辐射照射剂量的负担，从而会引起人体不同程度的辐射损伤。如何对电离辐射进行防护，已日益受到各界的重视[1，2]。我们研制的细菌防护液就是其中的一种防护措施，初步证明，它能延长小鼠的存活率[3]。该项研究主要是采用流式细胞术(FCM)对小鼠骨髓细胞进行多参数的研究，为细菌防护液用于临床提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 稀土半胱氨酸化合物 北京稀土农用开发中心提供。
, http://www.100md.com
1.1.2 蕈状芽胞杆菌 本所分离，经中科院微生物所鉴定。1.1.3 细菌防护液(简称BPL) 在普通培养基中加入一定量的稀土化合物，再接种一定量的菌株，经37℃培养，使菌量达到1×108 cfu/ml，备用。
1.1.4 实验动物 昆明种小鼠，体重(20±1.5)g，雌性，由河北省实验动物中心提供，达一级实验动物卫生标准。随机分为正常对照组、单纯照射对照组、防护液A组和B组，每组6只。
1.2 方法
1.2.1 给药方式 采取灌胃法，2个对照组分别给予0.5ml的生理盐水，防护液A组和B组分别给予0.5和0.25ml BPL，每天1次，照射前后各服药8天。
1.2.2 照射条件 60Co γ射线照射，剂量率为0.794Gy/min，总剂量3.5Gy，全身一次性照射。
, 百拇医药
1.2.3 骨髓细胞的制备 将小鼠断颈处死，剥取双侧股骨，尽量冲出全部骨髓细胞滴入含肝素(1 000 U/ml)的PBS液中，总量2.0ml。再用PBS液离心、洗涤，最后将细胞以70%乙醇固定，即可进行细胞DNA荧光和免疫荧光标记染色，染色方法见文献[4]。
1.2.4 流式细胞仪检测方法[4] 应用FACS-420型流式细胞仪(美国BD公司)进行检测，数据和图像输入HP-300 Consort 30计算机，应用相应程序软件分别进行资料处理。测定前以鸡红细胞作为标准样品调整仪器的变异系数(CV)在5%以内，确保仪器的精度。上机后每份标本检测10 000个细胞，所得数据采用t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 BPL对细胞周期的影响
表1显示，单纯照射组与防护液组相比，2个防护液组的G0/G1期细胞比例下降，而S、G2/M期细胞比例均有不同程度的升高，表明BPL可促进骨髓细胞的分裂增殖，加速骨髓细胞的修复。但S期的差别不显著。这主要是由于单纯照射组经过8天的自行修复。
, 百拇医药
表1 各组细胞周期的变化(
±s)% 组别
G0/G1
S
G2/M
正常对照组
78.73±6.38
10.69±2.63
10.58±3.78
单纯照射组
79.97±3.20
, 百拇医药
10.87±3.04
9.16±1.04
防护液A组
73.43±2.74(1)
12.45±1.69(2)
14.13±1.39(1)
防护液B组
73.11±0.27(1)
13.26±0.13(2)
13.63±0.40(1)
, http://www.100md.com
注：与单纯照射组比较(1) P<0.01，(2) P>0.05
2.2 BPL对细胞周期中DNA含量的影响
FCM应用最多的领域是肿瘤细胞DNA含量的定量研究，并发现DNA含量这一参量与肿瘤的恶性分级、预后和治疗等有一定的关系。DNA含量在细胞内所有参数中比较恒定，在细胞周期中DNA含量随各时相发生周期变化。如果DNA含量发生微小的异常变化，则有可能导致恶性肿瘤的产生[4]。表2显示，每期各组之间的DNA含量差异无显著性(P>0.05)。说明BPL可能没有致癌、致畸和致突变的作用。为了进一步验证这一结论，我们还探讨了细菌防护液对小鼠精子形态和红细胞微核率的影响。结果是该菌液无致畸作用并有抗突变功能[5，6]。
表2 细胞周期中DNA含量的测定(±s)(1)% 组别
, http://www.100md.com
G0/G1
S
G2/M
正常对照组
57.33±3.21
68.00±1.73
106.67±8.08
单纯照射组
58.67±0.58
69.67±0.58
111.00±3.46
, 百拇医药
防护液A组
58.67±1.53
69.33±0.58
112.67±3.06
防护液B组
58.50±0.71
70.50±0.71
110.50±0.71
注：(1)各期中每组之间相比P>0.05
2.3 BPL对细胞凋亡率和增殖率的影响
表3结果显示，经照射后，细胞的凋亡率明显增加，BPL对细胞的凋亡有一定保护作用，同时能够提高细胞的增殖率。表3 细胞凋亡率和增殖率测定(±s)% 组别
, 百拇医药
凋亡率
增殖率
正常对照组
2.03±0.25(1)
21.27±6.41
单纯照射组
14.03±3.09
20.03±2.08
防护液A组
7.27±1.27(1)
26.58±3.03(1)
, 百拇医药
防护液B组
6.00±0.57(1)
26.89±0.53(1)
注：(1)与单纯照射组相比P<0.01
2.4 BPL对细胞亚群的影响
测定T细胞亚群的相对标记率(见表4)，结果显示，单纯照射组的NK细胞、CD4+和CD8+明显低于正常对照组,而BPL能显著的提高它们的活性。
表4 BPL与NK细胞和T细胞亚群的关系(±s))% 组别
, http://www.100md.com
NK
CD4+
CD8+
CD4+CD8+
正常对照组
23.20±2.19(1)
33.30±3.18(1)
29.13±2.03(1)
1.14±0.06
单纯照射组
, 百拇医药
15.87±1.76
27.63±1.40
23.20±0.87
1.19±0.10
防护液A组
24.27±1.10(1)
39.13±4.30(1)
29.37±3.19(1)
1.33±0.11(2)
防护液B组
, 百拇医药 20.20±1.56(1)
34.00±1.00(1)
27.10±2.69(1)
1.26±0.13
注：与单纯照射组比(1)P<0.01 (2)P<0.05
3 讨论
本次实验采用目前较先进的技术FCM，对经60Coγ射线照射的小鼠骨髓细胞进行多参数定量分析。结果显示，BPL能显著的降低细胞的凋亡率，并能提高细胞的增殖率。从一个侧面可以说明BPL对辐射损伤有一定的防护作用。其作用机制可能是，稀土刺激细菌生长的同时，也能提高NK细胞活性和CD4+、CD8+的数量。另外，菌液中可能含一定量的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶，从而与提高机体免疫能力和增强免疫调节功能及保护造血系统有关。
, 百拇医药
T淋巴细胞按表型不同可分为CD4+和CD8+两大亚群，它们均能分泌多种细胞因子，在机体中主要承担细胞免疫功能，同时协助和参与机体的体液免疫及免疫调节[7]，在抗感染、抗肿瘤、抗衰老和抗辐射等生命过程中发挥着十分重要的作用。NK细胞对机体的免疫和造血系统也有重要的调节作用。T淋巴细胞对辐射最敏感，而NK细胞则有一定的辐射抗性。这2种细胞的数量及活性变化对被辐射机体的保护及恢复具有十分重要的意义。
(致谢：河北医科大学第四临床医学院肿瘤所左连富主任医师对该项研究给予指导和帮助，特此感谢)
基金项目：“九五”全军面上项目指令课题
作者简介：徐书显，男，大学，研究员
参考文献
1，江幼岷.辐射防护剂研究的进展及现状.中华放射医学与防护杂志，1995，15(3)：197—198
, 百拇医药
2，徐书显，时华富，张凤云.中药防治放射损伤的动物实验研究.河北中西医结合杂志，1998，7(1)：9—10
3，徐书显，张凤云，时华富，等.蕈状芽胞杆菌的特性及在辐射防护中的应用.中国微生态学杂志，1998，10(3)：155—156
4，张凤云，徐书显，王忠海，等.细菌防护液对小鼠精子形态的影响.卫生毒理学杂志，1999，13(3)：226
5，徐书显，张凤云，王常有，等.细菌防护液对小鼠辐射前后骨髓嗜多染红细胞微核率的影响.卫生毒理学杂志，1999，13(3)：226
6，左连富.流式细胞术与生物学.沈阳：辽宁科学技术出版社，1996，68-385
7，Subash S,Li L,Tim R.Cytokine-deficient CD8 Tcl cells induced by L1-4.J Immunol,1997,159:606
(1999-12-28收稿), http://www.100md.com
单位：张凤云 王忠海 赵娟(河北医科大学生物学教研室)；徐书显 王常有 赵进沛(北京军区军事医学研究所，石家庄 050081)
关键词：细菌防护液；γ射线照射；骨髓细胞；流式细胞仪
卫生研究000406 摘要：探讨细菌防护液(BPL)与受60Co γ射线照射小鼠骨髓细胞生物学效应的关系。应用流式细胞仪(FCM)检测细胞的凋亡指数和免疫参数(CD4+,CD8+,NK)。结果显示BPL能够降低细胞凋亡率，同时提高细胞的增殖率(P<0.01)。其作用机制可能与提高NK细胞活性和CD4+、CD8+数量有关。进一步证实，BPL对辐射损伤细胞有一定的保护作用。
中图分类号：R818.74 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-8020(2000)04-0207-02
Effects of bacterial protective liquid on radiation biology effect
of mouse bone marrow cells
Xu Shuxian, Zhang Fengyun,Wang Changyou, Wang Zhonghai, et al.
(Institute of Military Medicine Chinese PLA,Shijiazhuang 050081,China)
Abstract：To study the relationship between bacterial protective liquid (BPL) and the biological effect of mouse bone marrow cells by γ-ray irradiation, apoptosis and the number of CD4+,CD8+and NK cells were analyzed by flow cytometry(FCM).the results showed that BPL decreased the apoptosis and increased the proliferation of cells(P<0.01).The theorem of action was related with raising the percentage vitality of NK cells and the quantity of CD4+ and CD8+.This study proved that BPL might have protective effect against radiation injuriy.
, 百拇医药
Key words:bacterial protective liquid, γ-ray irradiation, bone marrow cells,flow cytometry
随着医疗保健事业的发展，电离辐射源和放射性核素在医疗中的应用日益广泛，放射诊断与治疗的新技术、新设备不断出现，在提高疾病诊治水平的同时，也增加了人类受电离辐射照射剂量的负担，从而会引起人体不同程度的辐射损伤。如何对电离辐射进行防护，已日益受到各界的重视[1，2]。我们研制的细菌防护液就是其中的一种防护措施，初步证明，它能延长小鼠的存活率[3]。该项研究主要是采用流式细胞术(FCM)对小鼠骨髓细胞进行多参数的研究，为细菌防护液用于临床提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 稀土半胱氨酸化合物 北京稀土农用开发中心提供。
, http://www.100md.com
1.1.2 蕈状芽胞杆菌 本所分离，经中科院微生物所鉴定。1.1.3 细菌防护液(简称BPL) 在普通培养基中加入一定量的稀土化合物，再接种一定量的菌株，经37℃培养，使菌量达到1×108 cfu/ml，备用。
1.1.4 实验动物 昆明种小鼠，体重(20±1.5)g，雌性，由河北省实验动物中心提供，达一级实验动物卫生标准。随机分为正常对照组、单纯照射对照组、防护液A组和B组，每组6只。
1.2 方法
1.2.1 给药方式 采取灌胃法，2个对照组分别给予0.5ml的生理盐水，防护液A组和B组分别给予0.5和0.25ml BPL，每天1次，照射前后各服药8天。
1.2.2 照射条件 60Co γ射线照射，剂量率为0.794Gy/min，总剂量3.5Gy，全身一次性照射。
, 百拇医药
1.2.3 骨髓细胞的制备 将小鼠断颈处死，剥取双侧股骨，尽量冲出全部骨髓细胞滴入含肝素(1 000 U/ml)的PBS液中，总量2.0ml。再用PBS液离心、洗涤，最后将细胞以70%乙醇固定，即可进行细胞DNA荧光和免疫荧光标记染色，染色方法见文献[4]。
1.2.4 流式细胞仪检测方法[4] 应用FACS-420型流式细胞仪(美国BD公司)进行检测，数据和图像输入HP-300 Consort 30计算机，应用相应程序软件分别进行资料处理。测定前以鸡红细胞作为标准样品调整仪器的变异系数(CV)在5%以内，确保仪器的精度。上机后每份标本检测10 000个细胞，所得数据采用t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 BPL对细胞周期的影响
表1显示，单纯照射组与防护液组相比，2个防护液组的G0/G1期细胞比例下降，而S、G2/M期细胞比例均有不同程度的升高，表明BPL可促进骨髓细胞的分裂增殖，加速骨髓细胞的修复。但S期的差别不显著。这主要是由于单纯照射组经过8天的自行修复。
, 百拇医药
表1 各组细胞周期的变化(
±s)% 组别G0/G1
S
G2/M
正常对照组
78.73±6.38
10.69±2.63
10.58±3.78
单纯照射组
79.97±3.20
, 百拇医药
10.87±3.04
9.16±1.04
防护液A组
73.43±2.74(1)
12.45±1.69(2)
14.13±1.39(1)
防护液B组
73.11±0.27(1)
13.26±0.13(2)
13.63±0.40(1)
, http://www.100md.com
注：与单纯照射组比较(1) P<0.01，(2) P>0.05
2.2 BPL对细胞周期中DNA含量的影响
FCM应用最多的领域是肿瘤细胞DNA含量的定量研究，并发现DNA含量这一参量与肿瘤的恶性分级、预后和治疗等有一定的关系。DNA含量在细胞内所有参数中比较恒定，在细胞周期中DNA含量随各时相发生周期变化。如果DNA含量发生微小的异常变化，则有可能导致恶性肿瘤的产生[4]。表2显示，每期各组之间的DNA含量差异无显著性(P>0.05)。说明BPL可能没有致癌、致畸和致突变的作用。为了进一步验证这一结论，我们还探讨了细菌防护液对小鼠精子形态和红细胞微核率的影响。结果是该菌液无致畸作用并有抗突变功能[5，6]。
表2 细胞周期中DNA含量的测定(
±s)(1)% 组别, http://www.100md.com
G0/G1
S
G2/M
正常对照组
57.33±3.21
68.00±1.73
106.67±8.08
单纯照射组
58.67±0.58
69.67±0.58
111.00±3.46
, 百拇医药
防护液A组
58.67±1.53
69.33±0.58
112.67±3.06
防护液B组
58.50±0.71
70.50±0.71
110.50±0.71
注：(1)各期中每组之间相比P>0.05
2.3 BPL对细胞凋亡率和增殖率的影响
表3结果显示，经照射后，细胞的凋亡率明显增加，BPL对细胞的凋亡有一定保护作用，同时能够提高细胞的增殖率。表3 细胞凋亡率和增殖率测定(
±s)% 组别, 百拇医药
凋亡率
增殖率
正常对照组
2.03±0.25(1)
21.27±6.41
单纯照射组
14.03±3.09
20.03±2.08
防护液A组
7.27±1.27(1)
26.58±3.03(1)
, 百拇医药
防护液B组
6.00±0.57(1)
26.89±0.53(1)
注：(1)与单纯照射组相比P<0.01
2.4 BPL对细胞亚群的影响
测定T细胞亚群的相对标记率(见表4)，结果显示，单纯照射组的NK细胞、CD4+和CD8+明显低于正常对照组,而BPL能显著的提高它们的活性。
表4 BPL与NK细胞和T细胞亚群的关系(
±s))% 组别, http://www.100md.com
NK
CD4+
CD8+
CD4+CD8+
正常对照组
23.20±2.19(1)
33.30±3.18(1)
29.13±2.03(1)
1.14±0.06
单纯照射组
, 百拇医药
15.87±1.76
27.63±1.40
23.20±0.87
1.19±0.10
防护液A组
24.27±1.10(1)
39.13±4.30(1)
29.37±3.19(1)
1.33±0.11(2)
防护液B组
, 百拇医药 20.20±1.56(1)
34.00±1.00(1)
27.10±2.69(1)
1.26±0.13
注：与单纯照射组比(1)P<0.01 (2)P<0.05
3 讨论
本次实验采用目前较先进的技术FCM，对经60Coγ射线照射的小鼠骨髓细胞进行多参数定量分析。结果显示，BPL能显著的降低细胞的凋亡率，并能提高细胞的增殖率。从一个侧面可以说明BPL对辐射损伤有一定的防护作用。其作用机制可能是，稀土刺激细菌生长的同时，也能提高NK细胞活性和CD4+、CD8+的数量。另外，菌液中可能含一定量的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶，从而与提高机体免疫能力和增强免疫调节功能及保护造血系统有关。
, 百拇医药
T淋巴细胞按表型不同可分为CD4+和CD8+两大亚群，它们均能分泌多种细胞因子，在机体中主要承担细胞免疫功能，同时协助和参与机体的体液免疫及免疫调节[7]，在抗感染、抗肿瘤、抗衰老和抗辐射等生命过程中发挥着十分重要的作用。NK细胞对机体的免疫和造血系统也有重要的调节作用。T淋巴细胞对辐射最敏感，而NK细胞则有一定的辐射抗性。这2种细胞的数量及活性变化对被辐射机体的保护及恢复具有十分重要的意义。
(致谢：河北医科大学第四临床医学院肿瘤所左连富主任医师对该项研究给予指导和帮助，特此感谢)
基金项目：“九五”全军面上项目指令课题
作者简介：徐书显，男，大学，研究员
参考文献
1，江幼岷.辐射防护剂研究的进展及现状.中华放射医学与防护杂志，1995，15(3)：197—198
, 百拇医药
2，徐书显，时华富，张凤云.中药防治放射损伤的动物实验研究.河北中西医结合杂志，1998，7(1)：9—10
3，徐书显，张凤云，时华富，等.蕈状芽胞杆菌的特性及在辐射防护中的应用.中国微生态学杂志，1998，10(3)：155—156
4，张凤云，徐书显，王忠海，等.细菌防护液对小鼠精子形态的影响.卫生毒理学杂志，1999，13(3)：226
5，徐书显，张凤云，王常有，等.细菌防护液对小鼠辐射前后骨髓嗜多染红细胞微核率的影响.卫生毒理学杂志，1999，13(3)：226
6，左连富.流式细胞术与生物学.沈阳：辽宁科学技术出版社，1996，68-385
7，Subash S,Li L,Tim R.Cytokine-deficient CD8 Tcl cells induced by L1-4.J Immunol,1997,159:606
(1999-12-28收稿), http://www.100md.com