RT-PCR检测原发性肝细胞癌患者外周血中AFPmRNA 表达的临床应用
作者：索标
单位：包头医学院一附院消化内科，内蒙古 包头 014010
关键词：
包头医学院学报000485
中图分类号 R446.61 文献标识码 A 文章编号 1006-740X(2000)04-0386-04
肿瘤的转移和复发是影响患者预后的重要因素，循环外周血液中存在的肿瘤细胞或骨髓中浸润的肿瘤细胞是肿瘤转移和复发的主要原因。应用逆转录-DNA聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测存在于原发性肝细胞癌(HCC)患者外周血或骨髓中的AFPmRNA，是近年来发展起来的新方法，该法敏感性高，特异性强[1]，该法的推广应用不仅有助于判断肿瘤的转移和复发，而且也可能为临床选择、评价治疗方案提供有效的依据。外周血中肿瘤细胞的检测是判断肿瘤转移、复发、疗效及预后的重要指标。动物实验研究表明循环中的肿瘤细胞大约0.01%最终产生转移灶，即单一转移灶的形成大约需1万个循环的肿瘤细胞，相当于每毫升血中存在2个肿瘤细胞[2]。如此微量的肿瘤细胞，用传统的方法如免疫化学方法很难检测，近年来发展起来的RT-PCR技术可以检测存在于外周血中的微量肿瘤细胞。该法敏感性高，可检测每毫升血中存在的1个肿瘤细胞，且特异性强，很少出现假阳性[3]，也可以定量检测肿瘤细胞[4]。
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1 RT-PCR基本原理及靶RNA的选择
RT-PCR是对经典PCR技术的改造，是以RNA为模板，联合逆转录反应与聚合酶链反应检测RNA表达的新技术。检测肿瘤细胞的基本原理是通过在患者的血中或骨髓中扩增出肿瘤细胞的“标志性”靶RNA来证实肿瘤细胞的存在。因此选择恰当的靶RNA是决定检测结果是否准确可靠的重要因素。AFPmRNA是成人肝细胞癌变后AFP基因表达产物，是从癌灶脱落入血的肝癌细胞的标志。AFPmRNA可作为HCC的标志基因[5]。检测HCC患者外周血或骨髓中的AFPmRNA不仅有助于判断肿瘤的转移、复发，而且也为临床选择、评价治疗方案及对肝移植患者的选择提供有效的依据。AFPmRNA的检测比血清AFP的检测更有意义。
2 敏感性和特异性
2.1 RT-PCR检测肿瘤细胞敏感性高 国外学者通过有限系列稀释法证明，RT-PCR对于血中及骨髓中肿瘤细胞的检出极限为10-5～10-6,即可以检出存在于105～106个正常细胞中的一个肿瘤细胞[6]。也有人报告该法可检测每毫升血中存在的一个癌细胞[7]。
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2.2 RT-PCR检测肿瘤细胞特异性强 RT-PCR的特异性是由于其扩增引物的高度选择性决定的，即引物与扩增片段的结合呈高选择性及高度专一性。
3 RT-PCR的方法
RT-PCR检测外周血中的肿瘤细胞，关键在于选择肿瘤细胞特异表达而血细胞不表达的基因做为标志基因，标志基因的核酸序列应已知或部分已知，以便设计引物。RT-PCR的一般步骤如下：(1)静脉收集血标本，分离有核细胞；(2)提取细胞总RNA；(3)取1～2μg总RNA逆转录为cDNA；(4)PCR反应；(5)观察结果。
4 RT-PCR检测HCC外周血中肿瘤细胞的临床应用
HCC是常见的恶性肿瘤，其死亡率在消化系肿瘤中占第三位。Komeda[8]等检测了64例HCC病人和48例对照病人(其中包括31例良性肝病病人，8例转移性肝癌病人，9例正常肝脏的其它脏器疾患病人)的外周血AFPmRNA。在64例病人中23例检测到了AFPmRNA(36%)，其中17例病人没有临床可见的转移灶。48例对照组中没有1例检出AFPmRNA，出现肝外转移组阳性率100%。在临床上有些病人血清中AFP并没有增高，但却可以检测到AFPmRNA，推测有些肝癌细胞没有分泌AFP到细胞外[9]。此外有统计资料表明，AFPmRNA的检出率与肿瘤大小、临床分期、血浆AFP水平、门脉血检形成及肝内、外转移是乎密切相关[10]，而血清AFP则不能反映上述变化，因此临床上检测AFPmRNA可能比检测血清AFP更有意义，它可判断血中肿瘤细胞是否存在，这对于HCC复发、转移的判断有重要参考价值，并对肝移植患者的选择有指导意义。肝移植从理论上讲可以治疗肝癌，但肝移植后常发生复发和转移，其原因是肝移植前HCC患者体中存在未发现的转移灶[11]。故此肝硬化尤其是坏死后性肝硬化是目前肝移植的主要适应证[12]，但随着RT-PCR检测HCC外周血中AFPmRNA技术的开展及完善，通过对HCC患者外周血中是否存在肿瘤细胞的提前预测及对拟行肝移植HCC患者更加严格的选择，有望使肝移植在HCC的治疗中取得突破性的进展。
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Hillalre[13]等研究认为HCC患者外周血中白蛋白mRNA也是反映肝癌细胞存在的良好指标，其检出率与HCC的临床分期、肿瘤的转移、复发相关[14]。但Matsumura[15]等发现白蛋白mRNA在急慢性肝病、健康志愿者血中均能检出，假阳性率较高，国内黄智铭[14]等研究也认为白蛋白mRNA是否适合作为检测HCC患者血中肿瘤细胞的标志尚需要进一步临床研究来证实。
随着肿瘤分子生物学的深入研究，肿瘤特异的基因改变逐渐为我们所认识。很多基因可以作为标志基因用来反映外周血中相应肿瘤细胞的存在。应用RT-PCR技术检测存在于外周血中的微量肿瘤细胞是近年来发展起来的新方法，该法敏感性高，特异性强，随着研究的深入，该法必将在肿瘤的临床诊断和治疗中发挥更大的作用。
作者简介：索标(1966-)，男，蒙古族，内蒙古包头人，学士，主治医师。
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参考文献
[1] 高英堂.RT-PCR检测外周血中肝癌细胞的研究进展[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1999，20(6)：259.
[2] 郭文忠，李申德，俞善丁.RT-PCR技术检测外周血中的肿瘤细胞[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1997，18(1)：17～19.
[3] 何蕴韶.聚合酶链反应技术在医学检验中的应用和展望[J].中华医学检验杂志，1999，22(3)：133.
[4] 郑晓勇，林芷英.特定mRNA的定量检测[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1997，18(1)：35.
[5] 胡成进，扬道理.AFP的基因结构和AFPmRNA的检测方法及应用前景[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1998，19(3)：129.
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[6] PfleidererC,ZoubekA,Gruber B,et al.Detection of tumor cells in peripheral blood and bone marrow from Ewing tumor patients by RT-PCR[J].Int J Cancer,1995，64(2):135～139.
[7] Burchill SA,Bradbury FM,Smith B,et al.Neuroblastoma cell detection by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)for tyrosine hydorxylase mRNA[J].Int J Cancer,1994，63(5):671～675.
[8] Komeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitive detection of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood[J].Cancer,1995，75(9):2214～2219.
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[9] 罗元辉，王东旭，房殿春.RT-PCR技术检测外周血\骨髓中肿瘤细胞[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1997，18(1)：24～26.
[10] 胡成进，扬道理.肿瘤标志物在原发性肝细胞癌中的应用[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1997，18(5)：229.
[11] 刘彦君，吴孟超.肝癌患者循环中检出甲胎蛋白mRNA表明其有血路扩散并可预示有肝癌转移[J].国外医学(消化系统疾病分册)，1995，15(3)：188.
[12] 许国铭，李石.现代消化病学[M].北京：人民军医出版社，1999，1141.
[13] Hillaire S,Barbu V,Boucher E,et al.Albumin messenger RNA as a marker of circulating hepatocytes in hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology,1994，106(1):239～242.
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[14] 黄智铭，袁世珍，朱兆华，等.肝癌患者周围血中蛋白mRNA检测[J].中华内科杂志，1998，37(1)：10.
[15] Matsumura M,Niwa Y,Kato N,et al.Detection of alphafetoprotein mRNA,an indicator of hematogenous spreading hepatocellular carcinoma,in the circulation:a possible predictor of metastatic hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,1994，20(6):1418～1425.
收稿日期：2000-10-08, http://www.100md.com
单位：包头医学院一附院消化内科，内蒙古 包头 014010
关键词：
包头医学院学报000485
中图分类号 R446.61 文献标识码 A 文章编号 1006-740X(2000)04-0386-04
肿瘤的转移和复发是影响患者预后的重要因素，循环外周血液中存在的肿瘤细胞或骨髓中浸润的肿瘤细胞是肿瘤转移和复发的主要原因。应用逆转录-DNA聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测存在于原发性肝细胞癌(HCC)患者外周血或骨髓中的AFPmRNA，是近年来发展起来的新方法，该法敏感性高，特异性强[1]，该法的推广应用不仅有助于判断肿瘤的转移和复发，而且也可能为临床选择、评价治疗方案提供有效的依据。外周血中肿瘤细胞的检测是判断肿瘤转移、复发、疗效及预后的重要指标。动物实验研究表明循环中的肿瘤细胞大约0.01%最终产生转移灶，即单一转移灶的形成大约需1万个循环的肿瘤细胞，相当于每毫升血中存在2个肿瘤细胞[2]。如此微量的肿瘤细胞，用传统的方法如免疫化学方法很难检测，近年来发展起来的RT-PCR技术可以检测存在于外周血中的微量肿瘤细胞。该法敏感性高，可检测每毫升血中存在的1个肿瘤细胞，且特异性强，很少出现假阳性[3]，也可以定量检测肿瘤细胞[4]。
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1 RT-PCR基本原理及靶RNA的选择
RT-PCR是对经典PCR技术的改造，是以RNA为模板，联合逆转录反应与聚合酶链反应检测RNA表达的新技术。检测肿瘤细胞的基本原理是通过在患者的血中或骨髓中扩增出肿瘤细胞的“标志性”靶RNA来证实肿瘤细胞的存在。因此选择恰当的靶RNA是决定检测结果是否准确可靠的重要因素。AFPmRNA是成人肝细胞癌变后AFP基因表达产物，是从癌灶脱落入血的肝癌细胞的标志。AFPmRNA可作为HCC的标志基因[5]。检测HCC患者外周血或骨髓中的AFPmRNA不仅有助于判断肿瘤的转移、复发，而且也为临床选择、评价治疗方案及对肝移植患者的选择提供有效的依据。AFPmRNA的检测比血清AFP的检测更有意义。
2 敏感性和特异性
2.1 RT-PCR检测肿瘤细胞敏感性高 国外学者通过有限系列稀释法证明，RT-PCR对于血中及骨髓中肿瘤细胞的检出极限为10-5～10-6,即可以检出存在于105～106个正常细胞中的一个肿瘤细胞[6]。也有人报告该法可检测每毫升血中存在的一个癌细胞[7]。
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2.2 RT-PCR检测肿瘤细胞特异性强 RT-PCR的特异性是由于其扩增引物的高度选择性决定的，即引物与扩增片段的结合呈高选择性及高度专一性。
3 RT-PCR的方法
RT-PCR检测外周血中的肿瘤细胞，关键在于选择肿瘤细胞特异表达而血细胞不表达的基因做为标志基因，标志基因的核酸序列应已知或部分已知，以便设计引物。RT-PCR的一般步骤如下：(1)静脉收集血标本，分离有核细胞；(2)提取细胞总RNA；(3)取1～2μg总RNA逆转录为cDNA；(4)PCR反应；(5)观察结果。
4 RT-PCR检测HCC外周血中肿瘤细胞的临床应用
HCC是常见的恶性肿瘤，其死亡率在消化系肿瘤中占第三位。Komeda[8]等检测了64例HCC病人和48例对照病人(其中包括31例良性肝病病人，8例转移性肝癌病人，9例正常肝脏的其它脏器疾患病人)的外周血AFPmRNA。在64例病人中23例检测到了AFPmRNA(36%)，其中17例病人没有临床可见的转移灶。48例对照组中没有1例检出AFPmRNA，出现肝外转移组阳性率100%。在临床上有些病人血清中AFP并没有增高，但却可以检测到AFPmRNA，推测有些肝癌细胞没有分泌AFP到细胞外[9]。此外有统计资料表明，AFPmRNA的检出率与肿瘤大小、临床分期、血浆AFP水平、门脉血检形成及肝内、外转移是乎密切相关[10]，而血清AFP则不能反映上述变化，因此临床上检测AFPmRNA可能比检测血清AFP更有意义，它可判断血中肿瘤细胞是否存在，这对于HCC复发、转移的判断有重要参考价值，并对肝移植患者的选择有指导意义。肝移植从理论上讲可以治疗肝癌，但肝移植后常发生复发和转移，其原因是肝移植前HCC患者体中存在未发现的转移灶[11]。故此肝硬化尤其是坏死后性肝硬化是目前肝移植的主要适应证[12]，但随着RT-PCR检测HCC外周血中AFPmRNA技术的开展及完善，通过对HCC患者外周血中是否存在肿瘤细胞的提前预测及对拟行肝移植HCC患者更加严格的选择，有望使肝移植在HCC的治疗中取得突破性的进展。
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Hillalre[13]等研究认为HCC患者外周血中白蛋白mRNA也是反映肝癌细胞存在的良好指标，其检出率与HCC的临床分期、肿瘤的转移、复发相关[14]。但Matsumura[15]等发现白蛋白mRNA在急慢性肝病、健康志愿者血中均能检出，假阳性率较高，国内黄智铭[14]等研究也认为白蛋白mRNA是否适合作为检测HCC患者血中肿瘤细胞的标志尚需要进一步临床研究来证实。
随着肿瘤分子生物学的深入研究，肿瘤特异的基因改变逐渐为我们所认识。很多基因可以作为标志基因用来反映外周血中相应肿瘤细胞的存在。应用RT-PCR技术检测存在于外周血中的微量肿瘤细胞是近年来发展起来的新方法，该法敏感性高，特异性强，随着研究的深入，该法必将在肿瘤的临床诊断和治疗中发挥更大的作用。
作者简介：索标(1966-)，男，蒙古族，内蒙古包头人，学士，主治医师。
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参考文献
[1] 高英堂.RT-PCR检测外周血中肝癌细胞的研究进展[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1999，20(6)：259.
[2] 郭文忠，李申德，俞善丁.RT-PCR技术检测外周血中的肿瘤细胞[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1997，18(1)：17～19.
[3] 何蕴韶.聚合酶链反应技术在医学检验中的应用和展望[J].中华医学检验杂志，1999，22(3)：133.
[4] 郑晓勇，林芷英.特定mRNA的定量检测[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1997，18(1)：35.
[5] 胡成进，扬道理.AFP的基因结构和AFPmRNA的检测方法及应用前景[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1998，19(3)：129.
, http://www.100md.com
[6] PfleidererC,ZoubekA,Gruber B,et al.Detection of tumor cells in peripheral blood and bone marrow from Ewing tumor patients by RT-PCR[J].Int J Cancer,1995，64(2):135～139.
[7] Burchill SA,Bradbury FM,Smith B,et al.Neuroblastoma cell detection by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)for tyrosine hydorxylase mRNA[J].Int J Cancer,1994，63(5):671～675.
[8] Komeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitive detection of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood[J].Cancer,1995，75(9):2214～2219.
, 百拇医药
[9] 罗元辉，王东旭，房殿春.RT-PCR技术检测外周血\骨髓中肿瘤细胞[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1997，18(1)：24～26.
[10] 胡成进，扬道理.肿瘤标志物在原发性肝细胞癌中的应用[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，1997，18(5)：229.
[11] 刘彦君，吴孟超.肝癌患者循环中检出甲胎蛋白mRNA表明其有血路扩散并可预示有肝癌转移[J].国外医学(消化系统疾病分册)，1995，15(3)：188.
[12] 许国铭，李石.现代消化病学[M].北京：人民军医出版社，1999，1141.
[13] Hillaire S,Barbu V,Boucher E,et al.Albumin messenger RNA as a marker of circulating hepatocytes in hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology,1994，106(1):239～242.
, 百拇医药
[14] 黄智铭，袁世珍，朱兆华，等.肝癌患者周围血中蛋白mRNA检测[J].中华内科杂志，1998，37(1)：10.
[15] Matsumura M,Niwa Y,Kato N,et al.Detection of alphafetoprotein mRNA,an indicator of hematogenous spreading hepatocellular carcinoma,in the circulation:a possible predictor of metastatic hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,1994，20(6):1418～1425.
收稿日期：2000-10-08, http://www.100md.com