比色法测定氨基胍
作者：泮锋钢 鹿明
单位：泮锋钢 鹿明(天津大学化工学院 天津 300072)
关键词：
药物分析杂志000329 氨基胍是合成许多医药、染料、炸药的原料，近期用于治疗糖尿病的研究[1～4]非常活跃，并作为诱导性一氧化氮合成酶抑制剂[5]用于麻醉领域。但其测定方法的报道十分稀少。测定胍的比色法[6]干扰多，检测限低。已有文献报道[7]，在强酸介质中，对二甲氨基苯甲醛(简称DMBA)与肼形成橙色物质用于测定肼。研究发现，所形成的橙色物质与少量氨基胍反应而明显褪色，该反应在低浓度下(0～0.001 mol.L-1)满足比耳定律。本文据此建立了测定氨基胍的比色法。本法具有干扰少，测定范围广，操作简单，灵敏度高的优点。利用本法测定氨基胍结晶母液中的氨基胍含量，结果令人满意。血清的回收试验也收到良好的结果。
, 百拇医药
1 仪器与试剂
721分光光度计(上海第三仪器厂)。对二甲氨基苯甲醛标准溶液：用对二甲氨基苯甲醛(分析纯)配制，CDMBA=0.001 0 mol.L-1，CHCl=0.5 mol.L-1；硫酸肼(分析纯)；氨基胍标准溶液：用重碳酸氨基胍(分析纯)配制，C氨基胍=0.001 0 mol.L-1，CHCl=0.5 mol.L-1。
2 实验方法
于一系列25 mL具塞刻度比色管中，分别加入二甲氨基苯甲醛标准溶液2 mL，过量的硫酸肼(约0.01 g)，再分别向各比色管中加入适量的0.5 mol.L-1的盐酸或氨基胍标准溶液。加0.5 mol.L-1的盐酸至8 mL，振荡均匀，60 ℃水浴加热10 min，冷却后加入乙醇15 mL，充分显色，加0.5 mol.L-1盐酸至刻度，以水为参比，在460 nm处，用1 cm比色皿，分别测定空白试样吸光度A0和加入氨基胍试样的吸光度A，ΔA=A0-A，样品测定时依相同步骤操作。
, 百拇医药
3 实验结果
3.1 吸收波长选择 按“2”的方法实验，DMBA与肼形成的橙色溶液在λ=460 nm有最大吸收，选此为测定波长。
3.2 酸度的影响 由图1可知，低浓度的酸有利于提高灵敏度。但研究发现酸浓度太低褪色困难，CHCl<0.4 mol.L-1时，反应不再满足比耳定律，且褪色时间过长。本实验选择0.5 mol.L-1盐酸。
3.3 硫酸肼与DMBA用量的影响 室温下，硫酸肼只需0.01 g即已过量，多加对A0无影响。A0与DMBA用量呈线性关系：A0=0.25×VDMBA.mL-1。本实验选择加入 DMBA标准溶液2 mL较为适宜。
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3.4 乙醇用量的影响 乙醇可以改变介质环境，提高吸光度，其影响见图2。加入乙醇可提高本方法的灵敏度，另外，随着乙醇加入量的增加，介质极性下降，褪色困难。本方法采用先在水介质中完成褪色反应，再加入适量乙醇的测定方法。本实验选择加入乙醇15 mL。
图1 HCl浓度对吸光度的影响
图2 乙醇用量对吸光度的影响
3.5 温度与时间的影响 实验表明，在5～30 ℃范围内，体系的吸光度长时间稳定，故可在室温下实验，对时间无严格要求。
3.6 工作曲线 在上述选定的最佳实验条件下，该方法测定氨基胍的检测限为0.2 μg.mL-1，其浓度在0～5.0 μg.mL-1范围内与ΔA呈线性关系，其回归方程为ΔA=-0.005 2+0.089C,r为0.998，RSD为3.3%，n=6。
, 百拇医药
3.7 干扰实验 在前述最佳实验条件下，本文考察了氨基化合物如胍、脲、胺、亚胺、氨基酸等，对测定均不发生干扰。
3.8 样品分析 按文献[8]合成硫酸氨基胍，结晶母液中含有氨基胍和肼，由于肼是本法测定中过量加入的试剂，所以母液中的肼不会干扰测定。将结晶母液用0.5 mol.L-1盐酸稀释，测定其氨基胍含量，并在样品中加入已知量的氨基胍，按本方法测定含量，计算回收率，结果见表1。溶液中的其他氨基化合物，由于过量肼的存在，不会与DMBA反应，故不干扰测定。
表1 合成硫酸氨基胍结晶母液测定结果(n=6) 样号
含量平均值
/μg.mL-1
RSD
, 百拇医药
/%
回收率
平均值
/%
RSD
/%
1
1.3
3.5
100
2.8
2
1.4
, http://www.100md.com 4.3
103
3.6
3.9 血清的回收试验 取健康人血清2.00 mL，加入7%的三氯乙酸3 mL，混匀后于3 500 r.min-1的离心机中离心15 min。移取清液2.00 mL，加入不同量的氨基胍，定容为10 mL，从中移取2.00 mL溶液，按照实验方法进行测定。回收结果列于表2。表2 血清的回收试验结果(n=4) 样号
加入量
/μg.mL-1
回收率
/%
, http://www.100md.com
RSD
/%
1
0
-
-
1
3.0
97
3.2
2
5.0
102
2.8
, http://www.100md.com
3.10 反应机理 DMBA与肼发生可逆反应，生成(Ⅰ)，由于该体系的大共轭体系，相当稳定，不易与其他氨基化合物反应。但DMBA可以与氨基胍反应消耗掉DMBA，二者反应摩尔比为1∶1，随着DMBA的消耗，平衡移动，(Ⅰ)分解使颜色褪去。通过对反应产物的红外光谱分析，推测DMBA与氨基胍反应生成(Ⅱ)，其芳香性五元环具有更高的稳定性，且稀溶液条件下，有利于分子内环合，所以使(Ⅰ)褪色。
参考文献
1，Skamarawskas John T,Mckay Alan C,Hunt James V.Aminoguanidine and its prooxidant effects on an experimental model of protein glycation.Fre Rad Biol Med,1996,21(6):801
, http://www.100md.com
2，Kawakami Musanobu.Aminoguanidine.Horumon to Rinsho,1995,43(2):189
3，Hill Michael A,Ege Elizabeth A.Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats:effort of aminoguanidine treatment.Diabetes,1994,43(12):1450
4，李曼，曾根博仁.氨基胍.日本医学介绍，1997，18(8)：364
5，张生锁，吴新民.观察选择性诱导型NO合成酶抑制剂氨基胍对内毒素休克犬血流动力学的影响.中华麻醉学杂志，1997，17(8)：472
6，夏锦尧.有机化合物及药物的比色法和荧光分析法.北京：中国人民公安大学出版社，1989.208
7，张志贤，张瑞镐.有机官能团定量分析.北京：化学工业出版社，1990.376
8，邓晓临，王斌，王硕等.精细化工商品生产技术(常用医药化学品专集).长沙：湖南科学技术出版社，1994.110
(本文于1999年7月15日收到), 百拇医药
单位：泮锋钢 鹿明(天津大学化工学院 天津 300072)
关键词：
药物分析杂志000329 氨基胍是合成许多医药、染料、炸药的原料，近期用于治疗糖尿病的研究[1～4]非常活跃，并作为诱导性一氧化氮合成酶抑制剂[5]用于麻醉领域。但其测定方法的报道十分稀少。测定胍的比色法[6]干扰多，检测限低。已有文献报道[7]，在强酸介质中，对二甲氨基苯甲醛(简称DMBA)与肼形成橙色物质用于测定肼。研究发现，所形成的橙色物质与少量氨基胍反应而明显褪色，该反应在低浓度下(0～0.001 mol.L-1)满足比耳定律。本文据此建立了测定氨基胍的比色法。本法具有干扰少，测定范围广，操作简单，灵敏度高的优点。利用本法测定氨基胍结晶母液中的氨基胍含量，结果令人满意。血清的回收试验也收到良好的结果。
, 百拇医药
1 仪器与试剂
721分光光度计(上海第三仪器厂)。对二甲氨基苯甲醛标准溶液：用对二甲氨基苯甲醛(分析纯)配制，CDMBA=0.001 0 mol.L-1，CHCl=0.5 mol.L-1；硫酸肼(分析纯)；氨基胍标准溶液：用重碳酸氨基胍(分析纯)配制，C氨基胍=0.001 0 mol.L-1，CHCl=0.5 mol.L-1。
2 实验方法
于一系列25 mL具塞刻度比色管中，分别加入二甲氨基苯甲醛标准溶液2 mL，过量的硫酸肼(约0.01 g)，再分别向各比色管中加入适量的0.5 mol.L-1的盐酸或氨基胍标准溶液。加0.5 mol.L-1的盐酸至8 mL，振荡均匀，60 ℃水浴加热10 min，冷却后加入乙醇15 mL，充分显色，加0.5 mol.L-1盐酸至刻度，以水为参比，在460 nm处，用1 cm比色皿，分别测定空白试样吸光度A0和加入氨基胍试样的吸光度A，ΔA=A0-A，样品测定时依相同步骤操作。
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3 实验结果
3.1 吸收波长选择 按“2”的方法实验，DMBA与肼形成的橙色溶液在λ=460 nm有最大吸收，选此为测定波长。
3.2 酸度的影响 由图1可知，低浓度的酸有利于提高灵敏度。但研究发现酸浓度太低褪色困难，CHCl<0.4 mol.L-1时，反应不再满足比耳定律，且褪色时间过长。本实验选择0.5 mol.L-1盐酸。
3.3 硫酸肼与DMBA用量的影响 室温下，硫酸肼只需0.01 g即已过量，多加对A0无影响。A0与DMBA用量呈线性关系：A0=0.25×VDMBA.mL-1。本实验选择加入 DMBA标准溶液2 mL较为适宜。
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3.4 乙醇用量的影响 乙醇可以改变介质环境，提高吸光度，其影响见图2。加入乙醇可提高本方法的灵敏度，另外，随着乙醇加入量的增加，介质极性下降，褪色困难。本方法采用先在水介质中完成褪色反应，再加入适量乙醇的测定方法。本实验选择加入乙醇15 mL。
图1 HCl浓度对吸光度的影响
图2 乙醇用量对吸光度的影响
3.5 温度与时间的影响 实验表明，在5～30 ℃范围内，体系的吸光度长时间稳定，故可在室温下实验，对时间无严格要求。
3.6 工作曲线 在上述选定的最佳实验条件下，该方法测定氨基胍的检测限为0.2 μg.mL-1，其浓度在0～5.0 μg.mL-1范围内与ΔA呈线性关系，其回归方程为ΔA=-0.005 2+0.089C,r为0.998，RSD为3.3%，n=6。
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3.7 干扰实验 在前述最佳实验条件下，本文考察了氨基化合物如胍、脲、胺、亚胺、氨基酸等，对测定均不发生干扰。
3.8 样品分析 按文献[8]合成硫酸氨基胍，结晶母液中含有氨基胍和肼，由于肼是本法测定中过量加入的试剂，所以母液中的肼不会干扰测定。将结晶母液用0.5 mol.L-1盐酸稀释，测定其氨基胍含量，并在样品中加入已知量的氨基胍，按本方法测定含量，计算回收率，结果见表1。溶液中的其他氨基化合物，由于过量肼的存在，不会与DMBA反应，故不干扰测定。
表1 合成硫酸氨基胍结晶母液测定结果(n=6) 样号
含量平均值
/μg.mL-1
RSD
, 百拇医药
/%
回收率
平均值
/%
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1.3
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3.6
3.9 血清的回收试验 取健康人血清2.00 mL，加入7%的三氯乙酸3 mL，混匀后于3 500 r.min-1的离心机中离心15 min。移取清液2.00 mL，加入不同量的氨基胍，定容为10 mL，从中移取2.00 mL溶液，按照实验方法进行测定。回收结果列于表2。表2 血清的回收试验结果(n=4) 样号
加入量
/μg.mL-1
回收率
/%
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RSD
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2.8
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3.10 反应机理 DMBA与肼发生可逆反应，生成(Ⅰ)，由于该体系的大共轭体系，相当稳定，不易与其他氨基化合物反应。但DMBA可以与氨基胍反应消耗掉DMBA，二者反应摩尔比为1∶1，随着DMBA的消耗，平衡移动，(Ⅰ)分解使颜色褪去。通过对反应产物的红外光谱分析，推测DMBA与氨基胍反应生成(Ⅱ)，其芳香性五元环具有更高的稳定性，且稀溶液条件下，有利于分子内环合，所以使(Ⅰ)褪色。
参考文献
1，Skamarawskas John T,Mckay Alan C,Hunt James V.Aminoguanidine and its prooxidant effects on an experimental model of protein glycation.Fre Rad Biol Med,1996,21(6):801
, http://www.100md.com
2，Kawakami Musanobu.Aminoguanidine.Horumon to Rinsho,1995,43(2):189
3，Hill Michael A,Ege Elizabeth A.Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats:effort of aminoguanidine treatment.Diabetes,1994,43(12):1450
4，李曼，曾根博仁.氨基胍.日本医学介绍，1997，18(8)：364
5，张生锁，吴新民.观察选择性诱导型NO合成酶抑制剂氨基胍对内毒素休克犬血流动力学的影响.中华麻醉学杂志，1997，17(8)：472
6，夏锦尧.有机化合物及药物的比色法和荧光分析法.北京：中国人民公安大学出版社，1989.208
7，张志贤，张瑞镐.有机官能团定量分析.北京：化学工业出版社，1990.376
8，邓晓临，王斌，王硕等.精细化工商品生产技术(常用医药化学品专集).长沙：湖南科学技术出版社，1994.110
(本文于1999年7月15日收到), 百拇医药