儿童急性白血病p16基因纯合子缺失和点突变的研究
作者：蒋俊煌 沈建箴 郭瑞官 杨月玲 陈志哲
单位：蒋俊煌(350001 福建医科大学附属协和医院儿科)；郭瑞官(现在福建省莆田医院，351100)；沈建箴(福建省血液病研究所)；杨月玲(福建省血液病研究所)；陈志哲(福建省血液病研究所)
关键词：
中华医学杂志000712 我们应用聚合酶链反应(PCR)与DNA单链构象多态性(SSCP)及DNA序列分析技术对53例儿童急性白血病p16基因exon1和exon2进行纯合子缺失和点突变研究，旨在探讨p16基因缺失、点突变与儿童急性白血病发生、发展及预后关系，为其防治提供依据。
一、对象与方法
1.对象：53例初治和复发急性白血病(AL)患儿，均经血、髓象及细胞组织化学确诊，部分经免疫标记分析。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)40例，急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)13例。对照组30例均为非恶性疾病且骨髓象正常者。2组患儿均来自我院儿科门诊及住院病例，其年龄、性别具有可比性(P>0.05)。
, 百拇医药
2.方法：(1)样本制备：取外周血5 ml或骨髓液3 ml，酸-枸橼酸盐-葡萄糖(ACD)抗凝(所有标本白血病细胞均大于80%)。然后，分离出单个核细胞(样本中白血病细胞>90%)，再按常规酚/氯仿抽取DNA。(2)PCR引物设计:参照文献[1]，我们设计了p16基因exon1,exon2A,exon2B 3对扩增引物，同时选用GAPDH基因引物做内对照。(3)PCR扩增:PCR反应混合液含10×PCR缓冲液2.5 μl,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP混合液(10 mmol/L)2.5 μl,引物(20 pmol/L)各1 μl,模板DNA 150～300 ng,加蒸溜水至25 μl。反应条件：95℃预变性10 min,加入Taq酶1 U,95℃ 45 s,62℃ 30 s,72℃ 30 s,35次循环,72℃延伸5 min。取PCR产物5 μl,质量分数为0.018的琼脂糖凝胶电泳。(4)SSCP-银染分析:参照文献[2]进行。(5)DNA序列分析:采用荧光标记终止底物法,质量分数为0.04的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,377型DNA自动测序仪(美国PE公司)分析序列。
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3.统计学处理：2组间率的比较采用χ2检验或精确概率法统计。
二、结果
1.p16基因exon1、exon2A、exon2B PCR扩增与纯合子缺失分析:扩增产物经质量分数为0.018的琼脂糖电泳,若未能出现特异性片段，则说明p16基因纯合子缺失。结果见表1。
2.SSCP分析p16基因点突变:40例ALL中无一例点突变;13例ANLL中有1例点突变(带型出现异常迁移),发生在exon2A。
表1 53例儿童急性白血病p16基因纯合子缺失情况 组别
例
数
P16基因纯合子缺失(例数)
, http://www.100md.com
缺失率
(%)
P值
exon1
exon2A
exon2B
合计
AL
53
2
7
5
14
, 百拇医药 26
<0.01
ANLL
13
0
0
0
0
0
>0.05
ALL
40
2
7
, 百拇医药
5
14
35
<0.01△
初治
29
1
5
3
9
31
<0.01
标危ALL
, http://www.100md.com
12
0
1
0
1
8
>0.05
高危ALL
17
1
4
3
8
47
, http://www.100md.com
<0.01*
复发
11
1
2
2
5
45
<0.01
复发+高 危ALL
28
2
6
, http://www.100md.com
5
13
46
<0.01▲
对照组
30
0
0
0
0
0
注：AL为急性白血病，ALL为急性淋巴细胞白血病，ANLL为急性非淋巴细胞白血病；ALL与ANLL比较,△P<0.05；高危急淋与标危急淋比较，*P<0.05；复发+高危急淋与标危急淋比较，▲P<0.05;其余为与对照组比较
, http://www.100md.com
3.DNA序列结果:对SSCP分析有单链构象多态性的1例p16基因emon2A产物进行DNA测序,发现在第49密码子出现错义突变, 由GCC突变为ACC,由苏氨酸取代丙氨酸。
三、讨论
我们对53例儿童p16基因纯合子缺失和点突变的研究表明, 15例(28%)出现p16基因失活(包括14例纯合子缺失,1例点突变),30例对照组无一例发生p16基因失活,差别有高度显著意义(P<0.01),说明p16基因失活与儿童AL的发生关系密切。儿童AL的发病机理仍不清楚，可能是多种复杂因素相互影响致不平衡的基因表达的结果，推测p16基因失活可能是主要机制之一。
我们的研究表明，40例儿童ALL中，p16基因纯合子缺失14例,占35%,与对照及ANLL组比较差异均有统计学意义(P<0.05及P<0.01),未检出点突变。13例儿童ANLL中未检出缺失, 发现1例点突变,经DNA测序分析,发现在第2外显子第49密码子出现错义突变,由GCC突变为ACC,由苏氨酸取代丙氨酸,其突变发生在p16基因突变热点──第2外显子CpG核苷处[3]。上述结果表明，儿童AL中p16基因失活以ALL为高,其方式以纯合子缺失为主,点突变罕见，与文献资料相符合[4]。
, 百拇医药
我们的研究显示，P16基因缺失在高危急淋高于标危急淋(P<0.05),复发+高危急淋高于标危急淋(P<0.05)。儿童ALL中,高危急淋及复发急淋均预示着预后差。有人报道9p染色体异常儿童ALL常具高危临床特征[4],我们的研究与之相符。在儿童ANLL中1例p16基因点突变患儿为男性,4岁,M5b型,伴有白细胞数高(初诊时白细胞数为353×109/L)等预后差的特点。上述结果提示，p16基因失活可能成为预测儿童AL病程进展、复发及预后的指标之一。
参考文献
1，Zhang SY, Klein-Szanto AJ, Santer ER ,et al. Higher frequency of acterations in the p16 gene in squamous cell carcinoma cell lines than in primary tumors of head and neck.Cancer Res,1994,54:5050-5053.
, http://www.100md.com
2，方福德,周吕,丁濂，等主编.现代医学实验技巧全书.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995.1103-1104.
3，Pollock PM, Pearson JV, Hayward NK. Compilation of somatic mutation of the CDKN2gene in human cancers: nonrandom distribution of base substitutions.Genes Chromosomes Cancer,1996;15:77-88.
4，Quesnel B, Preudhomme C, Philippe N, et al. p16 gene homozygous deletions in acute lymphoblastic leukemia. Blood,1995,85:657-663.
收稿日期：1999-08-13, 百拇医药
单位：蒋俊煌(350001 福建医科大学附属协和医院儿科)；郭瑞官(现在福建省莆田医院，351100)；沈建箴(福建省血液病研究所)；杨月玲(福建省血液病研究所)；陈志哲(福建省血液病研究所)
关键词：
中华医学杂志000712 我们应用聚合酶链反应(PCR)与DNA单链构象多态性(SSCP)及DNA序列分析技术对53例儿童急性白血病p16基因exon1和exon2进行纯合子缺失和点突变研究，旨在探讨p16基因缺失、点突变与儿童急性白血病发生、发展及预后关系，为其防治提供依据。
一、对象与方法
1.对象：53例初治和复发急性白血病(AL)患儿，均经血、髓象及细胞组织化学确诊，部分经免疫标记分析。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)40例，急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)13例。对照组30例均为非恶性疾病且骨髓象正常者。2组患儿均来自我院儿科门诊及住院病例，其年龄、性别具有可比性(P>0.05)。
, 百拇医药
2.方法：(1)样本制备：取外周血5 ml或骨髓液3 ml，酸-枸橼酸盐-葡萄糖(ACD)抗凝(所有标本白血病细胞均大于80%)。然后，分离出单个核细胞(样本中白血病细胞>90%)，再按常规酚/氯仿抽取DNA。(2)PCR引物设计:参照文献[1]，我们设计了p16基因exon1,exon2A,exon2B 3对扩增引物，同时选用GAPDH基因引物做内对照。(3)PCR扩增:PCR反应混合液含10×PCR缓冲液2.5 μl,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP混合液(10 mmol/L)2.5 μl,引物(20 pmol/L)各1 μl,模板DNA 150～300 ng,加蒸溜水至25 μl。反应条件：95℃预变性10 min,加入Taq酶1 U,95℃ 45 s,62℃ 30 s,72℃ 30 s,35次循环,72℃延伸5 min。取PCR产物5 μl,质量分数为0.018的琼脂糖凝胶电泳。(4)SSCP-银染分析:参照文献[2]进行。(5)DNA序列分析:采用荧光标记终止底物法,质量分数为0.04的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,377型DNA自动测序仪(美国PE公司)分析序列。
, 百拇医药
3.统计学处理：2组间率的比较采用χ2检验或精确概率法统计。
二、结果
1.p16基因exon1、exon2A、exon2B PCR扩增与纯合子缺失分析:扩增产物经质量分数为0.018的琼脂糖电泳,若未能出现特异性片段，则说明p16基因纯合子缺失。结果见表1。
2.SSCP分析p16基因点突变:40例ALL中无一例点突变;13例ANLL中有1例点突变(带型出现异常迁移),发生在exon2A。
表1 53例儿童急性白血病p16基因纯合子缺失情况 组别
例
数
P16基因纯合子缺失(例数)
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缺失率
(%)
P值
exon1
exon2A
exon2B
合计
AL
53
2
7
5
14
, 百拇医药 26
<0.01
ANLL
13
0
0
0
0
0
>0.05
ALL
40
2
7
, 百拇医药
5
14
35
<0.01△
初治
29
1
5
3
9
31
<0.01
标危ALL
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12
0
1
0
1
8
>0.05
高危ALL
17
1
4
3
8
47
, http://www.100md.com
<0.01*
复发
11
1
2
2
5
45
<0.01
复发+高 危ALL
28
2
6
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5
13
46
<0.01▲
对照组
30
0
0
0
0
0
注：AL为急性白血病，ALL为急性淋巴细胞白血病，ANLL为急性非淋巴细胞白血病；ALL与ANLL比较,△P<0.05；高危急淋与标危急淋比较，*P<0.05；复发+高危急淋与标危急淋比较，▲P<0.05;其余为与对照组比较
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3.DNA序列结果:对SSCP分析有单链构象多态性的1例p16基因emon2A产物进行DNA测序,发现在第49密码子出现错义突变, 由GCC突变为ACC,由苏氨酸取代丙氨酸。
三、讨论
我们对53例儿童p16基因纯合子缺失和点突变的研究表明, 15例(28%)出现p16基因失活(包括14例纯合子缺失,1例点突变),30例对照组无一例发生p16基因失活,差别有高度显著意义(P<0.01),说明p16基因失活与儿童AL的发生关系密切。儿童AL的发病机理仍不清楚，可能是多种复杂因素相互影响致不平衡的基因表达的结果，推测p16基因失活可能是主要机制之一。
我们的研究表明，40例儿童ALL中，p16基因纯合子缺失14例,占35%,与对照及ANLL组比较差异均有统计学意义(P<0.05及P<0.01),未检出点突变。13例儿童ANLL中未检出缺失, 发现1例点突变,经DNA测序分析,发现在第2外显子第49密码子出现错义突变,由GCC突变为ACC,由苏氨酸取代丙氨酸,其突变发生在p16基因突变热点──第2外显子CpG核苷处[3]。上述结果表明，儿童AL中p16基因失活以ALL为高,其方式以纯合子缺失为主,点突变罕见，与文献资料相符合[4]。
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我们的研究显示，P16基因缺失在高危急淋高于标危急淋(P<0.05),复发+高危急淋高于标危急淋(P<0.05)。儿童ALL中,高危急淋及复发急淋均预示着预后差。有人报道9p染色体异常儿童ALL常具高危临床特征[4],我们的研究与之相符。在儿童ANLL中1例p16基因点突变患儿为男性,4岁,M5b型,伴有白细胞数高(初诊时白细胞数为353×109/L)等预后差的特点。上述结果提示，p16基因失活可能成为预测儿童AL病程进展、复发及预后的指标之一。
参考文献
1，Zhang SY, Klein-Szanto AJ, Santer ER ,et al. Higher frequency of acterations in the p16 gene in squamous cell carcinoma cell lines than in primary tumors of head and neck.Cancer Res,1994,54:5050-5053.
, http://www.100md.com
2，方福德,周吕,丁濂，等主编.现代医学实验技巧全书.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995.1103-1104.
3，Pollock PM, Pearson JV, Hayward NK. Compilation of somatic mutation of the CDKN2gene in human cancers: nonrandom distribution of base substitutions.Genes Chromosomes Cancer,1996;15:77-88.
4，Quesnel B, Preudhomme C, Philippe N, et al. p16 gene homozygous deletions in acute lymphoblastic leukemia. Blood,1995,85:657-663.
收稿日期：1999-08-13, 百拇医药