半导体激光光针对大鼠脑神经递质和血浆丙二醛的影响*
作者：刘珊林1 施冬云2 王如瑶2 成柏华2
单位：1.上海市上海医科大学生物化学教研室(200032) 2.上海第二医科大学
关键词：半导体激光；脑神经递质；丙二醛
中国激光医学杂志980304Effect of Diode Laser Acupuncture on Neurotransmitter Monoamines
in Brain and Malondialdehyde in Plasma of Rats
Liu Shanlin
Department of Biochemistry, Shanghai Medical University, Shanghai(200032)
, http://www.100md.com
Shi Dongyun, Wang Ruyao, Cheng Baihua
Shanghai Second Medical University, Shanghai
摘要 为探讨低强度激光产生生物效应的机制，采用半导体激光器(波长650 nm，功率10mW，连续可调)，对雄性SD大鼠和自发性高血压大鼠进行颈部“扶突”穴穴位照射，用高效液相色谱电化学检测方法测脑干和尾核中五羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺等单胺类神经递质含量，用TBA荧光法测定血浆中丙二醛(MDA)，同时用氢清除法组织血流仪监测大鼠海马区的脑血流量。结果提示，光照后，海马脑血流量下降，脑干和尾核中单胺类神经递质含量明显下降，而血浆中MDA含量略有上升。揭示激光照射“扶突”穴会引起单胺类神经递质下降。
ABSTRACT
The male SD rats and spontaneous hypertensive rats(SHR) were irradiated on “Futu” acupoints by 650 nm, 10 mW, CW diode laser acupunctrure. The concentration of hydroxytryptamine (5-HT), norepinephrine (NE), and dopamine (DA) in brain stem and caudate nucleus of rats were detected by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Malondialdehyde (MDA) was analyzed with the thiobarbituric (TBA) test by fluorometry. Cerebral blood flow (CBF) in rats hippocampus was detected. The results show: The CBF in rats hippocampus decreased, the content of neurotransmitter monamines in brain stem and caudate nucleus decreased significantly, but MDA in plasma increased slightly. The relation between laser irradiation and free radical concentration has been studying further now.
, 百拇医药
Key words Diode laser, Brain neurotransmitter, Malondiadehyde
激光照射已广泛应用于临床治疗，其中低强度激光照射对慢性炎症的治疗效果已得到肯定，并且实验证明可提高非特异性免疫能力；还发现对心脑血管疾患有一定效果，包括可降低血压，改善心血管功能[1]。但是低强度激光照射所产生的一些生物效应，其机制尚不很清楚。本课题组曾利用高血压大鼠模型，采用半导体激光器对“扶突”、“人中”等穴位进行低强度激光照射，发现有脑血流量减慢、血压下降的效果。为探索产生效应的机制，选用波长650 nm、功率10 mW的半导体激光，对大鼠“扶突”穴照射，并取脑组织中的脑干和尾核，进行神经递质多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和五羟色胺(5-HT)的测定，同时取血浆测定丙二醛(MDA)含量，以了解激光照射是否会引起自由基损伤。通过对测定结果分析，发现低强度激光照射后，神经递质DA、NE和5-HT，都有明显降低，而血液中的丙二醛含量却升高。
, http://www.100md.com
材料和方法
一、动物分组
雄性SD大鼠40只，体重210 g～250 g，随机分为对照组和照射组各20只。高血压大鼠组14只(由上海市高血压研究所提供)。
二、试剂
20%氨基甲酸乙酯(Urethane)，0.1 mol/L HClO4，DA、NE和5-HT标准品(Sigma公司)，硫代巴比妥酸(TBA)，四乙氧基丙烷(TEP，超纯试剂，TOKOYO公司)，NaAC，甲醇。实验所用试剂除注明外均为分析纯，水为重蒸水。
三、仪器
半导体激光器，岛津LC-9A高效液相色谱仪，日立F-3000型荧光分光光度计。
, 百拇医药
四、激光照射
采用650 nm、10 mW、CW持续照射大鼠颈部“扶突”穴位。照射前，各组用20%氨基甲酸乙酯按每公斤体重5 ml剂量麻醉，在海马区钻孔，剥离脑膜，插入铂黑电极，深2 mm，吸入氢气。高血压大鼠组应用氢清除法组织血流测定仪监测海马区血流量，并用尾部测压法测量血压。照射5 min后，重复测定血流量和血压变化。其余二组仅作假手术处理。照射组的激光照射时间也为5 min；二组分别取脑组织和血液待处理。
五、样品处理
脑组织：大鼠断头，在冰浴中取脑组织，脑干和尾核分别称重，以冰冷0.1 mol/L HClO4制成匀浆，在4℃、15 000 g离心30 min，取上清液，在-30℃以下保存待测。取全血1 ml，抗凝，离心，取血浆在-20℃保存待测。
六、测定
, http://www.100md.com
以高效液相色谱电化学检测法测脑组织中的DA、NE和5-HT[2]。流动相：85% 0.15 mol/LNaAC-NaOH缓冲液(含EDTA0.83 mmol/L和CSA 9 mmol/L，PH4.2)，15%甲醇，使用前以0.22 μm滤膜过滤，并脱气，流速1.0 ml/min。电化学工作电压0.7 V，检测灵敏度为5 nA，进样量20 μl。血液MDA测定采用TBA荧光方法。
七、统计学处理
采用STATPAL软件包，用t检验方法处理。
结 果
一、高血压大鼠在激光照射前后，脑血流量和血压都有变化。见表1。表明经“扶突”穴照射，平均脑血流量和平均血压都比照射前有所下降，虽未达到统计学显著性，但已反映出很有意义的倾向。
, http://www.100md.com 二、照射组大鼠脑干和尾核的神经递质含量和血液的MDA含量，与对照组相比，也有变化。表2说明，激光照射“扶突”穴后，脑干和尾核中的单胺类神经递质都明显下降，经统计学处理，差异有显著性。而血浆中的MDA，照射前为4.93 nmol/ml±0.95nmol/ml，照射后为5.28 nmol/ml±1.25nmol/ml，稍有上升，但无统计学意义
表1 波长650 nm半导体激光对高血压大鼠组脑血流量和血压的影响(14只，
±s)
Tab.1 Effect of diode laser (650 nm) irradiation on CBF and blood pressure(n=14，±s)
, http://www.100md.com
照射前
Before irradiation
照射后
After irradiation
t值
t value
P值
P value
脑血流量CBF(ml*100g-1*min-1)
39.04±23.53
30.5±16.22
, http://www.100md.com
1.118
>0.05
血压BP(kPa)
(mmHg)
14.61±3.89
109.57±29.19
12.17±3.60
91.28±27.04
1.728
>0.05
表2 波长650 nm半导体激光对脑组织神经递质含量的影响(20只,±s, ng/g)
, 百拇医药
Tab.2 Effect of diode laser (650 nm) irradiation on the brain neurotransmitters
content(n=20,±s, ng/g)
脑干 Brain stem
尾核 Caudate nucleus
对照组
Controlled
照射组
, http://www.100md.com Irradiated
t值
t value
P值
P value
对照组
Controled
照射组
Irradiated
t值
t value
P值
P value
, 百拇医药
5-HT
254±62
214±42
2.328
<0.05
279±91
183±26
4.434
<0.05
NE
234±43
194±29
3.361
, 百拇医药
<0.05
123±23
104±32
2.102
<0.05
DA
800±56
566±87
9.832
<0.05
1 029±71
972±76
2.389
, 百拇医药
<0.05
(P>0.05)。
讨 论
根据祖国医学理论，治疗高血压或中风，常取穴于手阳明大肠经穴位。“扶突”穴是该经中的穴位，选择“扶突”为主要穴位进行低强度激光照射，发现也有降血压效应；激光照射“人中”穴也有类似现象，说明降血压效应可能与经络有关。在降低血压的同时，还发现血流量也降低，显然血压的变化与血流量改变有关。为了弄清产生效应的机制，测定了与血管收缩有关的单胺类神经递质的含量。发现在激光照射“扶突”穴后，其含量都发生下降的变化。已知NE可兴奋α-受体，后者具有收缩血管的作用，脑血管是α-受体的效应器，所以NE含量下降有助于脑血管扩张，从而使脑血流量下降。已知5-HT能引起冠状动脉收缩[3,4]，实验证明它比苯肾上腺素的作用还要强，并且能增强NE血管紧张素Ⅱ收缩血管的作用，所以5-HT含量下降，显然也有助于心血管的扩张，改善心血管功能[5]。DA在脑组织中含量较高，实验证明，大剂量使用DA，有明显收缩血管的作用[6]。Chapler等[7]和Shepperson等[8]证实，DA主要通过激动外周血管α2-受体，发挥其收缩血管的作用，所以DA含量下降，有助于降低外周血管阻力。
, 百拇医药
根据单胺类神经递质具收缩血管的作用以及其光照后含量发生变化，可以说明，激光照射某些穴位，引起血压和血流量下降的效应与植物神经系统的调节有关。具体是通过单胺类神经递质含量下降来降低交感神经的兴奋性，从而降低血压、改善心血管功能。研究发现，不同的照射功率和时间，对免疫能力会产生正、负相关的效应[9]；功率过大，时间过长，可能产生损伤。所以同时测定了激光照射前后，与脂质过氧化损伤有关的血浆MDA含量的变化，发现MDA稍有升高，虽未达到统计学显著性，但已提醒我们，激光照射也伴有自由基损伤的倾向，必须注意可能带来的副作用。体外实验已证明NE具有抑制脂质过氧化的作用[10]，我们的实验证明，NE、DA和5-HT都具有不同程度的清除自由基的作用，所以单胺类神经递质含量的下降，可能也伴有对自由基清除能力的下降。激光照射引起单胺类神经递质下降与自由基反应的关系，现正在深入研究中。
*国家自然科学基金资助项目
参 考 文 献
, 百拇医药
1.曾真，傅丽萍，黄军饶，等.半导体激光光针降血压及改善心血管功能的即刻疗效.中国激光医学杂志，1997，6：72.
2.Wagner J, Vitali P, Palfreyman MG, et al. Simultaneous determination of 3,4-dihydroxyphenylalanine, 5-hydroxytryptophan, dopamine, 4-hydroxy-3-methoxyphenylalanine, norepinephrine, 3,4-dihydroxy-
phenylacetic acid, homovanillic acid, serotonin, and 5-hydroxyindoleacetic acid in rat cerebrospinal fluid and brain by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. J Neurochem, 1982, 38：1241.
, http://www.100md.com
3.彭悦.针刺治疗冠心病研究概况.中国针灸，1983，(6)：43.
4.周逸平，王晓，方斌，等.心经经脉与相应脏腑相关的研究.针灸临床杂志，1997，13(3)：20.
5.孟竟壁，刘瑞庭，须慧仁，等.针刺对实验性心肌缺血对冠脉血流量的测定.中国针灸，1982，(2)：22.
6.王俊科，孙瑞，盛卓人，等.血液稀释下多巴胺和多巴酚丁胺对外周血管阻力的影响.临床麻醉学杂志，1997，13：2.
7.Chapler CK, Cain SM. Blood flow and O2 uptake in dog hindlimb with anemia, norepinephrine and propranolol. J Appl Physiol Respirat Environ Exercise Physiol, 1981, 51：556.
, http://www.100md.com
8.Shepperson NB. Duval N, Langer DZ, et al. Dopamine decreases mesenteric blood flow in the anesthetized dog through stimulation of postsynaptic alpha-2, adrenoreceptors. Eur J Pharmacol, 1982, 81：627.
9.高美.He-Ne Laser对带癌小鼠IL-αmRNA影响.中国临床实验免疫学杂志，1995，4.
10.齐鸣，陈发郁，唐朝枢，等.去甲肾上腺素与脂质过氧化关系的研究.北京医科大学学报，1991，23：452.
(1998年1月15日收稿 同年4月3日修回), 百拇医药(刘珊林1 施冬云2 王如瑶2 成柏华2)
单位：1.上海市上海医科大学生物化学教研室(200032) 2.上海第二医科大学
关键词：半导体激光；脑神经递质；丙二醛
中国激光医学杂志980304Effect of Diode Laser Acupuncture on Neurotransmitter Monoamines
in Brain and Malondialdehyde in Plasma of Rats
Liu Shanlin
Department of Biochemistry, Shanghai Medical University, Shanghai(200032)
, http://www.100md.com
Shi Dongyun, Wang Ruyao, Cheng Baihua
Shanghai Second Medical University, Shanghai
摘要 为探讨低强度激光产生生物效应的机制，采用半导体激光器(波长650 nm，功率10mW，连续可调)，对雄性SD大鼠和自发性高血压大鼠进行颈部“扶突”穴穴位照射，用高效液相色谱电化学检测方法测脑干和尾核中五羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺等单胺类神经递质含量，用TBA荧光法测定血浆中丙二醛(MDA)，同时用氢清除法组织血流仪监测大鼠海马区的脑血流量。结果提示，光照后，海马脑血流量下降，脑干和尾核中单胺类神经递质含量明显下降，而血浆中MDA含量略有上升。揭示激光照射“扶突”穴会引起单胺类神经递质下降。
ABSTRACT
The male SD rats and spontaneous hypertensive rats(SHR) were irradiated on “Futu” acupoints by 650 nm, 10 mW, CW diode laser acupunctrure. The concentration of hydroxytryptamine (5-HT), norepinephrine (NE), and dopamine (DA) in brain stem and caudate nucleus of rats were detected by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Malondialdehyde (MDA) was analyzed with the thiobarbituric (TBA) test by fluorometry. Cerebral blood flow (CBF) in rats hippocampus was detected. The results show: The CBF in rats hippocampus decreased, the content of neurotransmitter monamines in brain stem and caudate nucleus decreased significantly, but MDA in plasma increased slightly. The relation between laser irradiation and free radical concentration has been studying further now.
, 百拇医药
Key words Diode laser, Brain neurotransmitter, Malondiadehyde
激光照射已广泛应用于临床治疗，其中低强度激光照射对慢性炎症的治疗效果已得到肯定，并且实验证明可提高非特异性免疫能力；还发现对心脑血管疾患有一定效果，包括可降低血压，改善心血管功能[1]。但是低强度激光照射所产生的一些生物效应，其机制尚不很清楚。本课题组曾利用高血压大鼠模型，采用半导体激光器对“扶突”、“人中”等穴位进行低强度激光照射，发现有脑血流量减慢、血压下降的效果。为探索产生效应的机制，选用波长650 nm、功率10 mW的半导体激光，对大鼠“扶突”穴照射，并取脑组织中的脑干和尾核，进行神经递质多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和五羟色胺(5-HT)的测定，同时取血浆测定丙二醛(MDA)含量，以了解激光照射是否会引起自由基损伤。通过对测定结果分析，发现低强度激光照射后，神经递质DA、NE和5-HT，都有明显降低，而血液中的丙二醛含量却升高。
, http://www.100md.com
材料和方法
一、动物分组
雄性SD大鼠40只，体重210 g～250 g，随机分为对照组和照射组各20只。高血压大鼠组14只(由上海市高血压研究所提供)。
二、试剂
20%氨基甲酸乙酯(Urethane)，0.1 mol/L HClO4，DA、NE和5-HT标准品(Sigma公司)，硫代巴比妥酸(TBA)，四乙氧基丙烷(TEP，超纯试剂，TOKOYO公司)，NaAC，甲醇。实验所用试剂除注明外均为分析纯，水为重蒸水。
三、仪器
半导体激光器，岛津LC-9A高效液相色谱仪，日立F-3000型荧光分光光度计。
, 百拇医药
四、激光照射
采用650 nm、10 mW、CW持续照射大鼠颈部“扶突”穴位。照射前，各组用20%氨基甲酸乙酯按每公斤体重5 ml剂量麻醉，在海马区钻孔，剥离脑膜，插入铂黑电极，深2 mm，吸入氢气。高血压大鼠组应用氢清除法组织血流测定仪监测海马区血流量，并用尾部测压法测量血压。照射5 min后，重复测定血流量和血压变化。其余二组仅作假手术处理。照射组的激光照射时间也为5 min；二组分别取脑组织和血液待处理。
五、样品处理
脑组织：大鼠断头，在冰浴中取脑组织，脑干和尾核分别称重，以冰冷0.1 mol/L HClO4制成匀浆，在4℃、15 000 g离心30 min，取上清液，在-30℃以下保存待测。取全血1 ml，抗凝，离心，取血浆在-20℃保存待测。
六、测定
, http://www.100md.com
以高效液相色谱电化学检测法测脑组织中的DA、NE和5-HT[2]。流动相：85% 0.15 mol/LNaAC-NaOH缓冲液(含EDTA0.83 mmol/L和CSA 9 mmol/L，PH4.2)，15%甲醇，使用前以0.22 μm滤膜过滤，并脱气，流速1.0 ml/min。电化学工作电压0.7 V，检测灵敏度为5 nA，进样量20 μl。血液MDA测定采用TBA荧光方法。
七、统计学处理
采用STATPAL软件包，用t检验方法处理。
结 果
一、高血压大鼠在激光照射前后，脑血流量和血压都有变化。见表1。表明经“扶突”穴照射，平均脑血流量和平均血压都比照射前有所下降，虽未达到统计学显著性，但已反映出很有意义的倾向。
, http://www.100md.com 二、照射组大鼠脑干和尾核的神经递质含量和血液的MDA含量，与对照组相比，也有变化。表2说明，激光照射“扶突”穴后，脑干和尾核中的单胺类神经递质都明显下降，经统计学处理，差异有显著性。而血浆中的MDA，照射前为4.93 nmol/ml±0.95nmol/ml，照射后为5.28 nmol/ml±1.25nmol/ml，稍有上升，但无统计学意义
表1 波长650 nm半导体激光对高血压大鼠组脑血流量和血压的影响(14只，
±s)Tab.1 Effect of diode laser (650 nm) irradiation on CBF and blood pressure(n=14，
±s), http://www.100md.com
照射前
Before irradiation
照射后
After irradiation
t值
t value
P值
P value
脑血流量CBF(ml*100g-1*min-1)
39.04±23.53
30.5±16.22
, http://www.100md.com
1.118
>0.05
血压BP(kPa)
(mmHg)
14.61±3.89
109.57±29.19
12.17±3.60
91.28±27.04
1.728
>0.05
表2 波长650 nm半导体激光对脑组织神经递质含量的影响(20只,
±s, ng/g), 百拇医药
Tab.2 Effect of diode laser (650 nm) irradiation on the brain neurotransmitters
content(n=20,
±s, ng/g)脑干 Brain stem
尾核 Caudate nucleus
对照组
Controlled
照射组
, http://www.100md.com Irradiated
t值
t value
P值
P value
对照组
Controled
照射组
Irradiated
t值
t value
P值
P value
, 百拇医药
5-HT
254±62
214±42
2.328
<0.05
279±91
183±26
4.434
<0.05
NE
234±43
194±29
3.361
, 百拇医药
<0.05
123±23
104±32
2.102
<0.05
DA
800±56
566±87
9.832
<0.05
1 029±71
972±76
2.389
, 百拇医药
<0.05
(P>0.05)。
讨 论
根据祖国医学理论，治疗高血压或中风，常取穴于手阳明大肠经穴位。“扶突”穴是该经中的穴位，选择“扶突”为主要穴位进行低强度激光照射，发现也有降血压效应；激光照射“人中”穴也有类似现象，说明降血压效应可能与经络有关。在降低血压的同时，还发现血流量也降低，显然血压的变化与血流量改变有关。为了弄清产生效应的机制，测定了与血管收缩有关的单胺类神经递质的含量。发现在激光照射“扶突”穴后，其含量都发生下降的变化。已知NE可兴奋α-受体，后者具有收缩血管的作用，脑血管是α-受体的效应器，所以NE含量下降有助于脑血管扩张，从而使脑血流量下降。已知5-HT能引起冠状动脉收缩[3,4]，实验证明它比苯肾上腺素的作用还要强，并且能增强NE血管紧张素Ⅱ收缩血管的作用，所以5-HT含量下降，显然也有助于心血管的扩张，改善心血管功能[5]。DA在脑组织中含量较高，实验证明，大剂量使用DA，有明显收缩血管的作用[6]。Chapler等[7]和Shepperson等[8]证实，DA主要通过激动外周血管α2-受体，发挥其收缩血管的作用，所以DA含量下降，有助于降低外周血管阻力。
, 百拇医药
根据单胺类神经递质具收缩血管的作用以及其光照后含量发生变化，可以说明，激光照射某些穴位，引起血压和血流量下降的效应与植物神经系统的调节有关。具体是通过单胺类神经递质含量下降来降低交感神经的兴奋性，从而降低血压、改善心血管功能。研究发现，不同的照射功率和时间，对免疫能力会产生正、负相关的效应[9]；功率过大，时间过长，可能产生损伤。所以同时测定了激光照射前后，与脂质过氧化损伤有关的血浆MDA含量的变化，发现MDA稍有升高，虽未达到统计学显著性，但已提醒我们，激光照射也伴有自由基损伤的倾向，必须注意可能带来的副作用。体外实验已证明NE具有抑制脂质过氧化的作用[10]，我们的实验证明，NE、DA和5-HT都具有不同程度的清除自由基的作用，所以单胺类神经递质含量的下降，可能也伴有对自由基清除能力的下降。激光照射引起单胺类神经递质下降与自由基反应的关系，现正在深入研究中。
*国家自然科学基金资助项目
参 考 文 献
, 百拇医药
1.曾真，傅丽萍，黄军饶，等.半导体激光光针降血压及改善心血管功能的即刻疗效.中国激光医学杂志，1997，6：72.
2.Wagner J, Vitali P, Palfreyman MG, et al. Simultaneous determination of 3,4-dihydroxyphenylalanine, 5-hydroxytryptophan, dopamine, 4-hydroxy-3-methoxyphenylalanine, norepinephrine, 3,4-dihydroxy-
phenylacetic acid, homovanillic acid, serotonin, and 5-hydroxyindoleacetic acid in rat cerebrospinal fluid and brain by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. J Neurochem, 1982, 38：1241.
, http://www.100md.com
3.彭悦.针刺治疗冠心病研究概况.中国针灸，1983，(6)：43.
4.周逸平，王晓，方斌，等.心经经脉与相应脏腑相关的研究.针灸临床杂志，1997，13(3)：20.
5.孟竟壁，刘瑞庭，须慧仁，等.针刺对实验性心肌缺血对冠脉血流量的测定.中国针灸，1982，(2)：22.
6.王俊科，孙瑞，盛卓人，等.血液稀释下多巴胺和多巴酚丁胺对外周血管阻力的影响.临床麻醉学杂志，1997，13：2.
7.Chapler CK, Cain SM. Blood flow and O2 uptake in dog hindlimb with anemia, norepinephrine and propranolol. J Appl Physiol Respirat Environ Exercise Physiol, 1981, 51：556.
, http://www.100md.com
8.Shepperson NB. Duval N, Langer DZ, et al. Dopamine decreases mesenteric blood flow in the anesthetized dog through stimulation of postsynaptic alpha-2, adrenoreceptors. Eur J Pharmacol, 1982, 81：627.
9.高美.He-Ne Laser对带癌小鼠IL-αmRNA影响.中国临床实验免疫学杂志，1995，4.
10.齐鸣，陈发郁，唐朝枢，等.去甲肾上腺素与脂质过氧化关系的研究.北京医科大学学报，1991，23：452.
(1998年1月15日收稿 同年4月3日修回), 百拇医药(刘珊林1 施冬云2 王如瑶2 成柏华2)