膀胱移行细胞癌多肿瘤抑制基因-1纯合子缺失及意义
作者：方德信 熊旭林 鲁功成 王宗敏
单位：方德信(汕头大学医学院附属第一医院泌尿外科广东汕头，515000)；熊旭林 鲁功成(同济医科大学附属协和医院泌尿外科)；王宗敏(温州医学院附属第二医院病理科)
关键词：膀胱肿瘤；移行细胞癌；基因；抑制；聚合酶链反应
临床泌尿外科杂志000613 摘要 目的：了解多肿瘤抑制基因-1(MTS1)在膀胱移行细胞癌中的纯合子缺失情况，探讨MTS1纯合子缺失在膀胱移行细胞癌发生与发展中的意义。方法：收集温州医学院手术切除的膀胱移行细胞癌石蜡标本35例，采用比较PCR法检测其MTS1纯合子缺失情况。结果：剔除2例不可比标本，33例标本中，MTS1纯合子缺失6例，缺失率为18.2%。其中Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级膀胱移行细胞癌MTS1纯合子缺失率分别为18.2%(2/11)、20.0%(3/15)和14.3%(1/7)；Tis～T1期肿瘤和T2～T4期肿瘤MTS1纯合子缺失率分别为22.2%(4/18)和13.3%(2/15)，各级和各期肿瘤的MTS1纯合子缺失率无显著性差异(P>0.05)。结论：MTS1纯合子对膀胱移行细胞癌的发生起一定作用，但与肿瘤的进展无关。
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Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor
gene 1 in the transitional cell carcinoma of the bladder
FANG De-xin
(Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Shantou,Guangdong,515000)
XIONG Xu-lin LU Gong-cheng
(Department of Urology,the Affiliated Union Hospital of Tongji Medical University)
, 百拇医药
WANG Zong-min
(Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College)
Abstract Purpose:To understand the states of homozygous deletions of the multiple tumor suppressor
gene 1(MTS1) in the transitional cell carcinoma of the bladder and their significance. Methods:Paraffin embebed specimens from 35 cases of patients with transitional cell carcinoma of the bladder was detected by the comparative PCR for homozygous deletions of MTS1.Results:Discarding 2 samples which was not comparable,homozygous loss of MTS1 was found in 6 of 33 samples ,loss rate was 18.3%.The loss rate in grade Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ tumor was 18.2% (2/11),20.0% (3/15) and14.3%(1/7) respectively;the loss rate in the superficial tumors (Tis,T1) and the invasive tumors was22.2% (4/18) and 13.3% (2/15) respectively.There wasn′t statistically significant difference between histological grades and between pathological stages(P>0.05).Conclusions:The results showed that the homozygous deletions of MTS1 was correlated with the development in some transitional cell carcinoma of the bladder, but wasn′t correlated with the progression.
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Key words Bladder tumor Transitional cell carcinoma Gene,suppressor Polymeruse chain reaction
多肿瘤抑制基因-1(Multiple tumor suppressor gene-1，MTS1)是1994年发现的一种抗癌基因，其缺失与多种肿瘤的发生发展有关。国外研究显示，MTS1缺失与膀胱移行细胞癌的发生发展有一定关系。为了解原发性膀胱移行细胞癌的MTS1纯合子缺失情况，探讨MTS1纯合子缺失与肿瘤发生发展的关系，本研究采用比较PCR法对35例膀胱移行细胞癌MTS1纯合子缺失情况进行研究，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
, 百拇医药
选择温州医学院附属第二医院1990～1996年手术切除的膀胱移行细胞癌标本35例，男31例，女4例，年龄27～81岁，平均60.3岁。标本经10%甲醛固定，石蜡包埋。标本按WHO标准进行病理分级，按UICC标准进行病理分期。Ⅰ级11例，Ⅱ级16例，Ⅲ级8例；Tis～T1期19例，T2～T4期16例。另选取男性正常膀胱粘膜蜡块和女性正常肾组织蜡块作正常对照。
1.2 标本处理方法
参照文献〔1〕报道的方法并加以改进。取4 μm切片2张，置入1.5 ml EP管中，加入1 ml二甲苯脱蜡，每次15 min共行2次，再加入无水乙醇去除二甲苯，每次5 min共行2次。上述每步之间均按1 500 r/min速度离心1 min，去上清液。沉淀组织吹干后加入20 μl超纯水，置75℃水浴2 h，混入DNA混悬液，置入4℃冰箱中保存待检。
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1.3 PCR引物设计
P16外显子2引物(P引物)购自北京中山生物工程公司，扩增片段长度为244 bp。其引物序列为：
P1：5-ACAAGCTTCCTTTCCGTCATGCCG-3
P2：5-CCAGGCATCGCGCACGTCCA-3
内参照引物根据X染色体FⅧ基因的内合子22进行设计(F引物)，由美国赛白盛公司合成，扩增片段长度为96 bp。其引物序列为：
F1：5-CACGAGCTCTCCATCTGAACATG-3
F2：5-GGGCTGCAGGGGGGGGGGACAACAG-3
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1.4 PCR扩增方法
PCR体系的建立：参照文献〔2〕报道的方法并加以改进。50 μl PCR体系含DNA混悬液20 μl、10×PCR缓冲液(500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris HCl，1 g/L动物胶，pH为8.3)5 μl、MgCl2(25 mmol/L)3 μl、dNTP(10 mmol/L)2 μl、去离子甲酰胺2 μl、P16引物(20 μm/L)P1和P2各1 μl、FⅧ引物(10 μm/L)F1和F2各2 μl、高纯水12 μl。上述体系在98℃中预变性5 min，加国产Taq酶(5×106 u/L)0.5 μl，加50 μl石蜡油覆盖。
循环条件：采用北京产1190型DNA扩增仪。将上述扩增体系置入PCR扩增仪，按以下条件扩增：95℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，30个循环后，72℃再延伸5 min。
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1.5 PCR扩增产物鉴定方法
取PCR产物10 μl，与加样缓冲液混匀，加至含溴化乙锭的2% Nusieve琼脂糖凝胶板的加样孔中。另取1 μl Maker〔pGEM-3 zf(+)/HaeⅢ，购自华美公司〕，与电泳缓冲液9 μl及加样缓冲液混匀后加至加样孔作为对照。稳压电泳(3.7 V/cm)30 min后在紫外线灯下观察结果，并参照Marker带鉴定特异性的P16扩增片段(244 bp)和FⅧ扩增片段(96 bp)。
1.6 图像分析
紫外线灯下摄影，再对胶片进行图像分析，得出标本P引物扩增带和F引物扩增带的积分密度比，并得出10次正常男性膀胱粘膜组织蜡块切片两条扩增带密度比的平均值(95%可信区间为0.52±0.07)和10次正常女性肾组织蜡块切片的平均值(95%可信区间为0.38±0.04)。
1.7 统计学处理
, 百拇医药
对不同病理分级和分期的膀胱肿瘤MTS1纯合子缺失率进行χ2检验。
2 结果
2.1 PCR结果
PCR扩增产物经电泳分离后出现两条扩增带，一条在244 bp位置，为P16，另一条在96 bp位置，为FⅧ(图1)。以肿瘤标本P引物扩增带和F引物扩增带积分密度比低于正常对照均值的20%为纯合子缺失标准〔3〕，并剔除2例两带积分密度比高于正常对照可信区间上限的肿瘤标本，结果33例标本中有6例纯合子缺失，缺失率为18.2%。
图1 5例膀胱移行细胞癌和正常膀胱粘膜的PCR结果
2.2 不同病理分级与分期肿瘤MTS1纯合子缺失情况
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不同分级肿瘤的MTS1纯合子缺失情况见表1。经χ2检验，各级肿瘤间(Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅰ级与Ⅲ级)MTS1纯合子缺失率无显著性差异(P>0.05)。
表1 不同分级肿瘤的MTS1纯合子缺失情况
例 病理分级
例数
缺失例数
缺失率/%
Ⅰ级
11
2
18.21)
, 百拇医药
Ⅱ级
15
3
20.01)
Ⅲ级
7
1
14.31)
合计
33
6
18.2
1) 经χ2检验，P>0.05 不同分期肿瘤的MTS1纯合子缺失情况见表2。经χ2检验，Tis～T1期肿瘤和T2～T4期肿瘤间MTS1纯合子缺失率无显著性差异(P>0.05)。
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表2 不同分期肿瘤的MTS1纯合子缺失情况
例 病理分期
例数
缺失例数
缺失率/%
Tis～T1期
18
4
22.21)
T2～T4期
15
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2
13.31)
合计
33
6
18.2
1) 经χ2检验，P>0.053 讨论
原发性膀胱肿瘤的细胞遗传学研究显示〔4～6〕，原发性肿瘤存在频繁的9号染色体缺失，因而提出9号染色体可能存在肿瘤抑制基因。随后，研究者开始用分子遗传学方法寻找这种假设的肿瘤抑制基因位点，随着研究的深入，发现9P21〔7〕或9P21～22〔8〕区域存在肿瘤抑制基因，进而在9P21区域终于发现MTS1的存在〔9，10〕。MTS1由3个外显子(长度分别为120 bp、307 bp和11 bp)和2个内含子组成。MTS1编码一种分子量为16 000的蛋白质，故又称为P16基因。P16蛋白为细胞周期素D(Cyclin D)/细胞周期素D依赖的蛋白激酶-4(Cyclin D dependent kinase 4，CDK4)复合物的抑制蛋白，故又称P16 ink4或CDK4 I(Inhibiter of CDK4)。P16蛋白参与细胞周期G期的调控，通过抑制Cyclin D/CDK4复合物的活性，从而抑制细胞从G1期进入S期。P16蛋白的缺乏将使细胞周期失控，从而导致细胞癌变。
, 百拇医药
正常功能的P16蛋白缺乏可由MTS1纯合子缺失和杂合子缺失(Loss of heterozygosity，LOH)而残存的MTS1失活、MTS1转录或翻译水平调控异常等原因引起。对原发性肿瘤进行纯合子缺失研究，必须控制标本的污染，因为原发性肿瘤不同于癌细胞株，必定含有正常细胞(如血管内皮细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等)。对原发性肿瘤标本的DNA模板进行PCR扩增时，即使肿瘤细胞缺乏MTS1，因受标本中正常细胞的MTS1污染，也可出现MTS1扩增带。为控制标本的污染，本研究采用了比较PCR法。比较PCR法是在同一扩增体系中加入2对或2对以上的引物(至少1对为内参照引物)，在一定条件下，每1对扩增产物含量与模板含量成正变，根据扩增产物的含量即可推算出模板含量。
为获得可靠的比较PCR结果，内参照位点的选择非常重要。理想的内参照位点应该既不发生缺失也不发生扩增。本文根据X染色体上的FⅧ基因内含子22设计内参照引物，结果发现2例标本的P16/FⅧ扩增带积分密度比高于正常对照可信区间上限，推测可能为标本的FⅧ基因缺失，故予剔除。同样，MTS1缺失的标本可能同时有FⅧ缺失，但不能从积分密度比上反映出来，这使MTS1纯合子缺失率与实际情况相比偏低。1995年Walker等〔11〕根据MTS1邻近区域设计内参照引物，也存在检测序列与内参照引物同时缺失的问题。因此，内参照引物最好根据膀胱肿瘤“完全”不发生异常的位点来设计。
, 百拇医药
原发性膀胱肿瘤的9号染色体或MTS1研究以LOH多见，纯合子缺失研究较少。报道显示，原发性膀胱肿瘤MTS1纯合子缺失率为19%〔3〕，9P21～22纯合子缺失率为20%〔8〕，而膀胱癌细胞株则高达33%〔9〕和57%〔4〕。本文用比较PCR法对35例原发性膀胱肿瘤进行了MTS1纯合子缺失的研究，33例中有6例纯合子缺失，缺失率为18.2%，与文献报道相近。以前对9号染色体缺失研究显示〔4～6〕，9号染色体缺失为膀胱癌发生发展的早期事件，其缺失与膀胱的病理分级和分期无关。此后对9PLOH的研究也显示9PLOH与膀胱肿瘤的病理分级和分期无关〔12〕。本研究显示不同病理分级和分期的膀胱肿瘤MTS1纯合子缺失率无显著性差异，即MTS1纯合子缺失与膀胱肿瘤的病理分级和分期无关，与以前研究的结果一致。
, 百拇医药
参考文献
[1]赫杰，张汝刚，朱丹，等.食管癌C-myc基因扩增的临床意义.中华医学杂志，1995，75：94～96
[2]吴冠芸，方福德主编.基因诊断技术及应用.北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1992.209～209
[3]Spruck C H,Gonzalez-Zulueta M,Shibata M,et al.P16 gene in uncultured tumors.Science,1994,370:183～188
[4]Gibas Z,Proat G R Jr,Conolly J G,et al.Nomrandom chromosomal changes with transitional cell carcinoma of the bladder.Cancer Res,1984,44:1257～1264
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[5]Smeets W,Pauwels R,Laarakkers L,et al.Nonrandom chromosomal analysis of bladder cancer Ⅲ.Cancer Genet Cytogenet,1987,29:29～41
[6]Tsai Y C,Nichols P W,Hiti A L,et al.Allelic losses of chromosome 9,11 and 17 in human bladder cancer.Cancer Res,1990,50:44～47
[7]Rubert J M,Tokino K,Sidransky D.Evidence for two bladder cancer supression loci on human chromosome 9.Cancer Res,1993,53:5093～2095
[8]Stadler W M,Sherman J,Bohlander S K,et al.Homozygous deletions within chromosomal band 9P21～22 in bladder cancer.Cancer Res,1994,54:2060～2063
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[9]Kamb A,Gruis N A,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,364:436～440
[10]Nobori T,Miur K,Wu D J,et al.Deletions of the cyclin-dependent kinass-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature,1994,368:753～756
[11]Walker D G,Duan W,Popovic E A,et al.Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor gene in the progression of human astrocytomas.Cancer Res,1995,55:20～23
[12]Knowles M A,Elder P A,Williamson M,et al.Allelotype of human cancer.Cancer Res,1994,54:531～538
(收稿 1999-12-27), 百拇医药
单位：方德信(汕头大学医学院附属第一医院泌尿外科广东汕头，515000)；熊旭林 鲁功成(同济医科大学附属协和医院泌尿外科)；王宗敏(温州医学院附属第二医院病理科)
关键词：膀胱肿瘤；移行细胞癌；基因；抑制；聚合酶链反应
临床泌尿外科杂志000613 摘要 目的：了解多肿瘤抑制基因-1(MTS1)在膀胱移行细胞癌中的纯合子缺失情况，探讨MTS1纯合子缺失在膀胱移行细胞癌发生与发展中的意义。方法：收集温州医学院手术切除的膀胱移行细胞癌石蜡标本35例，采用比较PCR法检测其MTS1纯合子缺失情况。结果：剔除2例不可比标本，33例标本中，MTS1纯合子缺失6例，缺失率为18.2%。其中Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级膀胱移行细胞癌MTS1纯合子缺失率分别为18.2%(2/11)、20.0%(3/15)和14.3%(1/7)；Tis～T1期肿瘤和T2～T4期肿瘤MTS1纯合子缺失率分别为22.2%(4/18)和13.3%(2/15)，各级和各期肿瘤的MTS1纯合子缺失率无显著性差异(P>0.05)。结论：MTS1纯合子对膀胱移行细胞癌的发生起一定作用，但与肿瘤的进展无关。
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Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor
gene 1 in the transitional cell carcinoma of the bladder
FANG De-xin
(Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Shantou,Guangdong,515000)
XIONG Xu-lin LU Gong-cheng
(Department of Urology,the Affiliated Union Hospital of Tongji Medical University)
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WANG Zong-min
(Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College)
Abstract Purpose:To understand the states of homozygous deletions of the multiple tumor suppressor
gene 1(MTS1) in the transitional cell carcinoma of the bladder and their significance. Methods:Paraffin embebed specimens from 35 cases of patients with transitional cell carcinoma of the bladder was detected by the comparative PCR for homozygous deletions of MTS1.Results:Discarding 2 samples which was not comparable,homozygous loss of MTS1 was found in 6 of 33 samples ,loss rate was 18.3%.The loss rate in grade Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ tumor was 18.2% (2/11),20.0% (3/15) and14.3%(1/7) respectively;the loss rate in the superficial tumors (Tis,T1) and the invasive tumors was22.2% (4/18) and 13.3% (2/15) respectively.There wasn′t statistically significant difference between histological grades and between pathological stages(P>0.05).Conclusions:The results showed that the homozygous deletions of MTS1 was correlated with the development in some transitional cell carcinoma of the bladder, but wasn′t correlated with the progression.
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Key words Bladder tumor Transitional cell carcinoma Gene,suppressor Polymeruse chain reaction
多肿瘤抑制基因-1(Multiple tumor suppressor gene-1，MTS1)是1994年发现的一种抗癌基因，其缺失与多种肿瘤的发生发展有关。国外研究显示，MTS1缺失与膀胱移行细胞癌的发生发展有一定关系。为了解原发性膀胱移行细胞癌的MTS1纯合子缺失情况，探讨MTS1纯合子缺失与肿瘤发生发展的关系，本研究采用比较PCR法对35例膀胱移行细胞癌MTS1纯合子缺失情况进行研究，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
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选择温州医学院附属第二医院1990～1996年手术切除的膀胱移行细胞癌标本35例，男31例，女4例，年龄27～81岁，平均60.3岁。标本经10%甲醛固定，石蜡包埋。标本按WHO标准进行病理分级，按UICC标准进行病理分期。Ⅰ级11例，Ⅱ级16例，Ⅲ级8例；Tis～T1期19例，T2～T4期16例。另选取男性正常膀胱粘膜蜡块和女性正常肾组织蜡块作正常对照。
1.2 标本处理方法
参照文献〔1〕报道的方法并加以改进。取4 μm切片2张，置入1.5 ml EP管中，加入1 ml二甲苯脱蜡，每次15 min共行2次，再加入无水乙醇去除二甲苯，每次5 min共行2次。上述每步之间均按1 500 r/min速度离心1 min，去上清液。沉淀组织吹干后加入20 μl超纯水，置75℃水浴2 h，混入DNA混悬液，置入4℃冰箱中保存待检。
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1.3 PCR引物设计
P16外显子2引物(P引物)购自北京中山生物工程公司，扩增片段长度为244 bp。其引物序列为：
P1：5-ACAAGCTTCCTTTCCGTCATGCCG-3
P2：5-CCAGGCATCGCGCACGTCCA-3
内参照引物根据X染色体FⅧ基因的内合子22进行设计(F引物)，由美国赛白盛公司合成，扩增片段长度为96 bp。其引物序列为：
F1：5-CACGAGCTCTCCATCTGAACATG-3
F2：5-GGGCTGCAGGGGGGGGGGACAACAG-3
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1.4 PCR扩增方法
PCR体系的建立：参照文献〔2〕报道的方法并加以改进。50 μl PCR体系含DNA混悬液20 μl、10×PCR缓冲液(500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris HCl，1 g/L动物胶，pH为8.3)5 μl、MgCl2(25 mmol/L)3 μl、dNTP(10 mmol/L)2 μl、去离子甲酰胺2 μl、P16引物(20 μm/L)P1和P2各1 μl、FⅧ引物(10 μm/L)F1和F2各2 μl、高纯水12 μl。上述体系在98℃中预变性5 min，加国产Taq酶(5×106 u/L)0.5 μl，加50 μl石蜡油覆盖。
循环条件：采用北京产1190型DNA扩增仪。将上述扩增体系置入PCR扩增仪，按以下条件扩增：95℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，30个循环后，72℃再延伸5 min。
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1.5 PCR扩增产物鉴定方法
取PCR产物10 μl，与加样缓冲液混匀，加至含溴化乙锭的2% Nusieve琼脂糖凝胶板的加样孔中。另取1 μl Maker〔pGEM-3 zf(+)/HaeⅢ，购自华美公司〕，与电泳缓冲液9 μl及加样缓冲液混匀后加至加样孔作为对照。稳压电泳(3.7 V/cm)30 min后在紫外线灯下观察结果，并参照Marker带鉴定特异性的P16扩增片段(244 bp)和FⅧ扩增片段(96 bp)。
1.6 图像分析
紫外线灯下摄影，再对胶片进行图像分析，得出标本P引物扩增带和F引物扩增带的积分密度比，并得出10次正常男性膀胱粘膜组织蜡块切片两条扩增带密度比的平均值(95%可信区间为0.52±0.07)和10次正常女性肾组织蜡块切片的平均值(95%可信区间为0.38±0.04)。
1.7 统计学处理
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对不同病理分级和分期的膀胱肿瘤MTS1纯合子缺失率进行χ2检验。
2 结果
2.1 PCR结果
PCR扩增产物经电泳分离后出现两条扩增带，一条在244 bp位置，为P16，另一条在96 bp位置，为FⅧ(图1)。以肿瘤标本P引物扩增带和F引物扩增带积分密度比低于正常对照均值的20%为纯合子缺失标准〔3〕，并剔除2例两带积分密度比高于正常对照可信区间上限的肿瘤标本，结果33例标本中有6例纯合子缺失，缺失率为18.2%。
图1 5例膀胱移行细胞癌和正常膀胱粘膜的PCR结果
2.2 不同病理分级与分期肿瘤MTS1纯合子缺失情况
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不同分级肿瘤的MTS1纯合子缺失情况见表1。经χ2检验，各级肿瘤间(Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅰ级与Ⅲ级)MTS1纯合子缺失率无显著性差异(P>0.05)。
表1 不同分级肿瘤的MTS1纯合子缺失情况
例 病理分级
例数
缺失例数
缺失率/%
Ⅰ级
11
2
18.21)
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Ⅱ级
15
3
20.01)
Ⅲ级
7
1
14.31)
合计
33
6
18.2
1) 经χ2检验，P>0.05 不同分期肿瘤的MTS1纯合子缺失情况见表2。经χ2检验，Tis～T1期肿瘤和T2～T4期肿瘤间MTS1纯合子缺失率无显著性差异(P>0.05)。
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表2 不同分期肿瘤的MTS1纯合子缺失情况
例 病理分期
例数
缺失例数
缺失率/%
Tis～T1期
18
4
22.21)
T2～T4期
15
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2
13.31)
合计
33
6
18.2
1) 经χ2检验，P>0.053 讨论
原发性膀胱肿瘤的细胞遗传学研究显示〔4～6〕，原发性肿瘤存在频繁的9号染色体缺失，因而提出9号染色体可能存在肿瘤抑制基因。随后，研究者开始用分子遗传学方法寻找这种假设的肿瘤抑制基因位点，随着研究的深入，发现9P21〔7〕或9P21～22〔8〕区域存在肿瘤抑制基因，进而在9P21区域终于发现MTS1的存在〔9，10〕。MTS1由3个外显子(长度分别为120 bp、307 bp和11 bp)和2个内含子组成。MTS1编码一种分子量为16 000的蛋白质，故又称为P16基因。P16蛋白为细胞周期素D(Cyclin D)/细胞周期素D依赖的蛋白激酶-4(Cyclin D dependent kinase 4，CDK4)复合物的抑制蛋白，故又称P16 ink4或CDK4 I(Inhibiter of CDK4)。P16蛋白参与细胞周期G期的调控，通过抑制Cyclin D/CDK4复合物的活性，从而抑制细胞从G1期进入S期。P16蛋白的缺乏将使细胞周期失控，从而导致细胞癌变。
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正常功能的P16蛋白缺乏可由MTS1纯合子缺失和杂合子缺失(Loss of heterozygosity，LOH)而残存的MTS1失活、MTS1转录或翻译水平调控异常等原因引起。对原发性肿瘤进行纯合子缺失研究，必须控制标本的污染，因为原发性肿瘤不同于癌细胞株，必定含有正常细胞(如血管内皮细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等)。对原发性肿瘤标本的DNA模板进行PCR扩增时，即使肿瘤细胞缺乏MTS1，因受标本中正常细胞的MTS1污染，也可出现MTS1扩增带。为控制标本的污染，本研究采用了比较PCR法。比较PCR法是在同一扩增体系中加入2对或2对以上的引物(至少1对为内参照引物)，在一定条件下，每1对扩增产物含量与模板含量成正变，根据扩增产物的含量即可推算出模板含量。
为获得可靠的比较PCR结果，内参照位点的选择非常重要。理想的内参照位点应该既不发生缺失也不发生扩增。本文根据X染色体上的FⅧ基因内含子22设计内参照引物，结果发现2例标本的P16/FⅧ扩增带积分密度比高于正常对照可信区间上限，推测可能为标本的FⅧ基因缺失，故予剔除。同样，MTS1缺失的标本可能同时有FⅧ缺失，但不能从积分密度比上反映出来，这使MTS1纯合子缺失率与实际情况相比偏低。1995年Walker等〔11〕根据MTS1邻近区域设计内参照引物，也存在检测序列与内参照引物同时缺失的问题。因此，内参照引物最好根据膀胱肿瘤“完全”不发生异常的位点来设计。
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原发性膀胱肿瘤的9号染色体或MTS1研究以LOH多见，纯合子缺失研究较少。报道显示，原发性膀胱肿瘤MTS1纯合子缺失率为19%〔3〕，9P21～22纯合子缺失率为20%〔8〕，而膀胱癌细胞株则高达33%〔9〕和57%〔4〕。本文用比较PCR法对35例原发性膀胱肿瘤进行了MTS1纯合子缺失的研究，33例中有6例纯合子缺失，缺失率为18.2%，与文献报道相近。以前对9号染色体缺失研究显示〔4～6〕，9号染色体缺失为膀胱癌发生发展的早期事件，其缺失与膀胱的病理分级和分期无关。此后对9PLOH的研究也显示9PLOH与膀胱肿瘤的病理分级和分期无关〔12〕。本研究显示不同病理分级和分期的膀胱肿瘤MTS1纯合子缺失率无显著性差异，即MTS1纯合子缺失与膀胱肿瘤的病理分级和分期无关，与以前研究的结果一致。
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(收稿 1999-12-27), 百拇医药