苯乙酸诱导分化胶质瘤细胞过程中基因表达变化
作者：田宇 陈阳 陈宝琴 赵丛海 田洋
单位：田宇(白求恩医科大学第三临床学院神经外科，长春 130031)；陈阳(天津市石化医院)；陈宝琴(吉林省人民医院干部病房)；赵丛海(白求恩医科大学第三临床学院神经外科，长春 130031)；田洋(吉林省中医中药研究院)
关键词：苯乙酸；胶质瘤；免疫组化
中国老年学杂志000218摘 要 目的 观察诱导分化剂苯乙酸对胶质瘤细胞C6的增殖分化过程中癌基因C-myc，抑癌基因P16的蛋白水平变化。方法 3H-TdR掺入法测细胞增殖率；免疫组化SP法检测C-myc、P16基因蛋白水平的表达。结果 应用苯乙酸后，细胞CPM值降低；C-myc基因胞浆阳性表达下降，P16基因胞浆阳性表达升高。结论 苯乙酸对胶质瘤细胞存在剂量依赖性抑制，作用方式为抑制胞浆中RNA合成。这些作用与苯乙酸降低了C-myc基因对细胞恶性增殖的转录调节作用，增强了抑癌基因P16活性有关。
, 百拇医药
The change of P16、C-myc gene protein expression during differentiation induced by phenylacetate on glioma cell line C6
Tian Yu,Chen Yang,Chen Baoqin et al
(Department of Neurosurgerg,The 3rd Affiliated Hospital of Bethune Medical University,Changchun 130031)
Abstract：Objective To observe the changes of protein expression of C-myc,P16 gene on glioma cell line C6 treated by phenylacetate(PA) in order to find out the mechanism of PA on molecule level.Methods The effect of PA on cell proliferation using 3 H-TdR assay,C-myc and P16 gene protein expression studied by immunohistochemical technique.Results At does ranges 0.625、2.5、5.0 mM,PA revealed a dose-dependent proliferation inhibitory effect.The protein expression of C-myc gene was notably decreased,while P16 gene was increased by PA(0.625&2.5mM).Conclusion PA caused a does-dependent proliferation inhibitory effect,one of the mechanisms may be PA decreased RNA amount directly in cells.All of these connected with C-myc gene protein expression deceased and P16 gene activity increased by PA.
, 百拇医药
Key words Phenylacetate Glioma Immunohistochemial technique
近年来研究表明，苯乙酸(PA)对胶质瘤、乳腺癌、白血病有较强的增殖抑制并有促进其向分化程度高的方向转化的作用〔1～3〕。这种对人体无毒性作用的诱导分化剂，目前在国外已进入临床实验阶段，但分子机制方面，国内外少有研究。本实验在蛋白水平观察了与细胞周期调控有密切关系的P16基因及调节细胞恶性增殖转录过程的C-myc基因的改变，从分子水平上进一步探讨PA的作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 培养基：IMDM，美国产品；小牛血清：长春生物制品所生产蛋白酶：日本产品；苯乙酸：美国Fluka公司产品。兔抗鼠P16多抗(NH46)、C-myc(C-33)鼠抗鼠抗体，美国Santa Cruz公司产品。过氧化酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(SP9000)，北京中山公司产品。
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1.2 细胞培养 C6细胞株购自美国TACC(Pockvi，MD)，接种于25 cm2培养瓶中单层培养。培养基含10%热灭活小牛血清(BCS)，加入NaHCO3 2 g/L，青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/L，置于37 ℃,5%CO2恒温恒湿培养箱中。
1.3 细胞增殖 消化培养瓶中处于对数生长期的C6细胞，制成5×104细胞/ml的细胞悬液，接种于24孔培养板中，5×104细胞/孔。24 h后分别加入NaPA 0、0.625、1.25、2.5、5.0 mmol/L。收集细胞8 h前，每孔加入1.25 μci〔3H〕-TdR(中国原子能研究所)测CPM值。
1.4 免疫组织化学技术 将上述培养液涂片，室温干燥丙酮固定，染色前微波处理，H2O2甲醇阻断，山羊血清封闭非特异反应，滴加一抗，浓度为1∶50，4 ℃过夜，滴加生物素化二抗。加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木素复染。抗体制备按SP试剂盒说明书。阴性对照不加一抗，次日加二抗和SP试剂，DAB显色。PBS代替一抗作空白对照。
, 百拇医药
图像分析用光标仪和数字化仪测量阳性产物灰度值，Y=0.299R+0.587G+0.114B，(R为红色，G为绿色，B为黑色)，灰度值(Y值)越小，表示阳性标记程度越明显。
2 结 果
2.1 用药后细胞增殖抑制 结果显示苯乙酸对C6细胞的增殖存在剂量依赖性抑制。细胞DNA合成减少与NaPA剂量呈显著正相关关系。
表1 PA对胶质瘤细胞C6、C-myc，P16基因表达的影响(
±s) PA浓度(mmol/L)
C-myc
P16
0
, 百拇医药
130.5±2.81)2)
167.1±6.21)2)
0.625
137.7±2.73)
156.9±2.43)
2.5
152.8±3.1
149.2±1.5
表中数据为细胞灰度值(Y值)，1)0.625组与对照组比较P<0.05，2)、3)2.5组分别与对照组、0.625组比较，P<0.01
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2.2 C-myc、P16基因蛋白表达 经浓度为0.625，2.5mmol/L苯乙酸处理48 h后，C6细胞C-myc胞浆表达明显减弱，P16胞浆表达明显增强。阳性细胞均表现为胞浆黄褐色染色。结果见表1及照片A、B、C、D。
照片A (PA0.625mmol/L组)P16基因表达
照片B (PA2.5mmol/L组)P16基因表达
照片C (对照组)C-myc基因表达
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照片D (PA2.5mmol/L组)C-myc基因表达
3 讨 论
已知肿瘤细胞的增殖能力与肿瘤细胞的分化程度密切相关，即分化程度差的细胞往往比分化程度好的细胞增殖活跃。同时也发现肿瘤细胞并不比正常细胞增殖周期循环速度快，它是靠细胞数量的增长而使肿瘤迅速生长。因此，要取代常规方法来抑制恶性肿瘤生长，可通过减少细胞增殖，降低肿瘤细胞恶性度等方式来实现。本实验在检测NaPA对细胞增殖抑制时，观察到NaPA对C6细胞的增殖抑制作用随剂量增加而明显增强。通过〔3H〕-TdR掺入法检测肿瘤细胞DNA合成总量，证实了NaPA可减少胶质瘤C6细胞的增殖。
C-myc基因是最早发现的人类肿瘤基因，是功能甚多的核内癌基因，可引起细胞恶性增殖，也可与凋亡启动子结合，诱导细胞凋亡。它的二重作用由外来信号所决定。在胶质瘤细胞系的研究中发现〔7〕，培养的恶性细胞从G0/G1期进入到G2+M期时，C-myc蛋白表达增强近2倍，因此在体外细胞系中C-myc基因的主要作用是促进细胞恶性增殖。进一步，Eiler〔5〕应用甾类激素-myc嵌合体技术直接证实了C-myc对细胞RNA转录调节作用。与Dovit〔2〕报道一致，本实验PA抑制C6细胞增殖过程中，细胞胞浆C-myc蛋白表达下降。由此可见，PA抑制了C6细胞的恶性增殖和C-myc基因的转录调节作用。转录过程是以DNA为模板，形成mRNA的过程。转录过程被抑制，使肿瘤细胞中RNA的合成减少。癌基因C-myc蛋白表达受抑制，降低了C6细胞恶性度。
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P16基因是新发现的唯一直接作用于细胞周期的抑癌基因，是细胞周期的固有成份，是G1期重要的调控因子，具有阻止损伤的DNA进行修复，促进细胞凋亡的功能。在胶质瘤中，P16突变、缺失高达82%，说明P16基因在胶质瘤中起重要作用。Hama〔6〕在实验证实，将AxAC-h P16基因转染至不含P16基因的胶质瘤U251MG细胞后，细胞增殖被抑制于G1期。这与国内报道〔4〕应用PA后，细胞增殖阻抑于G1期的结果相符。本实验中P16蛋白表达增高，PA激活了P16的抗癌活性，促进C6细胞向凋亡方向转化。
本研究为国家自然科学基金(编号39900152)及吉林省科委(编号970567-4)资助项目
作者简介：田宇，男，34岁，主治医师，从事脑胶质瘤诱导分泌治疗的分子机制
参考文献
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1，Alain T，Micheal C，William F et al.A phase I and pharmacokinetic study of intravenous phenylacetate in patients with cancer.Cancer Res，1994；54(18)：1690
2，Dvorit S，Sonsoles S.Lin TS.Phenylacetate:A novel nontoxic inducer of tumor cell differentiation.Cancer Res，1992；52(1)：1988
3，田 宇，陈宝琴，王校复 et al.苯乙酸对胶质瘤细胞C6的诱导分化作用.中华神经外科杂志，1999；15(6)：390
4，田 宇，陈宝琴，王校复 et al.苯乙酸对胶质瘤细胞C6 DNA合成的阻抑作用.白求恩医科大学学报，1999；25(1)：32
, 百拇医药
5，Eilers M，Didler P，Kelth Y et al.Chimaeras of Myc oncoprotein and steroid recptors cause hormone-dependent transformation of cells.Nature，1989；340(6)：66
6，Hama S，Heike Y,Takahashi M et al.Adenovirus-mediated p16 gene transfer drug-induced cell death through G1 arrest in human glioma cell.Int J Cancer，1998；77(1)：47
7，李 峰，浦佩玉，王春艳 et al.人脑胶质瘤C-myc基因的表达与其增殖活性的关系.肿瘤，1998；18(1)：32
收稿日期：1999-06-15
修回日期：1999-12-15, http://www.100md.com
单位：田宇(白求恩医科大学第三临床学院神经外科，长春 130031)；陈阳(天津市石化医院)；陈宝琴(吉林省人民医院干部病房)；赵丛海(白求恩医科大学第三临床学院神经外科，长春 130031)；田洋(吉林省中医中药研究院)
关键词：苯乙酸；胶质瘤；免疫组化
中国老年学杂志000218摘 要 目的 观察诱导分化剂苯乙酸对胶质瘤细胞C6的增殖分化过程中癌基因C-myc，抑癌基因P16的蛋白水平变化。方法 3H-TdR掺入法测细胞增殖率；免疫组化SP法检测C-myc、P16基因蛋白水平的表达。结果 应用苯乙酸后，细胞CPM值降低；C-myc基因胞浆阳性表达下降，P16基因胞浆阳性表达升高。结论 苯乙酸对胶质瘤细胞存在剂量依赖性抑制，作用方式为抑制胞浆中RNA合成。这些作用与苯乙酸降低了C-myc基因对细胞恶性增殖的转录调节作用，增强了抑癌基因P16活性有关。
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The change of P16、C-myc gene protein expression during differentiation induced by phenylacetate on glioma cell line C6
Tian Yu,Chen Yang,Chen Baoqin et al
(Department of Neurosurgerg,The 3rd Affiliated Hospital of Bethune Medical University,Changchun 130031)
Abstract：Objective To observe the changes of protein expression of C-myc,P16 gene on glioma cell line C6 treated by phenylacetate(PA) in order to find out the mechanism of PA on molecule level.Methods The effect of PA on cell proliferation using 3 H-TdR assay,C-myc and P16 gene protein expression studied by immunohistochemical technique.Results At does ranges 0.625、2.5、5.0 mM,PA revealed a dose-dependent proliferation inhibitory effect.The protein expression of C-myc gene was notably decreased,while P16 gene was increased by PA(0.625&2.5mM).Conclusion PA caused a does-dependent proliferation inhibitory effect,one of the mechanisms may be PA decreased RNA amount directly in cells.All of these connected with C-myc gene protein expression deceased and P16 gene activity increased by PA.
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Key words Phenylacetate Glioma Immunohistochemial technique
近年来研究表明，苯乙酸(PA)对胶质瘤、乳腺癌、白血病有较强的增殖抑制并有促进其向分化程度高的方向转化的作用〔1～3〕。这种对人体无毒性作用的诱导分化剂，目前在国外已进入临床实验阶段，但分子机制方面，国内外少有研究。本实验在蛋白水平观察了与细胞周期调控有密切关系的P16基因及调节细胞恶性增殖转录过程的C-myc基因的改变，从分子水平上进一步探讨PA的作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 培养基：IMDM，美国产品；小牛血清：长春生物制品所生产蛋白酶：日本产品；苯乙酸：美国Fluka公司产品。兔抗鼠P16多抗(NH46)、C-myc(C-33)鼠抗鼠抗体，美国Santa Cruz公司产品。过氧化酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(SP9000)，北京中山公司产品。
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1.2 细胞培养 C6细胞株购自美国TACC(Pockvi，MD)，接种于25 cm2培养瓶中单层培养。培养基含10%热灭活小牛血清(BCS)，加入NaHCO3 2 g/L，青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/L，置于37 ℃,5%CO2恒温恒湿培养箱中。
1.3 细胞增殖 消化培养瓶中处于对数生长期的C6细胞，制成5×104细胞/ml的细胞悬液，接种于24孔培养板中，5×104细胞/孔。24 h后分别加入NaPA 0、0.625、1.25、2.5、5.0 mmol/L。收集细胞8 h前，每孔加入1.25 μci〔3H〕-TdR(中国原子能研究所)测CPM值。
1.4 免疫组织化学技术 将上述培养液涂片，室温干燥丙酮固定，染色前微波处理，H2O2甲醇阻断，山羊血清封闭非特异反应，滴加一抗，浓度为1∶50，4 ℃过夜，滴加生物素化二抗。加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木素复染。抗体制备按SP试剂盒说明书。阴性对照不加一抗，次日加二抗和SP试剂，DAB显色。PBS代替一抗作空白对照。
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图像分析用光标仪和数字化仪测量阳性产物灰度值，Y=0.299R+0.587G+0.114B，(R为红色，G为绿色，B为黑色)，灰度值(Y值)越小，表示阳性标记程度越明显。
2 结 果
2.1 用药后细胞增殖抑制 结果显示苯乙酸对C6细胞的增殖存在剂量依赖性抑制。细胞DNA合成减少与NaPA剂量呈显著正相关关系。
表1 PA对胶质瘤细胞C6、C-myc，P16基因表达的影响(
±s) PA浓度(mmol/L)C-myc
P16
0
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130.5±2.81)2)
167.1±6.21)2)
0.625
137.7±2.73)
156.9±2.43)
2.5
152.8±3.1
149.2±1.5
表中数据为细胞灰度值(Y值)，1)0.625组与对照组比较P<0.05，2)、3)2.5组分别与对照组、0.625组比较，P<0.01
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2.2 C-myc、P16基因蛋白表达 经浓度为0.625，2.5mmol/L苯乙酸处理48 h后，C6细胞C-myc胞浆表达明显减弱，P16胞浆表达明显增强。阳性细胞均表现为胞浆黄褐色染色。结果见表1及照片A、B、C、D。
照片A (PA0.625mmol/L组)P16基因表达
照片B (PA2.5mmol/L组)P16基因表达
照片C (对照组)C-myc基因表达
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照片D (PA2.5mmol/L组)C-myc基因表达
3 讨 论
已知肿瘤细胞的增殖能力与肿瘤细胞的分化程度密切相关，即分化程度差的细胞往往比分化程度好的细胞增殖活跃。同时也发现肿瘤细胞并不比正常细胞增殖周期循环速度快，它是靠细胞数量的增长而使肿瘤迅速生长。因此，要取代常规方法来抑制恶性肿瘤生长，可通过减少细胞增殖，降低肿瘤细胞恶性度等方式来实现。本实验在检测NaPA对细胞增殖抑制时，观察到NaPA对C6细胞的增殖抑制作用随剂量增加而明显增强。通过〔3H〕-TdR掺入法检测肿瘤细胞DNA合成总量，证实了NaPA可减少胶质瘤C6细胞的增殖。
C-myc基因是最早发现的人类肿瘤基因，是功能甚多的核内癌基因，可引起细胞恶性增殖，也可与凋亡启动子结合，诱导细胞凋亡。它的二重作用由外来信号所决定。在胶质瘤细胞系的研究中发现〔7〕，培养的恶性细胞从G0/G1期进入到G2+M期时，C-myc蛋白表达增强近2倍，因此在体外细胞系中C-myc基因的主要作用是促进细胞恶性增殖。进一步，Eiler〔5〕应用甾类激素-myc嵌合体技术直接证实了C-myc对细胞RNA转录调节作用。与Dovit〔2〕报道一致，本实验PA抑制C6细胞增殖过程中，细胞胞浆C-myc蛋白表达下降。由此可见，PA抑制了C6细胞的恶性增殖和C-myc基因的转录调节作用。转录过程是以DNA为模板，形成mRNA的过程。转录过程被抑制，使肿瘤细胞中RNA的合成减少。癌基因C-myc蛋白表达受抑制，降低了C6细胞恶性度。
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P16基因是新发现的唯一直接作用于细胞周期的抑癌基因，是细胞周期的固有成份，是G1期重要的调控因子，具有阻止损伤的DNA进行修复，促进细胞凋亡的功能。在胶质瘤中，P16突变、缺失高达82%，说明P16基因在胶质瘤中起重要作用。Hama〔6〕在实验证实，将AxAC-h P16基因转染至不含P16基因的胶质瘤U251MG细胞后，细胞增殖被抑制于G1期。这与国内报道〔4〕应用PA后，细胞增殖阻抑于G1期的结果相符。本实验中P16蛋白表达增高，PA激活了P16的抗癌活性，促进C6细胞向凋亡方向转化。
本研究为国家自然科学基金(编号39900152)及吉林省科委(编号970567-4)资助项目
作者简介：田宇，男，34岁，主治医师，从事脑胶质瘤诱导分泌治疗的分子机制
参考文献
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1，Alain T，Micheal C，William F et al.A phase I and pharmacokinetic study of intravenous phenylacetate in patients with cancer.Cancer Res，1994；54(18)：1690
2，Dvorit S，Sonsoles S.Lin TS.Phenylacetate:A novel nontoxic inducer of tumor cell differentiation.Cancer Res，1992；52(1)：1988
3，田 宇，陈宝琴，王校复 et al.苯乙酸对胶质瘤细胞C6的诱导分化作用.中华神经外科杂志，1999；15(6)：390
4，田 宇，陈宝琴，王校复 et al.苯乙酸对胶质瘤细胞C6 DNA合成的阻抑作用.白求恩医科大学学报，1999；25(1)：32
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5，Eilers M，Didler P，Kelth Y et al.Chimaeras of Myc oncoprotein and steroid recptors cause hormone-dependent transformation of cells.Nature，1989；340(6)：66
6，Hama S，Heike Y,Takahashi M et al.Adenovirus-mediated p16 gene transfer drug-induced cell death through G1 arrest in human glioma cell.Int J Cancer，1998；77(1)：47
7，李 峰，浦佩玉，王春艳 et al.人脑胶质瘤C-myc基因的表达与其增殖活性的关系.肿瘤，1998；18(1)：32
收稿日期：1999-06-15
修回日期：1999-12-15, http://www.100md.com